هذا البروتوكول المجهري التوسع تمكن المحقق لتصور البروتينات الكبيبية مع دقة النانو على المجهر التقليدي. الميزة الرئيسية للفحص المجهري للتوسع هي أنه متاح لمجتمع بحثي كبير. ابدأ بصنع الفواصل لغرفة الهلام.
قطع رقم واحد ورقم 1.5 غطاء زجاجي ينزلق إلى خمسة خطوط ملليمتر، وذلك باستخدام سكين الماس. ضع شريحة زجاجية في حجرة تلطيخ وضع رقم 1.5 غطاء زلة المشارب على الشريحة الزجاجية، بحيث أنها تشكل مربع 2.5 سم. ماصة قطرة من الماء المقطر مزدوجة في زوايا الساحة على الانضمام إلى غطاء الزجاج زلة المشارب لبعضها البعض وإلى الشريحة الزجاجية.
الانتظار لمدة 20 دقيقة تقريبا بحيث يتم إرفاق عدد 1.5 زلات الغطاء بشكل ثابت. ماصة قطرة من الماء على كل رقم 1.5 غطاء شريط زلة. ضع أربعة رقم واحد الزجاج غطاء زلة المشارب على عدد 1.5 زلات الغطاء.
بالنسبة لغطاء غرفة الهلام ، قم بلف كوب غطاء مع فيلم البارافين ، وتجنب أي طيات أو أوساخ على الفيلم. لترسيخ العلاج، وإزالة برنامج تلفزيوني من الخلايا الملطخة المناعية وإضافة 250 ميكرولتر من مرساة العازلة لكل بئر مباشرة على زلة الغطاء الزجاجي. احتضان لوحة لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة.
إبقاء الركيزة في الظلام باستخدام مربع. بعد الحضانة، قم بإزالة العازلة الرسو وغسل زلة الغطاء مرة واحدة مع 1.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني لكل بئر. لتلطيخ ألياف أكتين، إذابة محلول phalloidin متوافق EXM واحتضانه لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
وفي الوقت نفسه، حل الأكريلات الصوديوم في الماء المقطر مزدوجة باستخدام جهاز اثارة وإعداد محلول مونومر على الجليد. إزالة phalloidin من الخلايا وغسلها مع 1.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني، مرتين، في درجة حرارة الغرفة. ترك 1.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني داخل البئر بعد غسل الماضي.
استخدام ملقط وقنية لرفع الغطاء زلة الزجاج من لوحة البئر الستة ووضعها في غرفة الهلام. إضافة APS إلى حل هلام ودوامة لفترة وجيزة. Pipette 200 ميكرولتر من حل هلام على العينة وإغلاق بحذر الغرفة، وتجنب فقاعات الهواء داخل هلام.
إضافة الماء إلى غرفة تلطيخ، واحتضان غرفة تلطيخ لمدة ساعة واحدة على الأقل في 37 درجة مئوية لبوليمرة هلام. أخرج غرفة التلطيخ من الحاضنة لفتح غطاء غرفة الهلام، أدخل شفرة حلاقة بين الغطاء والمتباعد، وأزل الغطاء بحذر.
إزالة الفواصل مع شفرة الحلاقة وقطع كل هلام اضافية. استخدام فرشاة الطلاء لفصل حواف هلام. وضع الشريحة مع هلام وتغطية الزجاج في طبق مليء برنامج تلفزيوني.
ثم قم بإزالة زجاج الغطاء المنفصل من الجل عن طريق هزه بلطف. ضع الشريحة أسفل الجل لإرفاق الجل بالشريحة. مع الجل على الشريحة، وتقسيم هلام إلى قطع صغيرة باستخدام شفرة الحلاقة.
دفع بلطف قطعة واحدة من هلام في بئر من لوحة بئر ستة مع أسفل الزجاج وتكشف مع فرشاة. استخدام فرشاة الطلاء للحفاظ على هلام مبللة مع كمية صغيرة من برنامج تلفزيوني. باستخدام المجهر المقلوب، يمكنك التقاط صور عامة ذات فتحة رقمية منخفضة لصور ما قبل التوسع.
تمييع البروتين K إلى أربع وحدات لكل ملليلتر في العازلة الهضم لجعل حل الهضم. إضافة 500 ميكرولتر من محلول الهضم لكل بئر، وتزج هلام داخل الحل. السماح لها هضم بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة مع غطاء مغلق للحفاظ على العينات في الظلام.
إزالة محلول الهضم مع ماصة والتخلص منه. أضف ملليلتر واحد من الماء المقطر المزدوج واحتضن الجل المغمور لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة الماء وإضافة ملليلتر واحد من الماء المقطر الطازجة، مزدوجة.
استمر في تبادل المياه كل 10 دقائق حتى يتم الوصول إلى هضبة من التوسع ، مما تسبب في أن يصبح الجل واضحا بصريا. إزالة الماء من الجل والبدء فورا المجهر. باستخدام المجهر المقلوب، استخدم هدف الهواء عند التكبير المنخفض للعثور على خلايا في حالة ما قبل التوسع.
قم بالتبديل إلى أهداف 40 X و 63 X للحصول على دقة أفضل. تثير مع الطول الموجي للاهتمام واتخاذ الصورة عبر الكاميرا. يمكن هذا البروتوكول EXM توسيع يصل إلى أربعة أضعاف.
لتحديد عامل التوسع من الضروري تصوير الخلايا قبل وبعد التوسع. قد يؤدي عدم كفاية الرسو والتجانس إلى تشوهات وتمزقات في الخلايا. وترد هنا أمثلة تمثيلية لتمزق الخلايا.
ويمكن استخدام هذه الطريقة للتحقيق في كولوكاليس من F-أكتين والبروتينات محول أكتين, مثل بودوسين والنيفرين. يصور بودوسين باللون الأخضر، والأكاتين باللون الأزرق، والنيفرين باللون الأحمر. تشير المناطق البيضاء إلى التكون.
كثافة إشارة الفلورسنت ووفرة هي المفتاح لنجاح EXM. إن الإرساء الفعال للأصباغ الفلورية عبر ACX له أهمية حاسمة لهذا البروتوكول. في أيدينا مشحم ACX هو جيد لمدة تصل إلى ثلاثة إلى أربعة أشهر.
