Lazer yakalama mikrodiseksiyonunu, küçük bireysel doku örnekleri için transkriptomik veri setleri oluşturmak üzere CEL-Seq2 adı verilen tek hücreli bir RNA arama protokolü ile birleştiriyoruz. Bu teknik, geleneksel hücre sıralama yöntemleri kullanılarak çalışılamayan dokulardaki veya türlerdeki gen ekspresyonunu incelememizi sağlar. Ek olarak, toplu RNA-seq yaklaşımından daha fazla özgüllük sağlar.
Burada bu tekniği C.elegans dördüncü larva evre erkeklerinin ve hermafroditlerin dört hücreli kuyruk uçları için gösterdik. Ancak bu yaklaşımın güzelliği, model olmayan türlere bile uygulanabilmesidir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan doktora öğrencisi Bayan Raya Jallad ve şu anda Chattanooga, Tennessee'deki Baylor okulunda biyomedikal bilim adamı olan Dr. Antonio Herrera olacak.
Bir ila iki mililitre M9 tamponunu fışkırtmadan plakanın duvarına hafifçe pipetleyerek başlayın. Solucanları yerinden çıkarmak için plakayı döndürün. Deliklerin açılmasını önlemek için pipet ucunu agarın kenarındaki plakanın duvarına yerleştirerek tüm sıvıyı ve solucanları çıkarın ve atın.
Bu video, anneler ve larvalar çıkarılmadan önce plakayı göstermektedir. Anneler ve larvalar çıkarıldıktan sonra sadece embriyolar bırakılmalıdır. L1 larva, kuluçkadan sonra bir saat kadar görünmeye başlayacaktır.
Ardından plakayı 25 santigrat dereceye yerleştirin. Bir saat sonra, plakayı inkübatörden çıkarın. Bir mililitre M9 tamponunu agarın üzerine dikkatlice bırakın ve L1'leri yerinden çıkarmak için plakayı döndürün, ancak embriyoları değil.
Tüpü ve pipeti L1'leri doğrudan tohumlanmış bir plakanın bakteriyel çimine santrifüj edin. Solucanları 25 santigrat derecede tutun. 30 ila 50 X büyütmede bir diseksiyon mikroskobu altında, erkekleri ve hermafroditleri senkronizasyon plakalarından ayrı oturmamış plakalara toplamaya başlayın.
Erkekler, hermafrodit kuyruklarının sivri şekli ve koyu rengine kıyasla erkek kuyruklarının şişkin şekli ve daha açık rengi ile hermafroditlerden ayırt edilir. %0,01 deterjan içeren M9 tamponu ile önceden yıkanmış bir pipet ucu kullanarak solucanları plakadan bir ila iki mililitre M9 tamponu ile yıkayın. Solucanları bir mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın, bir dakika döndürün ve bir mililitre M9 tamponu ekleyin.
Yine, bir dakika boyunca döndürün. Bir mililitre buz gibi soğuk% 70 metanol ekleyin ve iyice karıştırın. Yıkamayı bir mililitre metanol ile tekrarlayın, iyice karıştırın.
Bir dakika boyunca döndürün ve 500 mikrolitre% 70 metanol ekleyin. Karıştırın ve bir saat ila bir gece boyunca dört santigrat derecede saklayın. Pipet, bir polietilen naftalat veya PEN membranlı cam kızağın kaplanmış tarafına 20 mikrolitre sabit solucanlar.
Metanolün buharlaşmasını bekleyin. Sahne alanının üzerindeki plastik kalkanı çıkarın ve membran kızaklarını yüklemek için yukarı doğru okla boşaltma düğmesine tıklayın. Kızağın tamamen kuru olduğundan emin olun, membran aşağı bakacak şekilde çevirin ve slaytı yerleştirin.
Örneği değiştir penceresinde devam'ı tıklatın. Slayt tutucu hareket edecektir. Ardından, ekranın altındaki plastik kalkanı değiştirin, hangi slayt tutucunun slaytı içerdiğini seçin ve tüpleri yüklemek için aşağı ok ile boşaltma düğmesine tıklayın.
Tepsiyi dışarı çekin ve tüp bloğunu çıkarın. Dört adet 500 mikrolitrelik PCR tüpünün tüp kapaklarını tutucuya yerleştirin ve tüpü altına katlayın. Bloğu tepsiye geri döndürün ve tepsiyi mikroskop aşamasına geri kaydırın.
Toplayıcı aygıtı değiştir açılır penceresinde, PCR tüpleri'ni seçin ve Tamam'ı tıklatın. Kollektör cihazı tüp kapaklarının altındaki ekranın sol alt köşesindeki boş tüp konumuna tıklayın ve mikroskop kontrol panelinde iletilen ışık parlak alan aydınlatması için TLBF'yi seçin. 2.5X lensi kullanarak, solucanlar ve PEN membranın yüzey yapısı görünene kadar odağı ayarlayın.
20X lense geçin ve sahne alanını solucanların olmadığı bir bölgeye taşıyın. Odağı, zardaki kabarcık benzeri yapılar, lazeri doğru odak düzlemine odaklamak için sarımsı bir renge sahip olacak şekilde ayarlayın ve ardından lazer parametrelerini ayarlayın. Kuyruk uçları için, güç 45 diyafram açıklığı 30 hız 20 ile başlayın.
Lazer kontrol panelinde kalibre et'i seçin ve talimatları izleyin. Ardından, toplayıcı cihaz tüp kapaklarındaki ekranın alt kısmında A konumuna tıklayın, ekranın sağ tarafında tek bir şekil seçin, ardından çizin ve kesin. Ardından noktadan noktaya seçin ve bir çizgi çizin.
Lazerin membranı kesmesi için kesmeye başla'yı tıklayın. Bir solucan bulun ve hareket etmek ve kesmek için geçiş yapın. Kuyruğu kesmek için fareyi kullanın.
Numuneyi toplamak için, noktadan noktaya işleviyle çekme ve kesme ayarına geçin ve bir membran bölümünün kesimini tamamlamak için şekil çizin. Ekranın altındaki toplayıcı cihaz tüp kapağında bir sonraki tüpü seçin ve bir sonraki kuyruk ucunu kesin. Dört kuyruk kesildikten sonra, aşağı doğru okla boşalt'a tıklayarak tüp rafını boşaltın.
Membran kesitlerini diseksiyon mikroskobu altında bulun ve çıkış yönündeki numune işlemeye devam edin. Burada CEL-Seq2 ile RNA dizilimi. Pipet 1,2 mikrolitrelik bir CEL-Seq2 astar ana karışımı doğrudan numunenin üzerine gelir ve tüpü kapatın.
Astar numarası ile etiketleyin ve numuneyi dondurmak için tüp kapağını doğrudan bir kuru buz parçasının üzerine yerleştirin, böylece RNA bozulmasını önleyin. Tüm örnekler toplanana kadar tekrarlayın. Sonunda tüpleri eksi 70 santigrat derecede saklayın.
C.elegans L3 hermafroditleri ve yumurtadan çıktıktan 21 ila 23 saat sonra erkekler, diseksiyon mikroskobu altında kuyruklarının morfolojisi ile ayırt edilebilir. Hermafrodit masalı dar, erkeklerinki şişmiş ve net görünüyor. Bu görüntülerde PEN membran slayt yapısının ve solucan kuyruğunun görünümü gösterilmektedir.
Burada mikroskoptaki 20X ve 40X lensler için odak doğrudur. Parçalanmış kuyruk tarafsız bir şekilde kesilmiş PEN zarı burada görülebilir. Kesimdeki boşluğu kapattıktan sonra, membran parçası kızağın altındaki tüp kapağına düşecektir.
Burada disseke edilmiş bir kuyruk ucu içeren bir PEN membran bölümüne sahip bir tüp kapağı gösterilmektedir. Grafik görüntü, farklı zaman noktaları ve cinsiyetler için bireysel kuyruk ucu başına doğal kütüğe dönüştürülmüş benzersiz moleküler tanımlayıcıyı veya UMI sayımlarını temsil eder. PowsimR yazılımı, çeşitli ekspresyon seviyelerinde diferansiyel eksprese veya DE genlerini tespit etmek için kaç bağımsız numunenin gerekli olduğunu belirlemek için kullanılır.
Buradaki grafik görüntü, koşul başına farklı örneklem boyutlarını içeren dört farklı simülasyon için iki koşul arasındaki DE genlerini tespit etmek için gerçek pozitif oranı temsil eder. Kesikli çizgi, %80 gerçek pozitif oranı gösterir. Yanlış keşif oranı ve aynı dört simülasyon burada gösterilmiştir.
Kesikli çizgi, %10 yanlış keşif oranını gösterir. Grafikler, durum başına 70 kuyruk ucundan oluşan bir örneklem büyüklüğünün, çok düşük ekspresyon seviyelerine sahip genler hariç, DE genlerini tespit etmek için yeterli olduğunu göstermiştir. Doğru senkronizasyon için, plakada sadece embriyoların bulunduğundan emin olun.
Numune kaybına karşı emin olmak için, astarın pipeti doğrudan kapaktaki PEN membran bölümüne karıştırın ve kapağı kapatırken son derece nazik olun. Türlerden bağımsız olduğu için, bu protokolü gen düzenleyici ağların farklı türlerdeki homolog yapılar için nasıl geliştiğini keşfetmek için kullanabiliriz.
