Bu protokol, çoğu özofagus gelişim biyolojisi laboratuvarında uygulanabilir ve süper çözünürlüklü mikroskoplara erişimi olmayan araştırmacıların süper çözünürlüklü görüntüler üretmesine olanak tanır. Bu tekniğin temel avantajı, araştırmacıların, numunenin kendisini genişleterek süper çözünürlüklü bir mikroskop gerektirmeden geleneksel konfokal mikroskopinin kırınım sınırını atlamasına izin vermesidir. Bu protokol, protein lokalizasyonunun hücre morfolojisini nasıl etkilediğini veya bozulmamış embriyolarda, özellikle de bu proteinler karmaşık hücre altı yapılar veya ağlar halinde organize edildiğinde işlev gördüğünü inceleyenler için faydalı olacaktır.
İnsanların karşılaştığı en yaygın sorun, protokol boyunca embriyoları kaybetmektir. Embriyoları sıkıca yapıştırmak için birden fazla kat Poli-L-Lizin uygulanması tavsiye edilir. Embriyolardan sonra, yarısı% 3 agar ile doldurulmuş altı santimetrelik plastik bir Petri kabı tabanı alın.
Bir tıraş bıçağı veya neşter ile agarda beşe üç santimetrelik bir dikdörtgen çizin. Küçük bir laboratuvar spatulası kullanarak agar levhasını çıkarın. Ardından Petri kabının tabanını ters çevirin, tezgahın üzerine koyun ve agar levhasını ters çevrilmiş kabın üzerine yerleştirin.
Petri kabının kapağını çıkarın ve kuru olduğundan emin olun. Eldiven kullanarak, kapağın içine bir parça çift taraflı bant yapıştırın. Kaplanmış ve sabitlenmiş embriyoları içeren şişeleri çalkalayıcıdan çıkarın ve tezgahın üzerine dikey olarak yerleştirin.
Organik ve sulu fazların ayrılmasına izin verin. Düzgün bir şekilde sabitlenmiş embriyolar arayüzlerinde kalmalıdır. Bir Pasteur pipeti ve bir P200 pipeti kullanarak alt sulu fazı tamamen çıkarın.
Sabitlenmiş embriyoları, pipetin içine yapışmamaları için birden fazla küçük parti halinde bir agar levhasına aktarmak için lateks ampulle donatılmış bir cam Pasteur pipeti kullanın. Embriyolar agar levhasına girdikten sonra, embriyoların yakınında kalan heptanı çıkarmak için bir P200 pipetleyici kullanın. Şimdi, embriyoları banda yapıştırmak için çift taraflı bant kapağını iki santimetre yükseklikten agar levhasının üzerine bırakın.
Kapağı agar levhasından nazikçe çıkarın, tezgahın üzerine baş aşağı yerleştirin ve kapaktaki embriyoları kaplayacak kadar PBS Tween ekleyin. İstenilen embriyoları toplamak için, dolaylı aydınlatma ile 100x büyütmede bir stereo diseksiyon mikroskobu kullanın. Embriyonun ön veya arka ucuna yakın vitellin zarını söndürmek ve basıncı serbest bırakmak için ince bir cam iğne ile delin.
Vitellin zarı hala çift taraflı banda yapışıkken embriyoyu delikten nazikçe dışarı itmek için ince forseps veya metal bir prob kullanın. İstenmeyen embriyoları bantta bırakın. Yüzen devitellinize embriyoları toplamak ve bunları 1.5 mililitrelik bir mikrofüj tüpüne taşımak için periyodik olarak bir cam Pasteur pipeti kullanın.
PDMS çözeltisini 50 mililitrelik konik bir tüpte hazırlayın ve ikinci bir 50 mililitrelik konik tüpe uygun miktarda su ekleyerek dengeli bir tüp oluşturun. PDMS çözeltisini 500G'de 15 santigrat derecede üç dakika santrifüjleyin. Daha sonra 10 santimetrelik bir Petri kabına bir milimetre derinliğe dökün.
PDMS çözeltisinin gece boyunca 55 santigrat derecede katılaşmasına izin verin. PDMS levhası katılaştıktan sonra, bir neşter kullanarak 22 x 22 milimetrelik bir örtü kaymasından biraz daha küçük kare alanlar çizin. Her karenin içinde, sekiz milimetre genişliğinde bir kare kuyuyu puanlayın ve çıkarın.
her kare PDMS'yi 22 x 22 milimetrelik bir kapak kızağına iyice aktarın ve sıkıca yapıştırın. Embriyoları lamellere yapıştırmak için, her bir oyuğun içindeki kapak kayma yüzeyini kaplayacak kadar% 0.1 Poli-L-Lizin uygulayın ve kuruması için 55 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Tween deterjanını çıkarmak için embriyoları ve PBS'yi kısaca durulayın.
Daha sonra 10'dan fazla embriyoyu kaplanmış her bir Poli-L-Lizin kuyusuna aktarın. Embriyoların kuyucukların dibine yerleşmesine izin verin. Bir Pasteur pipeti kullanarak yapışan embriyolardan fazla sıvıyı çıkarın ve hemen bir sonraki adıma geçin.
Embriyolar monomer çözeltisinde otururken, PDMS kuyucuklarını örtmek için bir jelleşme çözeltisi hazırlayın. Katalitik oksidanı tozdan taze olarak seyreltin. 3.920 mikrolitre monomer çözeltisini 60 mikrolitre %10 TEMED ve 20 mikrolitre %1 TEMPO ile birleştirin.
Jelasyon çözeltisini 125 mikrolitrelik alikotlarda çoklu PCR tüplerine bölün. Embriyoları bozmamaya dikkat ederken bir vakum veya pipetleyici kullanarak monomer solüsyonunu PDMS kuyucuklarından çıkarın. Polimerizasyonu başlatmak için jelleşme çözeltisi içeren PCR tüplerinden birine beş mikrolitre APS ekleyin.
Polimerize jelleşme çözeltisini üç kuyucuk arasında hızla dağıtın. Tüm kuyucuklar ve embriyolar kaplanana kadar bunu tekrarlayın. Numunelerin 37 santigrat derecede 1,5 ila 2,5 saat jelleşmesine izin verin.
Daha kalın hidrojellerin polimerizasyonu tamamlaması ve katılaşması daha uzun sürecektir. Polimerizasyonu izlemek için hidrojelleri sık sık çalkalayın. Katılaştıktan sonra hidrojeller kıpırdamaz.
Jelleşmeden sonra, hidrojelleri bozmadan PDMS kuyucuklarını kapak kızağından soyun. Hidrojelleri ayrı ayrı altı oyuklu bir plakanın kuyularına aktarın. Hidrojeller sindirim sırasında hafifçe genişleyebilir.
Jelleri tamamen sindirim tamponu ile örtün. 30 mililitre sindirim tamponu, onları altı oyuklu bir plakada kaplamak ve 37 santigrat derecede bir saat inkübe etmek için yeterlidir. Sindirimden sonra, hidrojelleri altı santimetrelik bir Petri kabına taşıyın ve genişlemesi için deiyonize suyla doldurun.
Hidrojeller bu noktada örtü kızaklarından ayrılabilir ve doğrusal boyutta dört kat genişleyebilir. Bir Pasteur pipeti kullanarak, jellerin kullanıldığında hareketini en aza indirmek için Petri kabından mümkün olduğunca fazla suyu alın. Genişletilmiş jelleri, alt yüzeydeki embriyolarla görüntüleme için büyük bir kapak fişi üzerine manevra yapın.
Her bir kapak fişini jel ile ters çevrilmiş bir lazer taramalı konfokal mikroskobun objektifi üzerine monte edin. Düzgün bir şekilde yerleştirilmiş ve yönlendirilmiş numuneleri bulduktan sonra, yüksek çözünürlükte görüntü almak için yüksek büyütmeli yağ veya suya daldırma hedefine geçildi. 10x objektif altında baştan kuyruğa eksen boyunca embriyo uzunluğunun ölçülmesi, genişlememiş embriyoların bir görüş alanının yaklaşık yarısını kapladığını, genişlemiş embriyoların ise yaklaşık iki tam görüş alanını kapsadığını gösterdi.
Genleşmemiş kontrol embriyolarının ortalama baş-kuyruk uzunluğu 398.8 mikrometre idi. Bir, iki ve üçüncü deneyler için ortalama embriyo uzunlukları sırasıyla 4.0 kat, 4.7 kat ve 4.9 kat genişleme faktörleriydi. Kontrol örneğinde, maksiller segmentteki hücrelerin ortalama genişliği 4.76 mikrometredir.
Genişletilmiş örneklerde, maksiller segmentteki hücreler, 4.0 kat genişlemeyi temsil eden ortalama 19.10 mikrometre genişliğe sahipti. Aktomiyosin hücre iskeleti, yakınsak genişleme geçiren genişlemiş embriyolara karşı genişlememiş kontrolde görüntülendi. Komşu hücrelerin buluştuğu tek bir çizgi olarak ortaya çıktılar.
Buna karşılık, genişletilmiş evre yedi embriyolarda, bitişik hücrelerdeki kortikal protein havuzlarını temsil eden hücre hücre bağlantılarında paralel miyozin iki çizgileri gözlenebilir. Genişlemiş olmayan altıncı aşama embriyolarında, streptavidin ile etiketlenmiş mitokondri, net bir hücre altı detayı olmayan heterojen bir sitoplazmik pus olarak ortaya çıktı. Bununla birlikte, genişlemiş embriyolarda, muhtemelen parçalanmış mitokondriyi veya mitokondriyal ağın bölümlerini temsil eden sitoplazma içinde çok sayıda punkta çözülebilirdi.
Bu prosedürü denerken hatırlanması gereken önemli bir şey, ikincil antikor inkübasyonundan sonra embriyoları aşırı ışığa maruz kalmaktan korumaktır.
