Bu yöntem, memelilerde bir oluşum boyunca gastrülasyonu anlamak için temel olacaktır. Uzun zamandır anne rahminin içine gizlenmiş embriyonik aşamalarda canlı embriyolarda deneylere izin vererek. Fare embriyolarının rahim dışında 6 güne kadar uzun bir süre boyunca verimli ve uygun bir şekilde büyümesine izin verir, devam eder.
Gaz konsantrasyonu ve basıncının hızlı ve yeterli embriyo diseksiyonu ve pregastrülasyonu başarılı embriyo büyümesi için en kritik adımlardır. 7,5 günlük veya daha gelişmiş fare embriyolarını kültlüğe başlatmak için, embriyo diseksiyonlarından önce en az 1 saat boyunca roller kültür inkübatör sisteminin rotator ve ısıtma ünitesini açın. Ayrıca, gaz giriş şişesine ve çıkış test tüpüne otoklav suyu ekleyin.
Ardından, ana anahtara basarak gaz regülatör modülünü açın, ardından oksijen ve karbondioksit değerlerini% 5'e ayarlamak için ilgili kontrolörleri kullanın Gaz regülatörünü açın ve gaz basıncını inç kare başına yaklaşık 6,5 ila 7 pounda ayarlamak için basınç vericislerindeki voltaj anahtarını hareket ettinin. Dijital basınç göstergesi kullanarak gaz basıncı değerini onaylayın. Hassas inkübatörün içine tahsis edilen çıkış suyu dolu test tüpünün içinde oluşturulan kabarcıkların oranını kontrol ederek gaz akışını izleyin.
Su şişesinin kapağındaki gaz akış vanasını kapatarak veya açarak uygun kabarcık oranını ayarlayın. Gaz akışının saniyede 2 ila 4 kabarcık hızında kabarcık oluşumuna izin verdiğinden emin olun veya kabarcık akışını kabarcıklanmanın su dolu çıkış tüpüne çıktığı ilk noktada ayarlayın. Daha sonra, kültür şişelerini 2 mililitre kültür ortamı ile doldurun.
Şişeleri kapatmak için oyulmuş silikon bung'ları kullanın ve 1 saat boyunca ön denge için oyulmuş dönen tambura takın. Dönen tamburdaki boş alanları katı maşalar kullanılarak kapalı tutun. Daha sonra, embriyoları ötenazili hamile bir kadın fareden parçalara ayrıştırın.
Karnı % 70 etanol ile temizleyin ve makas kullanarak cildi ve karın duvarını kesin. Uterusun bir ucunun yerini bulun ve yumurtalık ile rahim arasındaki kavşakta kesin. Diğer uca kadar uterus boyunca kesmeye devam edin ve DPBS ile dolu 100 milimetre petri kabına aktarın.
Kavramları DPBS'de hızlı bir şekilde yıkayın ve embriyo kullanımını kolaylaştırmak için çiftler halinde kesin. Tüm kavramsal çiftleri 60 milimetrelik bir Petri kabında önceden dengelenmiş diseksiyon ortamına taşıyın, ardından bireysel kavramsalları kesin. Daha sonra, bir çift brüt kümes gücü kullanarak, uterus dokusunu yırtarak kavramüslerin uterus duvarını çıkarın, ardından ince, mikrocerrahi tokmaklar kullanarak armut şeklindeki yaprak dökenin ucunu kesin.
Uzun eksenine paralel olarak embriyonun yanına tokaları yerleştirin ve yaprak dökenleri yarıya bölmek için tokaları açın. Son olarak, ince tokalar kullanarak, embriyoyu yaprak dökenden kavrayın ve parietal yumurta sarısı çuvalını embriyodan soyun ve yumurta silindirine bağlı bozulmamış ektoplacental koniyi bırakın. Epiblastta hasar göstermeyen sinir plakasındaki veya erken kafa katlama aşamasındaki embriyoları seçin.
Şişe başına seçilen 5 ila 6 embriyoyu önceden dengelenmiş cam kültür şişelerine aktarın ve şişeleri 37 santigrat derecede, % 5 oksijen ve% 5 karbondioksit atmosferinde dönen kültür sistemine yerleştirin. Pregastrülasyon ve erken gastrülasyon embriyolarını ve statik plakaları kültüre etmek için, 8 kuyu plakasının her kuyusuna 250 mikrolitre taze hazırlanmış ex-utero embriyo kültürü ortamı ekleyin. Plakaları ön denge için 37 santigrat derecede bir karbondioksit inkübatörünün içine yerleştirin.
Embriyoları daha önce gösterildiği gibi uterustan çıkardıktan sonra, bireysel embriyoları bir mikro pipet kullanarak 8 kuyu plakasının her kuyusuna aktarın ve plakayı 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile inkübatörün içine yerleştirin. Embriyoları stereo mikroskop altında görüntüleyin ve kültür için sadece belirgin bir hasarı olmayan ve Reichert'in zarı olmadan iyi biçimlendirilmiş amniyotik boşluğa sahip olanları seçin. 7,5 günlük embriyolar için bu protokolde açıklanan silindir kültürü koşulları, 4 kültür gününden sonra ortalama %75'e yakın verimle sabit ve normal embriyo büyümesini desteklememektedir.
Embriyo gelişiminin verimliliği çeşitli fare genetik geçmişlerine göre değişir, ancak sürekli olarak sağlamdır. HCS yerine HBS ile takviye, 4 günlük kültürden sonra yaklaşık% 68 verimlilik sağlar. 6.5 embriyo ve statik plaka gelişimi, hem HCS hem de HBS ile ex-utero embriyo kültürü ortamı kullanılarak% 90'dan fazla bir verimlilikle doğru bir şekilde yeniden özetlenmektedir.
Pregastrulating embriyolardan başlayan kültürler, erken somit evresine doğru gelişimin% 46 verimliliğini gösterir ve embriyoların yaklaşık% 17'si 6 günlük kültürden sonra uygun gelişimi tamamlar. Morfogenez ve doku gelişimi 42 somite kadar düzgün ilerler. Embriyonik gün 7.5, 6.5 ve 5.5'ten itibaren başlatılan kültürler için embriyolarda gözlenen temsili gelişimsel kusurlar burada gösterilmiştir.
Epiblastta küçük hasar olan embriyolar veya Reichert'in zarını tutan embriyolar atılmalıdır. Embriyonik epiblastın plaka yüzeyine bağlanması daha fazla embriyo gelişiminin başarısızlığa neden olurken, erken embriyolar düzgün büyümez veya ciddi gelişimsel gecikmeler göstermez. Kusurlu embriyolarda gözlenen başlıca anormallikler, yumurta sarısı çuvalı dışındaki arka bölgenin gelişmesi veya sinir kıvrımlarının büyümesindeki kusurlardır.
5,5 günlük embriyolardan geliştirilen kültürlerde sıklıkla gözlenen gelişimsel kusur, küçük, az gelişmiş bir epiblast varlığıdır. Bu yöntemi kullanarak, araştırmacılar implante sonrası embriyoların geliştirilmesinde çeşitli fiziksel veya kimyasal manipülasyonlar gerçekleştirebilmektedir. Örneğin, manipülasyon, hücresel transplantasyon veya soy izleme.
Bu yöntem sadece çok ayrıntılı olarak gelişen fare post-implantasyonunun incelenmesinin değil, aynı zamanda insan gibi diğer türlerden embriyolarda benzer kültür yöntemlerinin uygulanmasının da önünü açmaktadır.
