주요 메가카요세포 전구 집단의 분리는 단일 세포 수준까지 분자 분석법의 세포 배양에서 계보 계층구조의 미세한 분석을 가능하게 한다. 이 프로토콜은 MEP 및 MKP 집단의 세포 분류를 위한 효율적인 프로세스에서 필요한 동물의 수를 최소화하여 보다 윤리적인 관행을 결합합니다. 뼈의 경우, 컬렉션은 8-12주 된 C57 블랙 6 마우스의 몸에 70%에탄올을 뿌린다.
가위를 사용하여 척추에 수직으로 5~1센티미터의 피부 절개를 합니다. 그리고 몸을 당겨 몸 전체를 찢어. 마우스를 해부 패드에 아래로 놓고 손가락이나 가위를 슬라이딩하여 골반 뼈를 찾습니다.
iliac 문장을 찾으려면 뒷다리 근처의 요추 부위의 작은 범프를 식별합니다. 척추에 평행하게 가위를 배치 한 후, 척추에 대해, 그리고 iliac 문장 범프에 가까운, 골반 뼈 위의 척추의 측면을 따라 근육을 잘라 진행, 척추를 따라 가위를 슬라이딩하여, 꼬리아래로. 그런 다음 척추와 장골 문장 사이를 잘라 가능한 한 척추에 가깝게 유지합니다.
그리고 몸에서 사지를 분리하기 위해 나머지 근육을 잘라. 분리된 팔다리를 깨끗한 표면으로 옮기습니다. 기관 지침에 따라 신체의 나머지 부분을 폐기 한 후, 주위 조직을 제거하여 골반, 대퇴, 및 정골 뼈를 노출하는 집게와 메스를 사용합니다.
집게를 사용하여 대퇴골의 탈경을 잡고, 메스로 관절 주위의 근육을 부드럽게 슬라이스하여 골반 뼈에서 대퇴머리를 조심스럽게 탈구하십시오. 골반 뼈에서 남은 근육을 긁어 내고 대퇴머리를 쥐고 있는 구멍 의 한가운데에서 잘라냅니다. 일륨을 유지하고 뼈의 삼각형 얇은 면을 폐기하십시오.
메스를 사용하여, 일륨 주위에 잔류 조직을 제거하고, 2 %의 신생아 송아지 세럼으로 보충 멸균 PBS에 청소 된 뼈를 배치합니다. 그런 다음 가위를 사용하여 발목의 다리에서 발을 잘라냅니다. 집게로 경골의 하부부분을 잡고, 무릎을 향해 근육을 긁어.
비골을 버리십시오. 그런 다음 메스로 양철 고원을 가로 질러 잘라 멸균 PBS 2 %NBCS에 경골을 놓습니다. 대퇴골 주위의 잔류 조직을 제거한 후 대퇴골의 위쪽을 집게로 잡고 메스 블레이드를 슬개골 바닥에 놓습니다.
슬개골을 향해 힘을 바르고 대퇴골과 평행하여 슬개골을 분리합니다. 그런 다음 대퇴골을 멸균 PBS 2 %NBCS에 배치하십시오. 라미나르 플로우 캐비닛에서 뼈를 멸균 PBS 2%NBCS로 채워진 멸균 페트리 접시로 옮겨보도록 한다.
메스를 사용하여 대퇴골의 머리를 잘라냅니다. 멸균 PBS 2 % NBCS로 1 밀리리터 주사기를 채우고 21 게이지 바늘을 콘센트에 부착하십시오. 그런 다음 멸균 PBS 2 % NBCS의 두 밀리리터와 5 밀리리터 폴리 프로필렌 튜브를 채웁니다.
대퇴골을 집게로 잡고, 왼쪽 홈에 바늘을 삽입, 회전을 적용하여 슬개골 제거 후, 바늘이 완전히 뼈에 삽입되도록, 벨까지. 바늘 삽입 후, PBS 2 %NBCS의 두 밀리리터를 포함하는 튜브에 바늘로 뼈를 전송. 그런 다음 PBS 2%NBCS를 주사기에서 뼈가 맑을 때까지 분배하고 흡인시합니다.
대퇴골에서 바늘을 제거하고 대퇴골 머리가 있던 반대쪽구멍에 삽입합니다. 버퍼를 분배하고 흡입한 후 뼈를 버리십시오. 일강 문장과 경골의 경우, 포셉을 사용하여 뼈를 잡고 회전을 적용하여 열린 쪽에 바늘을 부드럽게 삽입하십시오.
바늘이 완전히 뼈에 삽입되도록, 베벨까지. 그런 다음 바늘로 뼈를 PBS 2%NBCS의 2밀리리터를 포함하는 튜브로 옮킨다. 뼈가 명확해질 때까지 PBS 2%NBCS를 주사기에서 분배하고 흡인시합니다.
40 미크로넨 셀 스트레이너 캡을 통해 모든 세포 서스펜션을 전달하고 멸균 5 밀리리터 폴리스티렌 튜브에 배치하고 PBS 2 % NBCS의 500 마이크로 리터를 추가합니다. 총 골수로 세포 현탁액의 100 마이크로 리터를 따로 둡니다. 그런 다음 염색 절차를 위해 얼음에 보관하십시오.
원심분리에 의해 여과된 서스펜션을 펠렛. 상체를 폐기한 후, 갓 준비된 1차 항체 칵테일에 펠릿을 30~45분 간 얼음에 잠식합니다. 세포 현탁액 10마이크로리터를 멸균 5밀리리터 폴리스티렌 튜브에 넣고 린 포레스 분획으로 표시하고 PBS 2%NBCS의 마이크로리터 90개추가 추가합니다.
한편, 30초 동안 철저한 소용돌이로 바이알에서 재연하여 자기 고갈을 위한 구슬을 준비한다. 대상 셀 당 두 개의 구슬에 해당하는 구슬의 부피를 5 밀리리터 폴리 프로필렌 튜브로 옮기고, PBS 2%NBCS를 사용하여 구슬을 두 번 세척하여 자석에 튜브를 배치합니다. 멸균 유리 파스퇴르 파이펫으로 세척 버퍼를 제거 한 후, 멸균 PBS 2 % NBCS의 500 마이크로 리터에서 구슬을 다시 중단합니다.
자기 고갈의 첫 번째 단계의 경우, 세척 된 세포의 펠릿에 250 마이크로 리터의 구슬을 추가하고 얼음에 5 분 동안 부드러운 혼합으로 인큐베이션하십시오. 그런 다음 부드러운 혼합으로 멸균 PBS 2 % NBCS의 2 밀리리터를 추가하고 2 분 동안 자석에 튜브를 놓습니다. 멸균 유리 파스퇴기 파이펫으로 비자기 분획을 수집합니다.
그리고 자기 고갈의 두 번째 단계에 대해, 자기 구슬의 나머지 250 마이크로 리터에 추가합니다. 튜브 롤러에 파라핀으로 밀봉 된 튜브를 섭씨 4도에서 20 분 동안 놓습니다. 그런 다음 부드러운 믹싱으로 멸균 PBS 2 % NBCS의 2 밀리리터를 추가합니다.
그리고 2 분 동안 자석으로 튜브를 배치합니다. 비자기 분획을 멸균 유리 파스트렐러 파이펫으로 라벨이 붙은 비자기 린 네그 분획으로 비자기 분획을 수집하고 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 메가카요사이클프 선조를 분류하는 셀 을 진행한다. 세포 선별을 위한 게이팅 전략의 경우, 린 네이 포집단에서 C 키트를 발현하는 세포, 및 Sca-1 또는 CD16/32 항원의 발현이 낮거나 전혀 없는 것이 선택된다.
이 인구에서 MEP는 CD150 양성 및 CD9 딤 셀로 식별됩니다. MKP는 CD150 양성 및 CD9 밝은 셀로 합니다. 대표적인 유동 세포분석에서 MEP 및 Mkp로 확인된 세포는, CD41a, CD42c 고전적인 마커, 메가카요시틱 및 혈소판 혈통의 형광 컨쥬게이징 항체로 표지되었다.
두 마커모두 MKp 집단의 세포에 의해 발현되었고, MEP 집단의 세포의 표면에서 검출되지 않았다. 정렬 된 메가 카요세포의 DNA 함량은 세포가 MEP 집단을 위해 대부분 2n임을 입증했습니다. 그리고 MKp 세포의 작은 부분은 외국이다.
더 높은 계피 세포는 이 인구에서 현저하게 검출되지 않았습니다. 반고체 종양 학적 인 암투술에서 CFU-MK는 MEP 및 MKp 인구 모두에서 검출되었습니다. BFU-E는 MKp 인구에서 검출되지 않았지만 MEP및 CD150 음성 CD9 딤선조 세포 집단에서 검출되었다.
분화의 셋째 날에 현미경 관찰, MEP와 MKp는 큰 세포로 확인 된 주로 거대 카르요 세포를 생산 것을 보여줍니다. 3일간의 배양 후 얻어진 메가카요세포는 CD41 및 CD42c 발현을 사용하여 확인되었으며, MEP 및 MKp 세포 집단으로부터 생성된 세포의 54%, 및 82%를 각각 나타낸다. 생성된 거대 카르요세포의 계골은 MEP 인구에 비해 MKp 인구에서 파생된 거대 카르요세포로부터 더 컸다.
MKp 인구에서 파생된 세포만이 프로플라틀렛 방출이 가능하여 MKp 인구에 대한 보다 진보된 성숙 단계를 시사했습니다. 골반 뼈의 사용은 세포 수로 크게 증가하고 2 단계 자기 고갈은 계보 고갈의 효능을 향상시킵니다. 이 프로토콜은 단일 세포의 MEP 및 MKp 집단의 후속 배양을 허용하며, 전사 및 프로테오믹 분석과 함께, 확실히 관련된 메커니즘을 해독해야 할 것입니다, 구현 된 생물 발생.
