הבנת האופן שבו אסטרוציטים מפתחים ומבססים את המורפולוגיה המורכבת שלהם חיונית להבנת האופן שבו המוח מתפתח ומתפקד. פרוטוקול זה מתאר כיצד לנתח היבטים מרכזיים של מורפולוגיה של אסטרוציטים ברקמת המוח. פרוטוקול זה משתמש בקוד מותאם אישית למדידת נפח שטח האסטרוציטים בקטעי רקמה עבים.
ניתן ליישם אסטרטגיה זו גם כדי למדוד את כמות החפיפה בשטח בין אסטרוציטים שכנים. על ידי שילוב פרוטוקול זה עם מניפולציה גנטית של אסטרוציטים, חוקרים יכולים לחקור ישירות את תפקידם של חלבונים ומסלולים ספציפיים בהתפתחות אסטרוציטים ובאינטראקציה בין אסטרוציטים לאסטרוציטים כדי להתחיל, להכין פתרון חדש של TBST על ידי הוספת 1 מיליליטר של 10%Triton X לצינור 50 מיליליטר ומילוי הצינור ל -50 מיליליטר עם TBS. הכינו 2 מיליליטרים של פתרונות חסימה ונוגדנים לכל מוח על ידי שילוב סרום עיזים ושחפת ב- TBST צינור 15 מיליליטר.
לאחר מכן, סמן לוחית של 24 בארות כדי למקם דוגמאות שונות בשורות שונות בפתרונות שונים בעמודות שונות, ולאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של TBST לשלוש העמודות הראשונות המסומנות ככביסה 1, שטיפה 2 ושטיפה 3, והוסף 1 מיליליטר של תמיסת חסימה לעמודה הרביעית. מכינים קטיף זכוכית על ידי המסת הקצה של פיפטת פסטר בגודל 5.75 אינץ' לתוך וו קטן באמצעות מבער בונזן, ואז מעבירים קטעי רקמות מהצלחת בת 12 הבארות לתוך עמוד הכביסה 1 של הצלחת בת 24 הבארות באמצעות הפיק, ואז שוטפים את החלקים במשך 10 דקות כל אחד בכביסה 1, 2, ו-3 בארות על ידי שימוש באיסוף הזכוכית כדי להעביר את החלקים מבאר אחת לאחרת, ולאחר מכן דגירה של המקטעים למשך שעה אחת בתמיסת החסימה. הכן q מיליליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית על ידי הוספת הנוגדן לתמיסת הנוגדן, ולאחר מכן מערבולת לזמן קצר וצנטריפוגה במשך 5 דקות בסכום גדול או שווה ל- 4, 000 פעמים גרם ב 4 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, דגירה את החלקים בנוגדן ראשוני במשך 2 עד 3 לילות ב 4 מעלות צלזיוס תוך כדי רעד. לאחר דגירה ראשונית של נוגדנים, שאפו את ה-TBST של היום-1 מבארות הכביסה, ואז הוסיפו 1 מיליליטר של TBST חדש לכל באר שטיפה והעבירו את החלקים לבאר הכביסה הראשונה. לאחר מכן, דגירה של מקטעים בנוגדן משני במשך 3 שעות בטמפרטורת החדר.
לאחר דגירה משנית של נוגדנים, שאפו את ה-TBST של היום-2 מבארות הכביסה, ואז הוסיפו 1 מיליליטר של TBST חדש לכל באר שטיפה והעבירו את החלקים לבאר הכביסה הראשונה. במהלך הכביסה האחרונה, מוציאים את מדיית ההרכבה מ-4 מעלות צלזיוס ומאפשרים לה להתחמם לטמפרטורת החדר, ואז מכינים תערובת של 2 ל-1 של TBS ומים שעברו דה-יוניזציה ומוסיפים אותה לצלחת פטרי. לאחר מכן, הכינו שקופית מיקרוסקופ על ידי הוספת 800 מיקרוליטרים של תערובת 2 ל-1 של TBS ומים שעברו דה-יוניזציה לפני השטח.
מעבירים את החלקים מהכביסה 3 היטב לצלחת הפטרי, ואז באמצעות מכחול דק, מעבירים את החלקים בזה אחר זה מצלחת הפטרי לנוזל שעל המגלשה. לאחר מכן, סדרו בזהירות את החלקים כך שיהיו שטוחים על השקופית באמצעות המכחול. בזהירות, הסר נוזל עודף מהמגלשה עם פיפטה P-1000, ואחריו שאיפת ואקום.
לאחר הסרת כל הנוזל העודף מהמגלשה, השתמש בפיפטת העברה כדי להוסיף מיד טיפה אחת של מדיית הרכבה לכל מקטע ולהניח בעדינות כיסוי מעל המגלשה. אפשרו למדיית ההרכבה להתפשט למשך מספר דקות ולאחר מכן הסירו את כל מדיית ההרכבה העודפת שיוצאת מתחת לכיסוי על ידי שאיפת ואקום. לאחר מכן, אטמו את כל ארבעת הקצוות של החלקת הכיסוי בלק שקוף.
תנו לשקופיות להתייבש במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן אחסנו אותן שטוחות ב-4 מעלות צלזיוס. באמצעות מטרה של פי 10, אתר תאים בודדים להדמיה ושים לב לאזור המוח או תת-האזור הספציפי הרלוונטי לניסוי, ולאחר מכן באמצעות ידית המיקוד, לקבוע אם האסטרוציט כולו נמצא בתוך הקטע. לאחר מכן, עברו ליעד שמן הגדלה גבוה יותר והביאו את התא לפוקוס.
תוך כדי התבוננות דרך פיסת העין, השתמש בידית המיקוד כדי לנוע מהחלק העליון לתחתון של התא, ולאחר מכן בדוק חזותית את התא כדי לוודא שהתא כולו נמצא בתוך המקטע. באמצעות תוכנת הרכישה הקשורה למיקרוסקופים הקונפוקליים, התאם את פרמטרי הרכישה כדי לקבל יחס אות לרעש ורמת פירוט מתאימים, ולאחר מכן השתמש בזום 2x עבור מטרה של 40x וללא זום אם אתה משתמש במטרה של 60x או 63x. הגדר את הגבולות העליונים והתחתונים של ערימת Z עם גודל צעד של 0.5 מיקרומטרים, מה שמבטיח שכל האסטרוציט נלכד עם התמונות הראשונות והאחרונות ללא כל תיוג פלואורסצנטי של התא.
לפני תחילת הניתוח, התקן את קובץ סיומת הגוף הקמור, XtspotsConvexHull, על-ידי הדבקת הקובץ בתיקיית המשנה rtmatlab של תיקיית XT. באמצעות ממיר הקבצים של אימריס, המר תמונות לפורמט IMS. לאחר מכן, פתח קובץ תמונה בתוכנת ניתוח התמונה ובחר בלחצן תצוגה תלת-ממדית כדי להציג את התמונה במצב תלת-ממד, תוך הקפדה על כך שהתא עומד בקריטריוני ההכללה.
כדי ליצור משטח, לחץ על הסמל הכחול הוסף משטחים חדשים, ולאחר מכן צור אזור עניין סביב התא על-ידי הזנת ממדים לתוך התיבות מתחת לגודל כלי יצירת המשטח או גרירת הקצוות של התיבה הצהובה. לאחר מכן, התאם את העוצמה המוחלטת של הסף על-ידי גרירת הסרגל הצהוב או הזנת הערכים בתיבה כך שהמשטח האפור ימלא כמה שיותר מאותות התא מבלי לחרוג מגבולות התא. לאחר מכן, לחץ על החץ הירוק כדי לסיים את יצירת המשטח.
בדוק היטב את המשטח החדש שנוצר ומחק את כל חלקי המשטח שאינם חלק מהתא על-ידי בחירתם, ולאחר מכן לחץ על הכלי עריכת עיפרון ואחריו על האפשרות מחק. כדי לאחד את חלקי השטח הנותרים, לחץ על סמל מסנן המשפך כדי לבחור הכל, ולאחר מכן לחץ על סמל עריכת העיפרון ובחר באפשרות איחוד. לחץ על הסמל הכתום הוסף כתמים חדשים ובחר את ערוץ המקור הנכון מהרשימה הנפתחת, ולאחר מכן הזן ערך קוטר XY מוערך של 0.400 מיקרומטר בתיבה.
לאחר מכן, לחץ על החץ הירוק כדי לסיים את יצירת הכתמים ולאחר מכן בחר מחדש את הכתמים. לחץ על סמל המסנן ובחר את המרחק הקצר ביותר למשטחים משטחים משטחים X כאשר משטחים X הוא המשטח המנותח מהרשימה הנפתחת, כדי להבטיח שגם לחצני ההפעלה של הסף התחתון וגם הסף העליון יהיו ירוקים. לאחר מכן, הזן מרחק מינימלי של מינוס 1.0 מיקרומטר בתיבת הסף התחתונה ומרחק מרבי של 0.1 מיקרומטר בתיבת הסף העליונה, ולאחר מכן לחץ על לחצן מקטע כפול לנקודות חדשות, כדי להבטיח שהכתמים החדשים שנוצרו נבחרו בחלונית השמאלית העליונה של חלון התוכנה.
לאחר מכן, לחץ על סמל כלי ההילוכים ולאחר מכן לחץ על תוסף ה- Convex Hull רק פעם אחת והמתן עד שחלון MATLAB יופיע ואז ייעלם וכתוצאה מכך גוף מוצק בתצוגת התלת-ממד. בחלונית השמאלית העליונה, ודא שגוף קמור של ספוטים X בחירה, המרחק הקצר ביותר שבו בחירת ספוטים X היא הכתמים החדשים שנוצרו נבחרה ולאחר מכן לחץ על הגוף כדי לבחור אותו. לאחר מכן, לחץ על סמל סטטיסטיקת גרפים.
בכרטיסיה בחירה, ודא שערכים ספציפיים נבחרים מהרשימה הנפתחת העליונה ולאחר מכן בחר אמצעי אחסון מהרשימה הנפתחת התחתונה, ולאחר מכן תעד את עוצמת הקול של גוף הספינה ושמור את הקובץ, תוך המשך לתמונה הבאה. נפח שטח האסטרוציטים נמדד באסטרוציטים המבטאים חלבון פלואורסצנטי אדום ממוקד ממברנה. פירוק של מולקולת הידבקות התאים המועשרה באסטרוציטים, hepaCAM, מפחית באופן משמעותי את נפח שטח האסטרוציטים.
ניתוח פסיפס עם סמנים כפולים שימש ליצירת עכברים שבהם אסטרוציטים מסוג בר מבטאים חלבון פלואורסצנטי אדום ואסטרוציטים של hepaCam נוקאאוט מבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק. אחוז החפיפה בשטח בין זוגות אסטרוציטים פלואורסצנטיים של חלבונים פלואורסצנטיים אדומים וירוקים שכנים חושב. העכברים שעברו שינוי גנטי של hepaCAM ואסטרוציטים ירוקים הראו עלייה משמעותית באחוזים של נפח חפיפת שטחים עם שכניהם האדומים מסוג בר בהשוואה לזוגות אסטרוציטים מסוג פרא בלבד.
תוצאה זו מדגימה כי hepaCAM נדרש עבור נפח שטח אסטרוציטים רגיל, וריצוף אסטרוציטים. זה קריטי כדי להבטיח שהתא עומד בקריטריוני ההכללה. לתא לא שלם יהיה נפח שטח קטן יותר והוא עשוי להשפיע על התוצאות והמסקנות הכוללות שלך.
