激光显微切割，用于与物种无关的单组织应用

我们将激光捕获显微切割与称为CEL-Seq2的单细胞RNA寻道方案相结合，为小型单个组织样品生成转录组数据集。这项技术使我们能够研究使用传统细胞分选方法无法研究的组织或物种中的基因表达。此外，它提供了比大宗RNA-seq方法更高的特异性。

在这里，我们为秀丽隐杆线虫第四幼虫阶段雄性和雌雄同体的四个细胞尾尖演示了这种技术。但这种方法的美妙之处在于，它甚至可以应用于非模型物种。演示该程序的将是我实验室的博士生Raya Jallad女士和田纳西州查塔努加贝勒学院的首席生物医学科学家安东尼奥·埃雷拉博士。

首先轻轻地将一到两毫升M9缓冲液移液到板壁上而不喷射。旋转板以驱除蠕虫。通过将移液器尖端放在琼脂边缘的板壁上，以去除并丢弃所有液体和蠕虫，以避免戳孔。

该视频显示了在去除母亲和幼虫之前的板。在母亲和幼虫被移除后，只应留下胚胎。L1幼虫将在孵育一小时左右后开始出现。

然后将盘子放在25摄氏度。一小时后，从培养箱中取出板。小心地将一毫升M9缓冲液滴到琼脂上，并旋转板以除去L1s而不是胚胎。

离心管并将L1直接移液到接种板的细菌草坪上。将蠕虫保持在25摄氏度。在30至50 X放大倍率的解剖显微镜下，开始从同步板中挑选雄性和雌雄同体到单独的未就位板上。

雄性与雌雄同体的区别在于雄性尾巴的凸起形状和较浅的颜色，与雌雄同体的尾巴的尖头形状和较深的颜色相比。使用用含有0.01%洗涤剂的M9缓冲液预洗的移液器吸头，用一到两毫升M9缓冲液从板上洗掉蠕虫。将蠕虫转移到一毫升离心管中，旋转一分钟并加入一毫升M9缓冲液。

再次旋转一分钟。加入一毫升冰冷的70%甲醇，搅拌均匀。用一毫升甲醇重复洗涤，搅拌均匀。

旋转一分钟，加入500微升70%甲醇。混合并储存在四摄氏度下一小时至过夜。将20微升的固定蠕虫移液到聚乙烯萘二甲酸盐或PEN膜载玻片的涂层侧。

等待甲醇蒸发。取下载物台上的塑料护罩，然后单击带有向上箭头的卸载按钮以加载膜滑块。确保载玻片完全干燥，翻转使膜朝下，然后插入载玻片。

在更改样本窗口中单击继续。幻灯片支架将移动。然后更换塑料护罩，在屏幕底部，选择包含滑块的滑块支架，然后单击带有向下箭头的卸载按钮以加载管子。

拉出托盘并取下管块。将四个500微升PCR管的管盖插入支架中，然后将管折叠在下面。将块放回托盘，然后将托盘滑回显微镜载物台。

在更改收集器设备弹出窗口中，选择 PCR 管，然后单击确定。单击屏幕左下角收集器管盖下的空管位置，然后在显微镜控制面板中选择TLBF进行透射光明场照明。使用2.5X镜头，调整焦点，直到可以看到蠕虫和PEN膜的表面结构。

切换到20X镜头，将载物台移动到没有蠕虫的区域。调整焦点，使膜中的气泡状结构具有淡黄色，以将激光聚焦在正确的焦平面上，然后设置激光参数。对于尾尖，从功率45孔径30开始，速度20。

在激光控制面板中，选择校准并按照说明进行操作。接下来，在屏幕底部的收集器设备管盖上单击位置A，在屏幕右侧选择单个形状，然后绘制和切割。然后选择点到点并绘制一条线。

单击"开始切割"，使激光切割膜。找到一条蠕虫并切换以移动和切割。使用鼠标切开尾巴。

要收集样品，请切换到具有点对点功能的绘制和切割设置，并绘制形状以完成膜截面的切割。在筛网底部的集热器装置管盖处选择下一个管子，并切割下一个尾尖。切割四条尾部后，通过单击向下箭头卸载来卸载管架。

在解剖显微镜下找到膜切片，然后继续进行下游样品处理。在这里，用摄氏-Seq2进行RNA测序。将1.2微升的CEL-Seq2引物预混液直接移液在样品顶部并关闭试管。

用引物编号标记，并立即将管盖直接放在一块干冰上，以快速冷冻样品，从而防止RNA降解。重复此步骤，直到收集完所有样本。最后将管子储存在零下70摄氏度。

秀丽隐杆线虫L3雌雄同体和雄性在孵化后21至23小时可以通过其尾巴的形态在解剖显微镜下区分。雌雄同体的故事很窄，而雄性的故事是肿胀的，看起来很清晰。PEN膜滑动结构和蠕虫尾巴的外观显示在这些图像中。

在这里，显微镜下20X和40X镜头的焦点是正确的。解剖的尾巴公正地切开的PEN膜在这里是可见的。在关闭切割间隙后，膜片将落入滑块下方的管盖中。

此处显示了带有 PEN 膜截面的管帽，其中包含解剖的尾尖。图形图像表示不同时间点和性别的每个尾尖的自然对数转换的唯一分子标识符或UMI计数。powsimR软件用于确定需要多少独立样品来检测不同表达水平的差异表达或DE基因。

此处的图形图像表示在四个不同模拟中检测两个条件之间的DE基因的真阳性率，每个条件包含不同的样本量。虚线表示 80% 的真阳性率。此处显示了错误发现率和相同的四个模拟。

虚线表示错误发现率为 10%。图表显示，每个条件70个尾尖的样本量足以检测DE基因，除了表达水平非常低的基因。为了正确的同步，确保板上只有胚胎存在。

为确保防止样品丢失，将引物混合物直接移液到盖子的PEN膜部分，并在关闭盖子时非常温和。因为它是物种不可知的，我们可以使用这个协议来探索基因调控网络是如何针对不同物种的同源结构进化的。