Astrositlerin karmaşık morfolojilerini nasıl geliştirdiklerini ve kurduklarını anlamak, beynin nasıl geliştiğini ve çalıştığını anlamak için çok önemlidir. Bu protokol, beyin dokusundaki astrosit morfolojisinin temel yönlerinin nasıl analiz edileceğini açıklar. Bu protokol, kalın doku kesitlerinde astrosit bölgesi hacmini ölçmek için özel bir kod kullanır.
Bu strateji, komşu astrositler arasındaki bölge çakışması miktarını ölçmek için de uygulanabilir. Bu protokolü astrositlerin genetik manipülasyonu ile birleştirerek, araştırmacılar astrosit gelişiminde ve astrosit-astrosit etkileşiminde spesifik proteinlerin ve yolakların rolünü doğrudan araştırabilirler Başlamak için, 50 mililitrelik bir tüpe 1 mililitre% 10 Triton X ekleyerek ve tüpü TBS ile 50 mililitreye doldurarak yeni bir TBST çözeltisi hazırlayın. 15 mililitrelik tüp.
Ardından, farklı sütunlardaki farklı çözeltilerde farklı sıralara farklı numuneler yerleştirmek için 24 delikli bir plakayı etiketleyin, ardından yıkama 1, 2 yıkama ve yıkama 3 olarak etiketlenmiş ilk üç sütuna bir mililitre TBST ekleyin ve dördüncü sütuna 1 mililitre blokaj çözeltisi ekleyin. 5,75 inçlik bir Pasteur pipetinin ucunu bir Bunsen brülörü kullanarak küçük bir kancada eriterek bir cam toplama hazırlayın, ardından doku bölümlerini 12 delikli plakadan 24 delikli plakanın yıkama 1 sütununa aktarın, ardından bölümleri yıkama 1, 2'de her biri 10 dakika boyunca yıkayın, ve bölümleri bir kuyudan diğerine aktarmak için cam toplama kullanarak 3 kuyucuk, ardından bölümleri blokaj çözeltisinde bir saat boyunca inkübe edin. Antikoru antikor çözeltisine ekleyerek q mililitre birincil antikor çözeltisi hazırlayın, ardından kısaca vorteks yapın ve 4 santigrat derecede 4.000 kez g'ye eşit veya daha büyük 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
Daha sonra, sallanırken bölümleri 2 ila 3 gece boyunca 4 santigrat derecede primer antikorda inkübe edin. Birincil antikor inkübasyonundan sonra, yıkama kuyularından gün-1 TBST'yi aspire edin, daha sonra her yıkama kuyusuna 1 mililitre yeni TBST ekleyin ve bölümleri ilk yıkama kuyusuna taşıyın. Daha sonra, sekonder antikordaki bölümleri oda sıcaklığında 3 saat boyunca inkübe edin.
İkincil antikor inkübasyonundan sonra, gün-2 TBST'yi yıkama kuyularından aspire edin, ardından her yıkama kuyusuna 1 mililitre yeni TBST ekleyin ve bölümleri ilk yıkama kuyusuna taşıyın. Son yıkama sırasında, montaj ortamını 4 santigrat dereceden çıkarın ve oda sıcaklığına ısınmasına izin verin, ardından 2'ye 1 TBS ve deiyonize su karışımı hazırlayın ve bir Petri kabına ekleyin. Daha sonra, yüzeye 800 mikrolitre 2'ye 1 TBS karışımı ve deiyonize su ekleyerek bir mikroskop slaytı hazırlayın.
Bölümleri yıkama 3 kuyusundan Petri kabına aktarın, daha sonra ince bir boya fırçası kullanarak, bölümleri Petri kabından slayttaki sıvıya birer birer aktarın. Ardından, bölümleri boya fırçasını kullanarak slaytta düz olacak şekilde dikkatlice düzenleyin. Slayttaki fazla sıvıyı bir P-1000 pipetle dikkatlice çıkarın ve ardından vakum aspirasyonu uygulayın.
Slayttan tüm fazla sıvı çıkarıldıktan sonra, her bölüme hemen 1 damla montaj malzemesi eklemek için bir transfer pipeti kullanın ve yavaşça kızağın üzerine bir kapak kayması yerleştirin. Montaj ortamının birkaç dakika yayılmasına izin verin ve ardından kapağın altından çıkan fazla montaj ortamını vakum aspirasyonu ile çıkarın. Daha sonra, kapak kaymasının dört kenarını da şeffaf oje ile kapatın.
Slaytları oda sıcaklığında 30 dakika kurumaya bırakın ve ardından 4 santigrat derecede düz bir şekilde saklayın. 10x hedefi kullanarak, görüntüleme için tek tek hücreleri bulun ve deneyle ilgili belirli beyin bölgesini veya alt bölgesini not edin, ardından odak düğmesini kullanarak, tüm astrositin bölüm içinde bulunup bulunmadığını belirleyin. Daha sonra, daha yüksek büyütmeli bir yağ hedefine geçin ve hücreyi odaklayın.
Göz merceğinden bakarken, hücrenin üstünden altına doğru hareket etmek için odak düğmesini kullanın, ardından tüm hücrenin bölüm içinde bulunduğundan emin olmak için hücreyi görsel olarak inceleyin. Konfokal mikroskoplarla ilişkili yakalama yazılımını kullanarak, uygun bir sinyal-gürültü oranı ve ayrıntı seviyesi elde etmek için edinme parametrelerini ayarlayın, ardından 40x hedefi için 2x yakınlaştırma kullanın ve 60x veya 63x hedef kullanıyorsanız yakınlaştırma kullanmayın. Z-yığınının üst ve alt sınırlarını 0,5 mikrometrelik bir adım boyutuyla ayarlayın ve tüm astrositin hücrenin herhangi bir floresan etiketlemesi olmadan ilk ve son görüntülerle yakalanmasını sağlayın.
Analize başlamadan önce, dosyayı XT klasörünün rtmatlab alt klasörüne yapıştırarak dışbükey gövde uzantısı dosyası XtspotsConvexHull'u yükleyin. Imaris Dosya Dönüştürücüsü'nü kullanarak görüntüleri IMS formatına dönüştürün. Ardından, görüntü analiz yazılımında bir görüntü dosyası açın ve hücrenin dahil etme kriterlerini karşıladığından emin olmak için görüntüyü 3B modunda görüntülemek için 3B Görünüm düğmesini seçin.
Bir yüzey oluşturmak için mavi Yeni Yüzeyler Ekle simgesini tıklayın, ardından yüzey oluşturma aracının boyutunun altındaki kutulara boyutlar girerek veya sarı kutunun kenarlarını sürükleyerek hücrenin etrafında ilgi çekici bir bölge oluşturun. Ardından, sarı çubuğu sürükleyerek veya kutuya değerler girerek Eşik Mutlak Yoğunluğunu ayarlayın, böylece gri yüzey hücre sınırının ötesine geçmeden hücre sinyalinin mümkün olduğunca çoğunu doldurur. Daha sonra, yüzeyi oluşturmayı bitirmek için yeşil oka tıklayın.
Yeni oluşturulan yüzeyi dikkatlice inceleyin ve hücrenin parçası olmayan yüzey parçalarını seçerek silin, ardından Kalem Düzenleme aracına ve ardından Sil seçeneğine tıklayın. Kalan yüzey parçalarını birleştirmek için, tümünü seçmek için Huni Filtresi simgesine tıklayın, ardından Kalem Düzenle simgesine tıklayın ve Birleştir seçeneğini belirleyin. Turuncu Yeni Noktalar Ekle simgesine tıklayın ve açılır listeden doğru kaynak kanalı seçin ve ardından kutuya tahmini XY çap değeri 0,400 mikrometre girin.
Ardından, noktaları oluşturmayı tamamlamak için yeşil oka tıklayın, ardından noktaları yeniden seçin. Filtre simgesini tıklatın ve açılır listeden analiz edilen yüzey X yüzeylerinin bulunduğu Yüzeylere En Kısa Mesafe X Yüzeyleri'ni seçerek hem alt eşik hem de üst eşik güç düğmelerinin yeşil olmasını sağlayın. Ardından, alt eşik kutusuna minimum eksi 1,0 mikrometre mesafe ve üst eşik kutusuna maksimum 0,1 mikrometre mesafe girin, ardından yeni oluşturulan noktaların yazılım penceresinin sol üst panelinde seçildiğinden emin olmak için Bölümü Yeni Noktalara Çoğalt düğmesine tıklayın.
Daha sonra, Dişli Aletleri simgesine tıklayın ve ardından Dışbükey Gövde eklentisine yalnızca bir kez tıklayın ve MATLAB penceresinin görünmesini bekleyin ve ardından 3B görünümde sağlam bir gövdeyle sonuçlanan kayboldu. Sol üst panelde, X Noktalarının Dışbükey Gövdesi, X Seçimlerinin Yeni Oluşturulan Noktalar olduğu En Kısa Mesafe seçildiğinden emin olun ve ardından seçmek için gövdeye tıklayın. Ardından, Grafik İstatistikleri simgesine tıklayın.
Seçim sekmesinde, üstteki açılır listeden Belirli Değerler'in seçildiğinden emin olun ve ardından alt açılır listeden Ses Düzeyi'ni seçin, ardından gövdenin ses düzeyini kaydedin ve bir sonraki görüntüye geçerek dosyayı kaydedin. Astrosit bölgesi hacmi, membran hedefli kırmızı floresan proteinini ifade eden astrositlerde ölçüldü. Astrositle zenginleştirilmiş hücre adezyon molekülü hepaCAM'in yıkılması, astrosit bölgesi hacmini önemli ölçüde azaltır.
Çift işaretleyicili mozaik analizi, vahşi tip astrositlerin kırmızı bir floresan proteinini ve hepaCam nakavt astrositlerinin yeşil bir floresan proteinini ifade ettiği fareler üretmek için kullanıldı. Komşu kırmızı ve yeşil floresan protein astrosit çiftleri arasındaki bölge örtüşme yüzdesi hesaplandı. HepaCAM ve yeşil astrositlerin genetik modifikasyonuna sahip fareler, sadece vahşi tip astrosit çiftlerine kıyasla, kırmızı vahşi tip komşularıyla bölge örtüşme hacminin önemli ölçüde arttığını gösterdi.
Bu sonuç, hepaCAM'in normal astrosit bölgesi hacmi ve astrosit döşemesi için gerekli olduğunu göstermektedir. Hücrenin dahil etme kriterlerini karşıladığından emin olmak çok önemlidir. Tamamlanmamış bir hücre daha küçük bir bölge hacmine sahip olacak ve genel sonuçlarınızı ve sonuçlarınızı etkileyebilir.
