Bu yöntem, hastalık ve sabit durumlar sırasında sinaps astrosit nöronal etkileşimlerin değerlendirilmesi için çok ince astrosit süreçlerinin görselleştirilmesikolaylaştırmak için kullanılabilir. Bu teknik, herhangi bir fare modelinde, hücre popülasyonunda veya beyin bölgesinde de uygulanabilir. Uygun bir direnç ile keskin bir elektrot hazırlamak için, bir mikropipet puller bir filament ile borosilikat cam tek namlulu elektrot çekin.
Çekilen elektrotları, tozun uçlara girmesini önlemek için kapalı bir kapta saklayın ve uçların kırılmasını önlemek için elektrotları kutunun altından yüksek tutun. Bir elektrotu lucifer sarı boya çözeltisi ile doldurmak için, ucu aşağıya bakacak şekilde dikey konuma bir elektrot yerleştirin ve elektrotun arkasına bir ila iki mikrolitre lucifer sarı çözeltisi pipeti yerleştirin. Çözeltinin kılcal hareket le uca hareket etmesi için 5 ila 10 dakika bekleyin ve elektrotun içindeki berrak sarı ile temas eden elektrot tutucunun gümüş teli ile manipülatöre bağlı bir elektrot tutucuya bağlı elektrot tutucuda doldurulmuş elektrotun emniyetini hafifçe emniyete alın.
Boya ejeksiyon testi için, hafifçe sabit bir beyin dilimini oda sıcaklığında 0,1 molar PBS ile dolu cam bir alt tabağa yerleştirin ve dilimi naylon telli platin bir arp ile yerinde tutun. Elektrodu bir voltaj kaynağına bağlayın ve zemin elektrodu beyin dilimini içeren banyoya yerleştirin. Konfokal mikroskobun amacını beyin bölgesine taşıyın ve elektrodu 10X su daldırma merceği kullanarak çözeltiye indirin ve elektrodu görüş alanının merkezine taşıyın.
Parlak alan aydınlatması altında, elektrotun berrak ve enkaz veya kabarcık olmadan görünmesini sağlamak için elektrodu 40X su daldırma lensi ile dikkatle inceleyin. 488 nanometrelazer ile confocal lazer tarama mikroskobu geçin. Boya ejeksiyonu test etmek için uyarıcıyı 12 voltta açın.
Elektrotun ucu etrafında büyük bir floresan boya bulutu görülmelidir. Daha sonra, parlak alan altında yavaşça dilim doğru elektrot indirin, yüzeyin hemen üzerinde durarak. İontoforez ile ilgi bir astrosit doldurmak için, dilim yüzeyinin altında yaklaşık 10 mikrometre çapında, uzatılmış oval şekilli somata ile astrositleri tanımlamak için kızılötesi diferansiyel girişim kontrast kullanın.
Bu hipokampusun stratum radyonu. Dokuda ilerlerken kan damarlarını, nöronları, astrositleri ve diğer hücre tiplerini görebiliriz. Bir astrosit seçildikten sonra, hücreyi görüş alanının merkezine taşıyın ve elektrot ucunu yavaşça dilime indirin, elektrot hücre gövdesi ile aynı düzlükte olana kadar dokuda gezinin.
Astrositin hücre gövdesi açıkça görülebildiğinde ve ana hatlarıyla belirtildiğinde, elektrodu yavaşça ileri doğru ilerletin, ucu hücrenin soma'sını çökene kadar elektrot hareket ettirir. Elektrot soma içinde olup olmadığını not etmek için hedefin odak yavaş yavaş yukarı ve aşağı hareket ettirin. Elektrot ucu hücrenin içine girdikten sonra, uyarıcıyı 0,5 ila 1 volt avecürün leterek sürekli olarak hücreye atmasını önele.
Confocal mikroskobu kullanarak hücre filmini izleyin, hücrenin ayrıntılarını görselleştirmek ve elektrotun ucunun gerektiğinde hücre içinde görünür olduğundan emin olmak için dijital yakınlaştırmayı artırın. Voltajı kapatmadan ve elektrot ucunu hücreden yavaşça çekmeden önce ince dallar ve işlemler tanımlanmış görünene kadar yaklaşık 15 dakika bekleyin. Dolu hücreyi görüntülemek için, 40X hedefi altında daha ince dalların ve işlemlerin tanımlandıktan emin olmak için konfokal mikroskoptaki ayarı ayarlamadan önce hücrenin orijinal formuna dönmesi için 15 ila 20 dakika bekleyin.
0,3 mikrometre adım boyutunda bir Z destesi ayarlayın, hücreden sinyal gelene kadar görüntüleme sırasında hedefi hareket ettirin ve bu adımı üst olarak ayarlayın. Daha sonra hiçbir sinyal olana kadar hücre üzerinden odaklanarak, hedef aşağı taşıyın ve alt olarak bu adımı ayarlayın. Görüntüleme tamamlandıktan sonra, boya ejeksiyonu için elektrot kontrol edin.
Büyük bir boyama bulutu görünürse, elektrot bir sonraki dilim için kullanılabilir. Aksi takdirde, elektrot değiştirin. Maksimum yoğunluklu projeksiyon oluşturarak, bir astrositin etki alanında yapısının ayrıntılı bir görünümü gözlemlenebilir.
Astrosite dört X kadir zoom bir ana dal, birkaç ikincil dalları niçin maksimum yoğunluklu projeksiyon ve çevredeki dalve broşürlerin dağılımını ortaya koymaktadır. Burada, bir CA1 astrositorijinal görüntü gösterilir. Astrosit tarafından kaplanmış hücre gövdesi, ana dalları, süreçleri ve bölge hacmi bu sonraki görüntülerde yeniden oluşturulur.
Rekonstrüksiyonlar oluşturulduktan sonra soma, tüm hücre ve bölgenin hacimleri ölçüldü. Ve büyük şubelerin sayısı sayıldı. Ara astrosit filamentleri etiketleyen sitosiskelet proteini olarak hücre soma, ana dallar ve bazı ikincil astrosit dallarında ifade edilir, ancak daha ince dal ve süreçlerde ifade edilmez.
Bu temsili analizde glial fibrillary asidik protein ile etiketlenen primer branş sayısında ve lucifer sarısı ile görselleştirilebilenlerde anlamlı bir fark saptanmadı. Ayrıca, glial fibrillary asidik protein ile etiketlenen astrositin hücre alanı ve hacmi, glial fibrillary asidik proteinin büyük dalları nitretifite için güvenilir bir belirteç olduğunu, ancak hücrenin genel alanını veya hacmini belirlemek için yararlı olmadığını göstererek, lucifer sarısı ile görselleştirilen alan ve hacimden önemli ölçüde daha küçüktü. Elektrot ucundan salınan boya miktarı, sürekli bir boya akışının atılabilmesi için yeterince yüksek olması gereken elektrot direncine bağlıdır.
İleride yapılan çalışmalar, astrosit yapısının farklı bileşenlerini süper çözünürlüklü ışık mikroskobu veya astrosit yapısı içindeki spesifik proteinlerin ekspresyonunun immünohistokimyasal analizi ile inceleyebilir.
