Die Isolierung wichtiger Megakaryozyten-Vorläuferpopulationen ermöglicht die feinen Analyse der Abstammungshierarchie in der Zellkultur auf molekularen Assays bis hin zur Einzelzellebene. Dieses Protokoll kombiniert eine ethischere Praxis, indem es die Anzahl der benötigten Tiere minimiert, in einem effizienten Prozess für die Zellsortierung von MEP- und MKP-Populationen. Für Knochen sprühen Sie den Körper einer acht bis 12 Wochen alten C57 Black Six Mouse mit 70% Ethanol auf.
Verwenden Sie eine Schere, um einen Punkt fünf bis einen Zentimeter Schnitt der Haut, senkrecht zur Wirbelsäule zu machen. Und reißen Sie die Haut um den ganzen Körper, indem Sie sie nach unten ziehen. Legen Sie die Maus mit dem Gesicht nach unten auf das Sezierpad und lokalisieren Sie dann die Beckenknochen, indem Sie mit den Fingern oder einer Schere entlang der freiliegenden Wirbelsäule von oben nach unten gleiten.
Um den Beckenkamm zu lokalisieren, identifizieren Sie die kleine Beule in der Lendengegend in der Nähe der Hintergliedmaßen. Nachdem Sie die Schere parallel zur Wirbelsäule, gegen die Wirbel und in der Nähe der Beckenkammbeule platziert haben, schneiden Sie die Muskeln entlang der Seite der Wirbelsäule über dem Beckenknochen ab, indem Sie die Schere entlang der Wirbel bis zum Schwanz gleiten lassen. Schneiden Sie dann zwischen den Wirbeln und dem Beckenkamm und bleiben Sie so nah wie möglich an den Wirbeln.
Und schneiden Sie die verbleibenden Muskeln ab, um die Extremität vom Körper zu lösen. Übertragen Sie die abgelösten Gliedmaßen auf eine saubere Oberfläche. Nachdem Sie den Rest des Körpers in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien verworfen haben, verwenden Sie Pinzette und Skalpelle, um die Becken-, Oberschenkel- und Tibiaknochen freizulegen, indem Sie das umgebende Gewebe entfernen.
Verwenden Sie eine Pinzette, um das distale Ende des Femurs zu halten, und dislozieren Sie vorsichtig den Hüftkopf vom Beckenknochen, indem Sie die Muskeln um die Artikulation mit einem Skalpell sanft schneiden. Kratzen Sie den verbleibenden Muskel vom Beckenknochen ab und schneiden Sie in die Mitte der Höhle, die den Hüftkopf hielt. Bewahren Sie das Darmbein auf und verwerfen Sie die dreieckige dünne Seite des Knochens.
Entfernen Sie mit einem Skalpell die Restgewebe um das Darmbein und legen Sie den gereinigten Knochen in steriles PBS, ergänzt mit 2% Newborn Calf Serum. Dann verwenden Sie eine Schere, um den Fuß vom Bein am Knöchel abzuschneiden. Halten Sie den unteren Teil der Tibia mit der Pinzette und kratzen Sie den Muskel in Richtung Knie.
Entsorgen Sie das Wadenbein. Machen Sie dann mit dem Skalpell einen Schnitt über das Tibiaplateau und legen Sie die Tibia in steriles PBS 2% NBCS. Nachdem Sie die Restgewebe um den Femur entfernt haben, halten Sie die Oberseite des Femurs mit einer Pinzette fest und legen Sie die Skalpellklinge an die Basis der Kniescheibe.
Wenden Sie eine Kraft in Richtung der Kniescheibe an, parallel zum Femur, um die Kniescheibe zu lösen. Dann legen Sie den Femur in steriles PBS 2% NBCS. In einem Laminar-Flow-Schrank die Knochen in eine sterile Petrischale geben, die mit sterilem PBS 2% NBCS gefüllt ist.
Verwenden Sie ein Skalpell, um den Kopf der Femuren abzuschneiden. Füllen Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit sterilem PBS 2% NBCS und befestigen Sie eine 21-Gauge-Nadel am Auslass. Füllen Sie dann ein Fünf-Milliliter-Polypropylenröhrchen mit zwei Millilitern sterilem PBS 2% NBCS.
Halten Sie den Femur mit einer Pinzette, führen Sie die Nadel nach der Kniescheibenentfernung durch Rotation in die Rille links ein, um sicherzustellen, dass die Nadel vollständig in den Knochen eingeführt wird, bis zur Fase. Nach dem Einführen der Nadel wird der Knochen mit der Nadel in das Röhrchen mit zwei Millilitern PBS 2% NBCS übertragen. Geben Sie dann das PBS 2% NBCS aus der Spritze ab und aspirieren Sie es, bis der Knochen klar ist.
Entfernen Sie die Nadel vom Femur und führen Sie sie in das Loch auf der gegenüberliegenden Seite ein, wo sich der Femurkopf befand. Nach dem Dosieren und Absaugen des Puffers entsorgen Sie den Knochen. Verwenden Sie für den Beckenkamm und die Tibia eine Pinzette, um den Knochen zu halten, und führen Sie die Nadel vorsichtig in die offene Seite ein, indem Sie eine Rotation anwenden.
Sicherstellen, dass die Nadel vollständig in den Knochen eingeführt wird, bis zur Fase. Dann übertragen Sie den Knochen mit der Nadel in das Röhrchen, das zwei Milliliter PBS 2% NBCS enthält. Verteilen und aspirieren Sie das PBS 2% NBCS aus der Spritze, bis der Knochen klar ist.
Führen Sie die gesamte Zellsuspension durch eine 40-Mikron-Zellsiebkappe, legen Sie sie auf ein steriles Fünf-Milliliter-Polystyrolröhrchen und fügen Sie 500 Mikroliter PBS 2% NBCS hinzu. 100 Mikroliter der Zellsuspension als Gesamtknochenmark beiseite legen. Dann lagern Sie es auf Eis für den Färbevorgang.
Pellet die gefilterte Suspension durch Zentrifugation. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspen sie das Pellet in einem frisch zubereiteten primären Antikörpercocktail mit der Inkubation auf Eis für 30 bis 45 Minuten. 10 Mikroliter der Zellsuspension in ein steriles Fünf-Milliliter-Polystyrolröhrchen mit der Bezeichnung Lin Pores Fraction geben und 90 Mikroliter PBS 2% NBCS hinzufügen.
Bereiten Sie in der Zwischenzeit eine Perle für die magnetische Erschöpfung vor, indem Sie sie in der Durchstechflasche mit gründlichem Wirbeln für 30 Sekunden wiederverwenden. Übertragen Sie ein Volumen von Perlen, das zwei Perlen pro Zielzelle entspricht, in ein Fünf-Milliliter-Polypropylenrohr und waschen Sie die Perlen zweimal mit PBS 2% NBCS, indem Sie das Rohr auf den Magneten legen. Nach dem Entfernen des Waschpuffers mit einer sterilen Glaspasteurpipette werden die Perlen in 500 Mikroliter sterilem PBS 2%NBCS resuspendiert.
Für den ersten Schritt der magnetischen Erschöpfung fügen Sie 250 Mikroliter Perlen auf das Pellet der gewaschenen Zellen auf und inkubieren Sie mit sanftem Mischen für fünf Minuten auf Eis. Dann fügen Sie zwei Milliliter steriles PBS 2% NBCS mit schonendem Mischen hinzu und legen Sie das Röhrchen für zwei Minuten in den Magneten. Sammeln Sie die nichtmagnetische Fraktion mit einer sterilen Glaspasteurpipette.
Und für den zweiten Schritt der magnetischen Erschöpfung fügen Sie es zu den verbleibenden 250 Mikrolitern magnetischer Perlen hinzu. Legen Sie das mit Paraffin versiegelte Rohr für 20 Minuten bei vier Grad Celsius auf eine Rohrwalze. Dann fügen Sie zwei Milliliter steriles PBS 2% NBCS mit sanfter Mischung hinzu.
Und legen Sie die Röhre mit dem Magneten für zwei Minuten. Sammeln Sie die nichtmagnetische Fraktion in einem sterilen Fünf-Milliliter-Polypropylenröhrchen, beschriftet, nichtmagnetische Lin Neg Fraction, mit einer sterilen Glaspasterpipette, und fahren Sie mit der Zellsortierung von Megakaryozyten-Vorläufern fort, wie im Textmanuskript beschrieben. Für die Gating-Strategie zur Zellsortierung werden in der Lin Neg-Population die Zellen ausgewählt, die C-Kit exprimieren, und ein niedriges bis gar kein Expression von Sca-1- oder CD16/32-Antigen.
In dieser Population werden MEP als CD150-positive und CD9-dime Zellen identifiziert. Das MKP als CD150 positive und CD9 helle Zellen. In der repräsentativen Durchflusszytometrie-Analyse wurden Zellen, die als MEP und Mkp identifiziert wurden, mit fluoreszenzkonjugierten Antikörpern für CD41a und CD42c klassische Marker der megakaryozytären und Thrombozytenlinien markiert.
Beide Marker wurden von den Zellen der MKp-Population exprimiert und nicht an der Oberfläche der Zellen der MEP-Population nachgewiesen. Der DNA-Gehalt der sortierten Megakaryozyten zeigte, dass die Zellen für die MEP-Population meist 2n sind. Und ein kleiner Teil der MKp-Zellen ist fremd.
Höhere Ploidiezellen wurden in diesen Populationen nicht signifikant nachgewiesen. In halbfesten klonogenen Assays wurde CFU-MK sowohl in MEP- als auch in MKp-Populationen nachgewiesen. BFU-E wurde nicht in der MKp-Population nachgewiesen, sondern in MEP und der CD150-negativen CD9 dim Progenitor-Zellpopulation.
Mikroskopische Beobachtungen am dritten Tag der Differenzierung zeigen, dass MEP und MKp hauptsächlich Megakaryozyten produzierten, die als große Zellen identifiziert wurden. Megakaryozyten, die nach drei Tagen Kultur gewonnen wurden, wurden mittels CD41- und CD42c-Expression identifiziert und repräsentieren 54 bzw. 82% der Zellen, die aus MEP- bzw. MKp-Zellpopulationen hergestellt wurden. Die Ploidie der produzierten Megakaryozyten war aus den Megakaryozyten, die aus der MKp-Population stammen, im Vergleich zur MEP-Population größer.
Nur die Zellen, die aus der MKp-Population stammten, waren in der Lage, Proplatelet-Emissionen durchzuführen, was auf ein fortgeschritteneres Reifestadium für die MKp-Population hindeutet. Die Verwendung des Beckenknochens erhöht sich drastisch auf die Zellzahl, während die zweistufige magnetische Depletion die Wirksamkeit der Lineage-Depletion verbessert. Dieses Protokoll ermöglicht die anschließende Kultur von MEP- und MKP-Populationen einzelner Zellen, die zusammen mit der transkriptomischen und proteomischen Analyse sicherlich die beteiligten Mechanismen entschlüsseln und die Biogenese implementiert haben.
