使用扩张显微镜对波多细胞蛋白尼腓林、阿克汀和波多辛的成像

这种扩展显微协议使研究者能够在传统的显微镜上用纳米尺度分辨率可视化球状蛋白质。扩展显微镜的主要优点是大型研究社区能够访问显微镜。首先为凝胶室制作垫片。

使用钻石刀将一号和 1.5 号玻璃盖切成 5 毫米条纹。将玻璃滑梯放入染色室，并将 1.5 号盖滑条纹放置在玻璃滑梯上，形成 2.5 厘米的正方形。将一滴双蒸馏水放入广场的角落，将玻璃盖滑条粘在彼此之间和玻璃滑梯上。

等待约 20 分钟，以便稳定地附加数字 1.5 盖单。每个编号 1.5 盖滑条纹上都有一滴水。将四个头号玻璃盖滑条放在 1.5 号盖滑上。

对于凝胶室盖，用石蜡膜包裹盖玻璃，避免薄膜上的任何褶皱或污垢。用于锚定处理，从免疫染色细胞中取出 PBS，并将每口井的锚定缓冲器加入 250 微升，直接固定在玻璃盖滑上。在室温下将盘子孵化三小时。

使用盒子将基板保持在黑暗中。孵化后，取下锚定缓冲器，用每口井 1.5 毫升 PBS 清洗盖滑一次。要染色 actin 纤维，解冻与 EXM 兼容的 phalloidin 溶液，并在室温下孵育 45 分钟。

同时，使用搅拌装置将丙烯酸钠溶解在双蒸馏水中，并在冰上制备单体溶液。从细胞中取出法罗丁，在室温下用1.5毫升PBS清洗两次。上次洗涤后，将 1.5 毫升 PBS 留在井内。

使用钳子和管子将盖玻璃从六个井板上滑落，放入凝胶室。将 APS 添加到凝胶溶液和涡流中。派珀特200微升凝胶溶液在样品上，并谨慎地关闭腔室，避免凝胶内的气泡。

将水加入染色室，并在37摄氏度下将染色室孵育至少一小时，使凝胶聚合。将染色室从孵化器中取出。要打开凝胶室盖，在盖子和垫片之间引入剃须刀刀片，并小心地取下盖子。

用剃须刀刀片取出隔间，并切断所有额外的凝胶。使用油漆刷分离凝胶的边缘。将滑梯与凝胶和盖玻璃放入装满 PBS 的盘中。

然后轻轻摇动凝胶，从凝胶中取出分离的盖玻璃。将滑梯放在凝胶下面，将凝胶连接到滑梯上。在滑梯上使用凝胶，使用剃须刀刀片将凝胶分成小块。

轻轻将一块凝胶推入六井板的井中，用玻璃底展开，然后用画笔展开。使用画笔保持凝胶与少量PBS保湿。使用倒置显微镜，对扩展前的图像进行数字光圈低的概述图像。

在消化缓冲液中将蛋白酶 K 稀释到每毫升 4 个单位，以制作消化溶液。将消化溶液的 500 微升添加到每口井中，并将凝胶浸入溶液中。让它在室温下消化过夜，盖子关闭，使样品保持在黑暗中。

用移液器取出消化液并丢弃。加入一毫升双蒸馏水，在室温下将浸入式凝胶孵化10分钟。取出水，加入一毫升新鲜的双蒸馏水。

每 10 分钟继续交换一次水，直到达到膨胀的高原，使凝胶变得光学清晰。从凝胶中取出水，立即开始显微镜检查。使用倒置显微镜，使用低倍率的空气目标来查找处于膨胀前状态的细胞。

切换到 40 X 和 63 X 目标以获得更好的分辨率。兴奋的兴趣波长，并通过相机拍摄图像。此 EXM 协议可扩展至多四倍。

要确定扩展因子，在扩展前后对细胞进行成像至关重要。锚定不足和均质化可能导致细胞失真和破裂。此处显示了细胞破裂的代表性示例。

这种方法可用于研究F-actin和作用适配蛋白的同位素化，如波多辛和肾上腺素。波多辛描绘为绿色，蓝色为行动，肾上腺素为红色。白色区域表示同位化。

荧光信号强度和丰度是成功 EXM 的关键。通过 ACX 高效锚定荧光染料对于此协议至关重要。在我们手中溶解的ACX是好长达三到四个月。