Bu genleşme mikroskobik protokolü, araştırmacının glomerüler proteinleri geleneksel bir mikroskopta nano ölçekli çözünürlükle görselleştirmesini sağlar. Genişleme mikroskopisinin temel avantajı, büyük bir araştırma topluluğunun erişebileceği olmasıdır. Jelasyon odası için aralayıcılar yaparak başlayın.
Bir numaralı ve 1,5 numaralı cam kapağı elmas bir bıçak kullanarak beş milimetrelik çizgilere bölün. Bir cam kaydırağı bir boyama odasına yerleştirin ve 1,5 numaralı kapak kayma çizgilerini cam kaydırağın üzerine yerleştirin, böylece 2,5 santimetre kare oluştururlar. Pipet, cam kapak kayma çizgilerini birbirine ve cam kaydırağa yapışmak için meydanın köşelerine çift damıtılmış su damlası.
1,5 numaralı kapak fişlerinin dikkatlice tutturulması için yaklaşık 20 dakika bekleyin. Pipet her sayı 1.5 kapak kayma şeridinde bir damla su. 1,5 numaralı kapak fişlerinin üzerine dört adet bir numaralı cam kapak kayması şeridi yerleştirin.
Jelleşme odası kapağı için, filmdeki herhangi bir kıvrım veya kirden kaçınarak parafin filmi ile bir kapak camı sarın. Ankraj tedavisi için PBS'yi bağışıklık lekeli hücrelerden çıkarın ve kuyu başına 250 mikrolitre ankraj tamponu doğrudan cam kapak kaymasına ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında üç saat kuluçkaya yatırın.
Bir kutu kullanarak substratı karanlıkta tutun. İnkübasyondan sonra, ankraj tamponunu çıkarın ve kapak fişini kuyu başına 1,5 mililitre PBS ile bir kez yıkayın. Akrin liflerini lekelemek için EXM uyumlu bir phalloidin çözeltisini çözün ve oda sıcaklığında 45 dakika kuluçkaya bırakın.
Bu arada, sodyum akrilatları karıştırma cihazı kullanarak çift damıtılmış suda çözün ve monomer çözeltisini buz üzerinde hazırlayın. Phalloidin'i hücrelerden çıkarın ve oda sıcaklığında iki kez 1,5 mililitre PBS ile yıkayın. Son yıkamadan sonra kuyuda 1,5 mililitre PBS bırakın.
Kapak camı kaymasını altı kuyu plakasından kaldırmak ve jelasyon odasına yerleştirmek için kümesler ve bir canül kullanın. Jelleşme çözeltisine ve girdabına kısaca APS ekleyin. Pipet Numune üzerinde 200 mikrolitre jelleşme çözeltisi ve jel içindeki hava kabarcıklarını önleyerek odayı dikkatlice kapatın.
Boyama odasına su ekleyin ve jeli polimerize etmek için leke odasını 37 santigrat derecede en az bir saat kuluçkaya bırakın. Leke haznesini inkübatörden çıkar. Jelasyon odası kapağını açmak için, kapak ve aralayıcı arasına bir jilet takın ve kapağı dikkatlice çıkarın.
Aralayıcıları jiletle çıkarın ve tüm ekstra jeli kesin. Jelin kenarlarını ayırmak için bir boya fırçası kullanın. Jel ve kapak camı ile slaytı PBS ile dolu bir tabağa koyun.
Daha sonra kopan kapak camını hafifçe sallayarak jelden çıkarın. Jeli slayda takmak için slaydı jelin altına koyun. Jel slayttayken, jilet kullanarak jeli küçük parçalara bölün.
Bir parça jeli cam tabanlı altı kuyu plakasının kuyusuna hafifçe itin ve bir boya fırçasıyla açın. Jeli az miktarda PBS ile nemlendirmek için boya fırçasını kullanın. Ters mikroskop kullanarak, genişletme öncesi görüntüler için düşük sayısal diyafram açıklığına sahip genel bakış görüntüleri alın.
Sindirim çözeltisini yapmak için proteinaz K'yi sindirim tamponunda mililitre başına dört üniteye seyreltin. Her kuyuya 500 mikrolitre sindirim çözeltisi ekleyin ve jeli çözeltinin içine daldırın. Numuneleri karanlıkta tutmak için kapak kapalıyken oda sıcaklığında gece boyunca sindirin.
Sindirim solüsyonunu bir pipetle çıkarın ve atın. Bir mililitre çift damıtılmış su ekleyin ve daldırılmış jeli oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya bırakın. Suyu çıkarın ve bir mililitre taze, çift damıtılmış su ekleyin.
Bir genişleme platosununa ulaşılana kadar her 10 dakikada bir su alışverişine devam edin ve jelin optik olarak netleşmesine neden olun. Suyu jelden çıkarın ve hemen mikroskopiye başlayın. Ters mikroskop kullanarak, genişleme öncesi durumdaki hücreleri bulmak için düşük büyütmede bir hava hedefi kullanın.
Daha iyi çözünürlük için 40 X ve 63 X hedefine geçin. İlginin dalga boyu ile heyecanlandırın ve görüntüyü kamera üzerinden alın. Bu EXM protokolü dört kata kadar genişleme sağlar.
Genişletme faktörünü belirlemek için genişlemeden önce ve sonra hücreleri görüntüleyesiniz. Yetersiz ankraj ve homojenizasyon hücrelerin bozulmasına ve yırtılmasına yol açabilir. Yırtılmış hücrelerin temsili örnekleri burada gösterilmiştir.
Bu yöntem, podokin ve nefrin gibi F-actin ve akrin adaptör proteinlerinin kolokalizasyonunu araştırmak için kullanılabilir. Podocin yeşil, actin mavi ve nephrin kırmızı ile tasvir edilir. Beyaz alanlar kolokalizasyonu gösterir.
Floresan sinyal yoğunluğu ve bolluğu başarılı EXM için anahtardır. Floresan boyaların ACX üzerinden verimli bir şekilde tutturulduğu bu protokol için kritik öneme sahiptir. Elimizde çözünür ACX üç ila dört aya kadar iyidir.
