M.Z. ve K.S.F. ve bu çalışma, Pittsburgh Üniversitesi Klinik ve Çeviri Bilimi Enstitüsü aracılığıyla Pitt Innovation Challenge (PInCh) kapsamında verilen bir hibe ve M.Z'ye verilen NHLBI R01 hibesi HL153407 ile desteklendi.

Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi, bu hayvan deneylerinden herhangi birini üstlenmeden önce bu yayında belirtilen tüm hayvan protokollerini onayladı.
NOT: Bu protokol, çift modlu SPECT/CT tarayıcı ile radyonüklid görüntüleme kullanılarak in vivo mukozit temizleme çalışmalarının nasıl gerçekleştirildiğini detaylandırmamaktadır. Gösterilen teknikler sistem kalibrasyonları, uyuşturma fareleri, farelerin trakeal entübasyonu, izotopun akciğerlere aşılanması, çift modalite görüntüleme, bu görüntülerin birlikte kaydedilmesi ve analizdir.
1. SPECT/CT sistem kurulumu
<ol><li>Uygun bir iş akışı tasarlayın ve canlı hayvanları kullanarak deneyler yapmadan önce ayarlayın.<ol>
<li>40 cm dönüş yarıçapına sahip projeksiyonlar arasında adım boyutu 6o olan 60 projeksiyondan oluşan bir SPECT alımı kullanın. CT alımı, projeksiyonlar arasında 1,6o açıya sahip 220 projeksiyondan oluşur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sistemin fareler ve SPECT görüntüleme için doğru MWB kolimatörlerine sahip olduğundan emin olun. Uygun olmayan kolimatörler yüklüyse, doğru olanları yüklemek için kolimatör sihirbazını kullanın.</li>
	<li>Sistemi kullanıma hazırlamak için gerekli sistem kalibrasyonlarını çalıştırın. NOT: Tarayıcının SPECT ve CT bileşenlerinin kalibrasyona ihtiyacı vardır. CT bileşenlerini günde bir kez kaynak koşullandırma ve Koyu/Açık (D/L) kalibrasyon, 2 haftada bir Merkez Ofset (COS) kalibrasyonu kullanarak kalibre edin ve x-ray donanımını her ay değerlendirin. SPECT bileşenlerinin yılda bir kez kalibre edilmesi gerekir.<ol>
<li>X-ray donanımını değerlendirmek için CT kalibrasyonları sırasında X-ışını donanımını değerlendir kutusunu işaretleyin(Ek CT Kalibrasyon Menüsü).</li>
		<li>Kaynak koşullandırmasını gerçekleştirmek için CT kalibrasyonları sırasında kaynak koşullandırmayı gerçekleştir kutusunu işaretleyin(Ek CT Kalibrasyon Menüsü).</li>
		<li>D/L kalibrasyonu gerçekleştirmek için, CT kalibrasyonları sırasında denemeler sırasında kullanılan CT alım protokolünün yanındaki D/M kutusunu işaretleyin. Diğer tüm protokollerin işaretini kaldırın (Ek CT Kalibrasyon Menüsü).</li>
		<li>COS kalibrasyonu gerçekleştirmek için yatağı kalibrasyon halkası aracıyla değiştirin, yatak tipi ayarlarını hareket kontrol ayarlarında eşleşecek şekilde ayarlayın ve CT kalibrasyonları sırasında denemeler sırasında kullanılan CT alım protokolünün yanındaki COS kutusunu işaretleyin. Diğer tüm protokollerin işaretini kaldırın(Ek CT Kalibrasyon Menüsü, Ek Kalibrasyon Halkası).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Fare Entübasyonu ve Aşılama
<ol><li>Taranacak fareleri tartın. Birden fazla fareyi tarıyorsanız, kulak delme veya kuyruğun işaretlenmesi gibi yöntemleri kullanarak fareleri tanımlama amacıyla işaretlemeye özen edin.</li>
	<li>Nefes almak dakikada ~55-65 nefese kadar yavaşlayınçaya kadar yeterli derinlikte anestezi üretmek için bir gaz odasında~5 dakika boyunca 2 L / dk O 2 gaz akışı ile% 1.5 izofluran kullanarak bir fareyi uyuşturun 16 (Şekil 1A).</li>
	<li>Fareyi odadan çıkarın ve 45 o eğimdeki entübasyon standında ön kesici dişlerdenaskıya alın. Entübasyon sırasında farenin uyuşturulmasını sağlamak için entübasyon standını bir burun konisi ile donatın (Şekil 1B).</li>
	<li>50 μm fiber optik telin bir ucunu bir ışık kaynağına bağlayın ve kılavuz görevi görmek için teli kullanarak üzerine 20 kalibrelik bir ampul geçirin (Şekil 1C).</li>
	<li>Farenin ağzını açın ve künt forseps kullanarak dili öne doğru çekin. Kılavuz teli aydınlatın ve ses tellerini görselleştirmek için kullanın (Şekil 1D).</li>
	<li>Kılavuz teli ses tellerinden geçirin, böylece tel ses tellerinin hemen ötesinde ve üst nefes borusunda dinlenir. Fareyi entübe etmek için 1 inçlik kanı tel boyunca ileri doğru kaydırın, kanı yeterince derine geçirin, böylece göbeği hayvanın kesici dişlerine karşıdır (Şekil 1E). Canülleri yerinde bırakarak teli çıkarın.</li>
	<li>Kanülü bir parmakla kısa bir süre takarak ve nefes almadaki değişiklikleri kontrol ederek entübasyonu test edin. Tıkanırken solunumun durması veya nefes almanın zorlanması ve serbest bırakıldığında hızlandırılmış solunum, uygun trakeal entübasyon belirtileridir. Canül takıldıktan sonra solunum modellerinde bir değişiklik yoksa, ikincisi yemek borusunda muhtemeldir.</li>
	<li>10 μL hacimde 0,2 mCi 99mtechnetium-kükürt kolloid (99m Tc-Sc) hazırlayın ve pipeti canüle alın. Farenin 1-2 dakika boyunca akciğerlere kendiliğinden solumasına izin verin(Şekil 1F). Fareyi tarayıcının paletine aktarmadan önce tarayısı çıkarın. NOT: Radyonüklid Kardinal Sağlık tarafından hazırlandı ve filtrelendi.</li>
</ol>3. SPECT/CT Görüntüleme
<ol><li>Fareyi burun konisi ile 25 mm'lik bir palete aktarın ve bantla sabitleyin, solunumu bozmamak için göğsü ve karnı çok sıkı bantlamamaya dikkat edin. Fareye bağlı metal kulak etiketlerini çıkarmaya özen göster.</li>
	<li>200 μL'de 0,05 mCi'den oluşan bir radyoaktif fantom hazırlayın ve bu miktarı 0,2 mL PCR tüpüne yerleştirin. Tüpü, farenin alt karnının altındaki palete bantlayarak, akciğerlerle çakışmayı önleyerek yerleştirin. NOT: Hayalet, CT ve SPECT görüntülerinin birlikte kaydedilmesinin yanı sıra boşluk için negatif bir kontrol amacıyla kullanılır.</li>
	<li>Fareyi SPECT/CT sistemine yerleştirin, görüntüleme iş akışını seçin ve Kur 'u çalıştırın.</li>
	<li>Dedektörlerin fare üzerindeki konumunu ayarlayın ve görüntüleme iş akışını çalıştırın.</li>
	<li>İşlem sonrası radyoaktivite alan fareler için yiyecek ve suya sınırsız erişime sahip bir kafes hazırlayın ve radyasyon güvenliği etiketi kullanarak etiketlemeyi temizleyin.</li>
	<li>İş akışı tamamlandıktan sonra, fareyi görüntüleme paletinden çıkarın ve hazırlanan kafeste taramalar arasında 6 saat boyunca (tarama 1 ila tarama 2'nin başlangıcı) yiyecek ve suya reklam libitum erişimi ile iyileşmesine izin verin. 6 saat, cilia fonksiyonuna bağlı olarak doğrusal boşluğun çok az alveolar boşlukla gerçekleştiği zaman dilimine karşılık geldiği için seçildi.</li>
	<li>6 saat sonra, fareyi yeniden uyuşturun ve hayaletle birlikte, hava yollarından temizlenen izotop miktarını ölçmek için aynı iş akışını kullanarak tarayın. NOT: Farenin 6 saat boyunca izofluran ile kesintisiz anestezi olarak iyileşmesine izin vermek, neredeyse sıfır mukozal boşlukla sonuçlanan önemli bir cilia-depresan etkisine yol açacaktır.</li>
</ol>4. Analiz
<ol><li>Görüntülemeden sonra, tam 3D yığın görüntülerini yeniden oluşturmak için işlem sonrası gerçekleştirin.<ol>
<li>Spect görüntülerini 99mTc için fabrika standart ayarlarını kullanarak histogramlayın ve ardından bir MAP3D algoritması ve nokta yayma işlevi (PSF) rekonstrüksiyonu kullanarak yeniden oluşturun. NOT: Yeniden yapılandırma 8 yineleme ve 6 alt küme kullanılarak gerçekleştirildi. Etkili bir yeniden yapılandırma, alt kümelerin 1:10'daki projeksiyonlara oranına veya projeksiyon sayısına eşit olarak bölünmesine ihtiyaç duyar, bu nedenle 60 projeksiyon kullanılarak elde edilmesi nedeniyle 6 alt küme kullanılmıştır.</li>
		<li>CT görüntülerini Feldkamp algoritması ve Shepp-Logan filtresi kullanarak yeniden yapılandırın. NOT: Yeniden yapılandırma 4 yineleme kullanılarak gerçekleştirildi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Varsayılan eksenel görüntülerden koronal görünüm görüntüleri oluşturmak için reslice aracını kullanarak FIJI ImageJ21'deki CT ve SPECT görüntülerini işleyin. Ardından, her dilimden sayım verilerini eklemek ve analiz kolaylığı için tek bir görüntü oluşturmak için SPECT görüntüsünde bir z yığını toplam projeksiyonu gerçekleştirin.</li>
	<li>Referans olarak hayalet Eppendorf tüpünü kullanarak CT ve SPECT görüntülerini yeniden boyutlandırın ve birlikte kaydedin (Şekil 2A,B). Tüm numunelerde tutarlı yeniden boyutlandırma ölçümlerini izleyin ve kullanın.</li>
	<li>Ct görüntüsünü otomatik eşik kullanarak binarize edin, ardından yığını ters çevirin ve analiz için akciğerlerin anahattını oluşturmak için z yığını toplam projeksiyonu gerçekleştirin (Şekil 2C).</li>
	<li>CT ve SPECT görüntülerini döndürün ve kanal araçlarını kullanarak görüntüyü birleştirin. Sağ akciğerin etrafına bir yatırım getirisi çizerek ve ölçerek MCC'yi hesaplayın (Şekil 2D). NOT: Bu ölçüm, 0 ve 6 saatlik zaman noktaları için sağ akciğerdeki toplam sayımlardan olacak ve 6 saatlik görüntüler radyoaktif bozunma için aşağıdaki formül kullanılarak düzeltilecektir: N(t) = N0e−t. 99m Tc-Sc, ~6 saatlik yarı ömrü ile saniyede 3,21e−5 çürüme sabitine sahiptir. Bu değerler daha sonra bir yüzde boşluğu hesaplamak için kullanılabilir. NOT: Mukoza boşluğu radyoizotopu akciğerlerden farenkse yutulacağı yerden taşıyacak ve mideye düşeceğinden, yatırım getirisi çizimi ve ölçüm sayıları için sağ akciğer seçilir. Midede oldukça sık sol akciğerle örtüşebilecek ve bu nedenle hatalı sayımlar üretebilecek sayımlar görülebilir. Bu kafa karıştırıcı sadece sağ akciğerdeki sayımlar ölçülerek önlenebilir.</li>
</ol>

<ol><li>Afzelius, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia-related+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Cilia-related diseases.</a> Journal of Pathology. 204 (4), 470-477 (2004).</li>
<li>Mitchell, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+eukaryotic+cilia+and+flagella+as+motile+and+sensory+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">The evolution of eukaryotic cilia and flagella as motile and sensory organelles.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 607, 130-140 (2007).</li>
<li>Carvalho-Santos, Z., Azimzadeh, J., Pereira-Leal, J. B., Bettencourt-Dias, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution%3A+Tracing+the+origins+of+centrioles%2C+cilia%2C+and+flagella%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolution: Tracing the origins of centrioles, cilia, and flagella.</a> Journal of Cell Biology. 194 (2), 165-175 (2011).</li>
<li>Randell, S. H., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((University+of+North+Carolina+Virtual+Lung%2C+G.+Effective+mucus+clearance+is+essential+for+respiratory+health%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">University of North Carolina Virtual Lung, G. Effective mucus clearance is essential for respiratory health.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 35 (1), 20-28 (2006).</li>
<li>Wanner, A., Salathe, M., O'Riordan, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucociliary+clearance+in+the+airways%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mucociliary clearance in the airways.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 154, Pt 1 1868-1902 (1996).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+genetic+analysis+in+mice+unveils+central+role+for+cilia+in+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global genetic analysis in mice unveils central role for cilia in congenital heart disease.</a> Nature. 521 (7553), 520-524 (2015).</li>
<li>Zahid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+ciliary+dysfunction+and+respiratory+symptoms+in+patients+with+transposition+of+the+great+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Airway ciliary dysfunction and respiratory symptoms in patients with transposition of the great arteries.</a> PLoS One. 13 (2), 0191605(2018).</li>
<li>Stewart, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+ciliary+dysfunction%3A+Association+with+adverse+postoperative+outcomes+in+nonheterotaxy+congenital+heart+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Airway ciliary dysfunction: Association with adverse postoperative outcomes in nonheterotaxy congenital heart disease patients.</a> Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (2), 755-763 (2018).</li>
<li>Garrod, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+ciliary+dysfunction+and+sinopulmonary+symptoms+in+patients+with+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+American+Thoracic+Society%22%5BJournal%5D)">Airway ciliary dysfunction and sinopulmonary symptoms in patients with congenital heart disease.</a> Annals of the American Thoracic Society. 11 (9), 1426-1432 (2014).</li>
<li>Harden, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+postoperative+respiratory+complications+in+heterotaxy+congenital+heart+disease+patients+with+respiratory+ciliary+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Increased postoperative respiratory complications in heterotaxy congenital heart disease patients with respiratory ciliary dysfunction.</a> Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 147 (4), 1291-1298 (2014).</li>
<li>Leigh, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+genetic+aspects+of+primary+ciliary+dyskinesia%2FKartagener+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clinical and genetic aspects of primary ciliary dyskinesia/Kartagener syndrome.</a> Genetics in Medicine. 11 (7), 473-487 (2009).</li>
<li>Donaldson, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ivacaftor+on+mucociliary+clearance+and+clinical+outcomes+in+cystic+fibrosis+patients+with+G551D-CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Effect of ivacaftor on mucociliary clearance and clinical outcomes in cystic fibrosis patients with G551D-CFTR.</a> JCI Insight. 3 (24), (2018).</li>
<li>Donaldson, S. H., Corcoran, T. E., Laube, B. L., Bennett, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucociliary+clearance+as+an+outcome+measure+for+cystic+fibrosis+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+American+Thoracic+Society%22%5BJournal%5D)">Mucociliary clearance as an outcome measure for cystic fibrosis clinical research.</a> Proceedings of the American Thoracic Society. 4 (4), 399-405 (2007).</li>
<li>Ledowski, T., Hilmi, S., Paech, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchial+mucus+transport+velocity+in+patients+receiving+anaesthesia+with+propofol+and+morphine+or+propofol+and+remifentanil%5BTitle%5D)+AND+%22Anaesthesia%22%5BJournal%5D)">Bronchial mucus transport velocity in patients receiving anaesthesia with propofol and morphine or propofol and remifentanil.</a> Anaesthesia. 61 (8), 747-751 (2006).</li>
<li>Donnelley, M., Morgan, K. S., Siu, K. K., Parsons, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dry+deposition+of+pollutant+and+marker+particles+onto+live+mouse+airway+surfaces+enhances+monitoring+of+individual+particle+mucociliary+transit+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Synchrotron+Radiation%22%5BJournal%5D)">Dry deposition of pollutant and marker particles onto live mouse airway surfaces enhances monitoring of individual particle mucociliary transit behaviour.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 19, Pt 4 551-558 (2012).</li>
<li>Christopher, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+temperature+and+anesthetic+agents+on+ciliary+function+in+murine+respiratory+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">The effects of temperature and anesthetic agents on ciliary function in murine respiratory epithelia.</a> Frontiers in Pediatrics. 2, 111(2014).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+quantitative+study+of+airway+functional+microanatomy+using+micro-optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography.</a> PLoS One. 8 (1), 54473(2013).</li>
<li>Lam, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+6-mediated+selective+autophagy+regulates+COPD-associated+cilia+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase 6-mediated selective autophagy regulates COPD-associated cilia dysfunction.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5212-5230 (2013).</li>
<li>Bhashyam, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pilot+study+to+examine+the+effect+of+chronic+treatment+with+immunosuppressive+drugs+on+mucociliary+clearance+in+a+vagotomized+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A pilot study to examine the effect of chronic treatment with immunosuppressive drugs on mucociliary clearance in a vagotomized murine model.</a> PLoS One. 7 (9), 45312(2012).</li>
<li>Ortiz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Mucociliary+Clearance+by+Three+Dimension+Micro-CT-SPECT+in+Guinea+Pig%3A+Role+of+Bitter+Taste+Agonists%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Mucociliary Clearance by Three Dimension Micro-CT-SPECT in Guinea Pig: Role of Bitter Taste Agonists.</a> PLoS One. 11 (10), 0164399(2016).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Solomon, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+ciliary+phenotype+in+primary+ciliary+dyskinesia+by+micro-optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Assessment of ciliary phenotype in primary ciliary dyskinesia by micro-optical coherence tomography.</a> JCI Insight. 2 (5), 91702(2017).</li>
<li>Nakhleh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+prevalence+of+respiratory+ciliary+dysfunction+in+congenital+heart+disease+patients+with+heterotaxy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">High prevalence of respiratory ciliary dysfunction in congenital heart disease patients with heterotaxy.</a> Circulation. 125 (18), 2232-2242 (2012).</li>
<li>Whaley, S. L., Renken, S., Muggenburg, B. A., Wolff, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+for+aerosol+deposition+restricted+to+the+nose+in+beagle+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Toxicology+and+Environmental+Health%22%5BJournal%5D)">Technique for aerosol deposition restricted to the nose in beagle dogs.</a> Journal of Toxicology and Environmental Health. 23 (4), 519-525 (1988).</li>
<li>Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodology+for+the+measurement+of+mucociliary+function+in+the+mouse+by+scintigraphy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy.</a> Journal of Applied Physiology. 90 (3), 1111-1117 (2001).</li>
<li>Bhashyam, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vagal+control+of+mucociliary+clearance+in+murine+lungs%3A+a+study+in+a+chronic+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Autonomic+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Vagal control of mucociliary clearance in murine lungs: a study in a chronic preparation.</a> Autonomic Neuroscience. 154 (1-2), 74-78 (2010).</li>
<li>Van Audenhaege, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+SPECT+collimator+selection%2C+optimization%2C+and+fabrication+for+clinical+and+preclinical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Physics%22%5BJournal%5D)">Review of SPECT collimator selection, optimization, and fabrication for clinical and preclinical imaging.</a> Medical Physics. 42 (8), 4796-4813 (2015).</li>
</ol>

Bu işle ilgili değil.

Hareketli solunum cilia'nın hem hastalık hem de gelişimdeki rolü gelişmeye ve daha iyi takdir olmaya devam ediyor. Trakeobronşiyal ağacı astarlayan hücrelerin apikal yüzeyinde birden fazla motile cilia'nın senkron, metakronal dövülmesi, mukozal boşluk veya MCC üreten sefalad akışı oluşturur. MCC, PCD22, KOAH18gibi edinilmiş hastalıklar gibi ciliopatilerde tehlikeye girer ve önemi geleneksel olarak ciliopati olarak kabul edilmeden CHD'lerde tanınmaktadır. Son veriler hem HETEROTAKSİ23 hem de heterotaksi7olmadan hem CHD'de solunum siliary disfonksiyonu göstermiştir. Bu tür hareketli cilia disfonksiyonu daha büyük solunum semptomları9 ve daha fazla ameliyat sonrası morbidite8'e çevrildiği gösterilmiştir. Hepsi olmasa da, bu hastalıkların çoğunda fare modelleri mevcuttur ve farelerde MCC'yi ölçme protokolümüz potansiyel terapötikleri test etmek için kullanılabilecek değerli bir araçtır.
Hayvan modelleri hastalıkları anlamak ve tedavilerin geliştirilmesi için fayda sağlar. In vivo hayvan görüntüleme, hayvanları feda etmeye gerek kalmadan aynı hayvanlardan birden fazla veri noktası elde etme yeteneği ile daha fazla yardımcı program sağlar ve araştırmacıların hastalığın boyuna seyrini ve tedavi etkilerinin çalışma süresini izlemelerine izin verir. MCC'nin fare modeli on yıllar boyunca birden fazla araştırmacı tarafından geliştirilmiştir, başlangıçta iki boyutlu bir nükleer görüntüleme tekniği olan düzlemsel sintigrafi kullanılarak beagle köpekleri üzerinde gerçekleştirilir24. Teknik on yıl sonra farelerde kullanılmak üzere uyarlandı, ardından spect görüntülemeye adaptasyon on yıl sonra25,26. Fare modellerinde bu tekniğin geliştirilmesi, silier fonksiyonun önemli ölçüde değiştiği PCD gibi insan hastalıklarının birden fazla fare modelinin bulunması nedeniyle bu tekniğin ilgisinde önemli bir gelişmeydi. MCC, akciğer denervasyonu ve immünosupresyon fare modellerinde değerlendirilmiştir ve diğer modellerle birlikte kullanılma potansiyeline sahiptir19,26. CHD ile ilişkili CF, astım, PCD ve ciliopatiler gibi hava yolu hastalıkları olan insan hastalarında MCC ölçüm çalışmaları yapılmıştır ve tekniğin hem akciğer fizyolojisi çalışmalarına hem de terapötik etkinlik çalışmalarına yardımcı olabileceğine dair sonuçlar13.
Bu protokolün önemli bir parçası, nicelik için doğru görüntüler elde etmek için doğru görüntüleme parametreleriyle alımlar ayarlamaktır. Hangi kolimatörlerin kullanıldığı, devir başına elde edilen projeksiyon sayısı ve döndürme adımı boyutu da dahil olmak üzere SPECT alım ayarlarını tasarlarken bir dizi faktör anahtardır. Kolimatör seçimi, alımın hassasiyetinde ve çözümünde önemli bir faktördür ve alım ayarlarının kullanılan kolimatöre uyarlanmış olması gerekebilir27. Alternatif olarak, sıçanlar gibi daha büyük hayvanlar kullanırken, kolimatörlerin ayarlanması gerekir. Örneğin birden fazla iğne deliği kolimatörleri daha hassastır, ancak üst üste binen projeksiyonları önlemek ve istenmeyen çoklamalara neden olmak için bir adım boyutu seçerken dikkatli olunmalıdır, bu da yeniden yapılandırma yapıtlarına neden olabilecek bazı görüntü belirsizliği pahasına kazanımın hassasiyetini daha da artırabilir25. Yeniden yapılandırma kurulumu, ölçülebilir görüntüler oluşturmak için de anahtardır. MAP3D yaygın olarak kullanılan bir yinelemeli rekonstrüksiyon algoritmasıdır ve PSF yaygın bir yeniden yapılandırma modelidir. Her ikisi de görüntüleri yeniden oluşturmak için güvenilirdir, ancak yinelemelerin ve alt kümelerin sayısını ayarlarken dikkatli olunmalıdır. Daha fazla sayıda yineleme, yeniden yapılandırma için gereken hesaplama süresini artıracak ve daha fazla arttıktan sonra azalan getirilerle yeniden yapılandırmanın kalitesini artıracaktır.
ImageJ'deki görüntüleri ölçmek için kullanılacak ideal ölçüm aracı, bir seçimdeki piksellerin toplam değerini çıkaran RawIntDen'dır. SPECT verilerini farklı boyutlardaki akciğer ROI'leri arasında ölçerken, RawIntDen kullanımı mutlak bir sayım ölçüsü sağlar ve ölçümün ortalama ölçümün21olacağı gibi yatırım getirisinin alanına ayarlanmasını önler.
Bu teknik, araştırmacının bu tekniği uygularken farkında olması gereken bir dizi ilişkili hata kaynağına sahiptir. Önemli bir kafa karıştırıcı anestezik ajanların kullanılmasıdır. Isoflurane, farelerin bir kazanımın tamamlanmasından sonra hızla kurtulduğu hızlı etkili, solunan bir anestezidir. Bununla birlikte, farelere kafeslerinde iyileşmeleri için bol zaman sağlamaya özen göstermeli ve gerektiğinden daha uzun süre uyuşturulmamalıdır. Kişisel deneyimimizde (yayınlanmamış veriler) 0 ila 6 saatlik zaman noktası arasında solunan izofluran kullanılarak sürekli uyuşturulmuş fareler ihmal edilebilir boşluk gösterdi. Aynı şekilde, hızlı iyileşmeyi sağlamak için kontrollü bir anestezi dozu da gereklidir. Hayvanı görüntüleme için palete sabitlerken, eserlerin akciğerlerle çakışmasını önlemek için ortak kayıt için kullanılan hayalet tüp midede düşük tutulmalıdır. Aynı şekilde, kaliteli bir CT görüntüsü sağlamak için, x-ışını saçılımından yapıtları önlemek için fareden herhangi bir metal etiketi çıkarmaya dikkat edin.
Mevcut MCC protokolü sayısız hayvan modeline uygulanabilir. Bu teknik taranan hayvanın sağlığı üzerinde ihmal edilebilir bir etkiye sahiptir, fareler tarafından iyi tolere edilir ve bu nedenle zaten hassas farelerin sağlığını riske atmadan hastalık modelleriyle kullanılabilir. Bu metodolojinin gücü, ex vivo modellerinin26. Bu tekniğin aynı hayvanların birden fazla taramasında tekrarlanabilir ölçümler üretmedeki tutarlılığı, aynı hayvanın farklı ajanlar veya potansiyel terapötiklerle tedavi edilmesine ve herhangi bir hayvan modelinde bulunan biyolojik değişkenliği azaltmak için aynı hayvan arasında yapılan istatistiksel karşılaştırmalara izin verir, böylece istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar göstermek için gereken örnek boyutunu azaltır.
MCC tekniği kullanılarak hava yolu fonksiyonunun değerlendirilmesi çeşitli hayvan modellerine ayarlanabilir ve yeni tedavilerin test edilmesiyle birlikte birçok farklı hava yolu sağlığı modeline uygulanabilir. PCD'nin fare modellerinin hava yolları, koah modellerinin yanı sıra bu teknik kullanılarak değerlendirilebilir. Yöntemimiz, çeşitli anesteziklerin MCC üzerindeki yaygın klinik kullanımda olan diferansiyel etkilerini incelemek için de kullanılabilir. Son olarak, terapötik ajanların hava yolu üzerindeki etkileri de bu model kullanılarak değerlendirilebilir. Daha önce belirtildiği gibi, ancak tekrar taşır, in vivo bir ölçüm olduğu için, bir hastalığın seyri boyunca MCC değerlendirmelerinin tekrarlanmasına ve zaman içinde terapötik müdahalelerin test yararlarına izin verir. Ek olarak, fareler, insan hastalıklarını taklit etmek / incelemek için kullanılan en yaygın laboratuvar hayvanlarıdır ve bazı durumlarda, insan hastalığının birden fazla transgenik fare modeli arasından seçim yapabilir.

Cilia, alglerden insanlara evrimsel tarih boyunca korunan mikrotübül bazlı hücresel organellerdir. Hücre yüzeylerinden çıkarlar ve yerel çevreselduyusal sinyallerin tanınmasından hareketliliğine, insanlardan erken tek hücreli ökaryotik organizmalara kadar izlenebilen işlevler2,3. Cilia, çevresel sinyalleri işlemek için bir hücrenin özel anteni olarak hareketli olmayan ve tek hizmet verebilir; veya alveollere giden terminal bronşioller hariç fallop tüplerinin astarı ve üst ve alt hava yolları gibi sıvı akışı oluşturmak için senkronize, metakronal dalgalarda dövülen hareketli veçoklu.
Solunum yollarının geniş epitel yüzeyi, çeşitli potansiyel olarak tehlikeli solunan kirleticiler ve patojenler şeklinde sürekli bir kirlenme yaylım ateşine maruz kalır ve bir savunma gerektirir. Önemli bir savunma mekanizması, trakeo-bronşiyal epitel hücrelerinin apikal yüzeylerini kaplayan birden fazla hareketli cilia'nın dövülmesiyle sürekli salgılanan mukusun akışının mekanik olarak hava yolundan taşındığı trakeobronşiyal ağacın mukozal aparatıdır. Solunan kirleticileri tuzağa çekmek için bu işlevler ve sürekli, senkron dayak yoluyla, onları sefalad4,5taşır.
Cilia'nın, embriyonik düğümdeki hareketli cilia'nın simetriyi kırdığı embriyoların geliştirilmesinde sol-sağ desenlemenin geliştirilmesi gibi kilit rollere sahip olduğu gösterilmiştir6. Cilia ile ilişkili genlerdeki mutasyonlar, kalbin asimetrik yapısına bağlı olarak konjenital kalp hastalığı (CHD) gibi hastalıklarla bağlantılıdır6. Son çalışmalar, CHD'li hastaların solunum yollarında silier disfonksiyon insidansının yüksek olduğunu, ayrıca üst ve alt hava yollarında ameliyat sonrası solunum komplikasyonları ve kronik solunum yolu semptomlarının yaygınlığının arttığını bildirmiştir 7,8,9,10. Heteroaksili veya heteroaksisiz CHD ve silier disfonksiyonlu hastaların ameliyat sonrası solunum komplikasyonu ve negatif solunum yolu sonuçları riskinin arttığı gösterilmiştir5,8,10. Sinyalizasyon ve gelişimdeki rollerinin ötesinde, hava yolu ciliasının önemi, birincil siliary diskinezi (PCD) olan ciliopatiler tarafından gösterilmiştir. PCD, hareketli solunum ciliasını etkileyen, tekrarlayan akciğer enfeksiyonlarına, bronşektazise ve potansiyel olarak akciğer nakli ihtiyacına yol açan bir dizi mutasyondan kaynaklanan bir doğumsal bozukluktur11. Ek olarak, Kafkas popülasyonunda en sık görülen konjenital bozukluk olan kistik fibroziste (CF) cilia normal olsa da, MCC CFTR geninde mutasyonlardan kaynaklanan kalın, viskoz mukus nedeniyle bozulur12. PCD ve CF'nin birden fazla fare modelinin yanı sıra giderek artan sayıda CHD modeli vardır. Sonuçta cilia birçok kilit rollere sahip çok yönlü yapılardır ve hareketli solunum cilia in vivo işlevini değerlendirmek için bir yöntem klinik öncesi çalışma için değerli olabilir ve mutasyonların yanı sıra ilaçların mukozik boşluk (MCC) üzerindeki etkilerini değerlendirmek için değerli olabilir13. Yöntem, bu fare modellerinde yeni ilaçların, gen tedavisinin veya müdahalelerin MCC üzerindeki etkilerini değerlendirmede de değerli olacaktır.
MCC'yi değerlendirmek için kullanılan birçok farklı model vardır. Önemli bir yöntem, bronşlara aşılanmış metilen mavi boyanın kullanımını içerir, boya hareketinin fiberoptik ölçümü ile ölçülen boşluk14. Bu yöntem, insanlarda klinik öncesi fare modellerine göre daha rutin olan boyanın hareketini gözlemleme yeteneği ile sınırlıdır. Bir diğer önemli yöntem, bir hava yolundaki tek tek parçacıkları izlemek için kullanılabilen senkrotron faz kontrastlı X-ışını görüntülemesidir (PCXI). Bu yöntem nispeten yenidir ve yaygın olarak erişilemez15. Video-mikroskopi için bir trakeayı ekströte ederek hava yolunu değerlendirmenin çok sayıda ex vivo yöntemi vardır, ancak bu modeller insan hastalarda çok az fayda sağlar16. Optik tutarlılık tomografisi gibi cilia görüntüleme için yüksek çözünürlüklü teknikler aynı şekilde sınırlıdır17.
Bu yazıda, sayısız hayvan modelinde akciğer boşluklarını ölçmek için kullanılan MCC in vivo'nun yanı sıra kronik obstrüktif akciğer hastalığında MCC'yi incelemek ve immünsüpresif ilaçların etkilerini değerlendirmek için tekrarlanabilir bir yöntem sunuyoruz18,19. Bu yöntem, akciğerlere aşılandıktan sonra çözünmeyen bir partikül radyotracer olan radyofarmasötik 99m technetium-kükürt kolloidinin(99mTc-Sc) açıkluğunu izler. Radyonüklid daha sonra tek foton emisyonlu bilgisayarlı tomografi (SPECT)18,20kullanılarak izlenebilir. Çift modalite SPECT ve bilgisayarlı tomografi (BT) görüntüleme kullanarak, radyoizotop sayımlarının akciğerlere birlikte lokalizasyonu ve bu sayımlardaki azalmayı 6 saat boyunca ölçerek MCC'yi ölçmek için bu tekniği daha da iyileştirdik. BT ve SPECT görüntülerinin birlikte kaydedilmesiyle çift modalite görüntüleme, radyasyon sayılarının ilgi alanımız olan akciğerlere doğru lokalizasyonunu sağlar. Farelerde MCC ölçümü için yöntemi ayrıntılı olarak açıklamamıza rağmen, protokol sıçanlarda MCC'yi incelemek için ayarlanabilir. Kollatörlerin radyasyon dozunu da ayarlamaları gerekir. Bizim görüşümüze göre, fare MCC taramaları küçük hayvan boyutu nedeniyle teknik olarak daha zordur, ancak bir dizi insan bozukluğunun çok sayıda yerleşik fare modeli nedeniyle sıçanlardan daha yararlıdır. Ek olarak, hayvan kolonilerinde daha düşük maliyet ve bakım maliyeti nedeniyle, farelerde daha büyük bir örnek boyutu daha mümkündür.

<table><tbody><tr><td>500 &amp;micro;m Unjacketed Fiber Optic Wire</td><td>Edmund Optics</td><td>02-532</td><td></td></tr><tr><td>99mTechnecium-Sulfur Colloid</td><td>Cardinal Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anesthesia Vaporizer</td><td>Vetland Medical</td><td>A13480</td><td></td></tr><tr><td>Durmont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>99150-20</td><td></td></tr><tr><td>FIJI ImageJ 2.0.0-rc-65/1.52p Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Introcan Safety Catheters 20G 1inch</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1534477</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein</td><td>118-2097</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Intubation Stand</td><td>Kent Scientific</td><td>ETI-MSE-01</td><td></td></tr><tr><td>Siemens Inveon dual-modality SPECT/CT</td><td>Siemens</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single Channel Anesthesia Stand</td><td>Summit Anesthesia Solutions</td><td>22860</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo evaluation of mucociliary clearance in mice

Hücrenin özel organelleri olan solunum motile cilia, solunum yollarını kaplayan epitel hücrelerinin apikal yüzeyini hizalar. Metakronal, senkron bir şekilde yenerek, bu çoklu, hareketli, aktüer bazlı organeller, solunan kirleticilerin ve patojenlerin solunum yollarını temizleyen bir sefalad sıvı akışı oluşturur. Artan çevre kirliliği, yeni viral patojenler ve ortaya çıkan çok ilaca dirençli bakteriler ile cilia, üretilen mukoziyel boşluk (MCC) akciğer sağlığını korumak için gereklidir. MCC ayrıca primer silier diskinezi, kistik fibrozis gibi birden fazla doğumsal bozuklukta ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı gibi edinilmiş bozukluklarda depresyondadır. Tüm bu bozukluklar, bazı durumlarda birden fazla fare modeli oluşturmuştur. Bu yayında, in vivo farelerde MCC'yi doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçmek için az miktarda radyoaktivite ve çift modalite SPECT / CT görüntüleme kullanarak bir yöntemi detaylandırıyoruz. Yöntem, görüntülemeden sonra farelerin iyileşmesine, seri ölçümlerin mümkün hale getirilmesine ve potansiyel terapötiklerin zaman içinde uzunlamasına test etmesine izin verir. Vahşi tip farelerdeki veriler, detaylara yeterli dikkat gösterdiği ve protokole kesinlikle uyulduğı sürece MCC ölçümünün tekrarlanabilirliğini göstermektedir.

Bu protokolü kullanarak, fareleri bir izofluran odasında uyuşturduk (Şekil 1A). Yeterli anestezi seviyesine ulaştıktan sonra, fareler dikey desteklere yerleştirildi (Şekil 1B) ve ses telleri aydınlatılmış bir kılavuz tel kullanılarak görselleştirildi (Şekil 1C-1D). Fareler entübe edildi ve bir kanül aracılığıyla 10 μL hacimlerde 0.2 mCi 99mTc-Sc ile aşılandı ve akciğerlere kendiliğinden solunmasına izin verildi (Şekil 1E-1F). Görüntü alımı ve işlenmesinden sonra, CT ve SPECT görüntüleri, hayalet tüpü bir dönüm noktası olarak kullanarak (Şekil 2A) kolokalize edildi (Şekil 2B). Akciğerlerin maskeleri BT görüntüsünden (Şekil 2C) oluşturuldu ve 0 ( Şekil 2D ) ve 6 saatte(Şekil2E-2F)analiz için sağ akciğerin etrafına ROI çekmek için kullanıldı. Protokolün tekrarlanabilirliğini test etmek için, aynı deneysel koşullarla farklı günlerde toplam 8 fare iki kez tarandı ve tekrar taramaları arasında önemli bir fark olmadığını gösteren eşleştirilmiş bir t testi kullanılarak analiz edildi (p-value=0.9904) (Şekil 3A). Aynı deneysel koşullarla farklı günlerde üç kez ek 2 fare tarandı, tek yönlü ANOVA kullanılarak yapılan analizler tekrar taramaları arasında önemli eşleşmeler gösterdi (p değeri 0.0041) (Şekil 3B). Toplam 8 fare tarandı ve iki temsili görüntü görüntülendi (Şekil 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig01.jpg"> Şekil 1: Fare entübasyonu ve izotop aşılaması. İzotopun entübe olması ve hava yoluna aşılası için gereken adımların görüntüleri. A) Fare bir odada uyuşturulur. B)Uyuşturulmuş fare, ön kesici dişler tarafından askıya alınmış dikey bir desteğe yerleştirilir. C) Kılavuz tel olarak hizmet veren ışıklı 0,5 mm fiber optik tel, 20 G'lık bir canülden çalıştırılarak hazırlanır. D) Farenin ağzı forseps kullanılarak açılır ve ses tellerini görselleştirmek için ışıklı kılavuz tel kullanılarak aydınlatılır. E) Canül ses telleri boyunca itilir ve kılavuz tel çıkarılır. F) Çözünür izotop bir pipet kullanılarak kanüle aşılanır ve farenin izotopu akciğerlere kendiliğinden solumasına izin verilir. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61929/61929fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig02v2.jpg"> Şekil 2: MCC taramasının SPECT/CT görüntüleri. A) CT görüntüsüyle birlikte yerelleştirilmiş bir SPECT görüntüsü. B)Birlikte lokalizasyon için kullanılan görünür bir fantom tüplü CT görüntüsü. C) CT görüntüsünün binarizing ve bir z-yığın toplam projeksiyon gerçekleştirme tarafından türetilen hava yolu maskesi. D) CT maskesi SPECT görüntüsüyle birlikte yerelleştirildi. Sağ akciğerin etrafına analiz için bir yatırım getirisi çizilmiş. E) 6 saatte hava yolunun maskesi. F) Analiz için bir yatırım getirisi ile 6 saatte hava yolunun CT ve SPECT birlikte lokalize görüntüsü. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61929/61929fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig03.jpg"> Şekil 3: Aynı farelerin birden fazla taramada boşluk ölçümleri. A) Deneysel koşullarda değişiklik olmayan 8 fare için iki ayrı tekrar boşluk ölçtü. Eşleştirilmiş bir t testi, p değeri 0.9904 olan tekrar taramaları arasında önemli bir fark olmadığını gösterdi. B) Deneysel koşullarda değişiklik olmayan iki fare için üç ayrı tekrar boşluk ölçtü. Tek yönlü bir ANOVA, p değeri 0.0041 olan tekrar taramaları arasında önemli bir eşleşme olduğunu gösterdi. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61929/61929fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig04.jpg"> Şekil 4: Sağ akciğeri özetleyen 0 ve 6 saatte çizilmiş ROI'ler ile 2 farede 0 ve 6 saatlik hava yolunun birlikte lokalize SPECT /CT görüntüleri. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61929/61929fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 1: Nefes almanın etkisiyle fiber optik tel ile aydınlatılan ses tellerinin videosu görselleştirildi. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929supfig01.jpg" target="_blank">Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Dosyalar. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61929/Supplemental_Files.zip" target="_blank">Bu dosyaları indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Evaluation of Mucociliary Clearance in Mice at JoVE.com

In vivo Evaluation of Mucociliary Clearance in Mice

Bu yayında, çift modalite radyonüklid görüntüleme kullanarak in vivo farelerde hava yolu mukozirary boşluğunu (MCC) değerlendirme protokollerini açıklıyoruz. Bu protokol, çift SPECT/CT sisteminde fare tüm gövde (MWB) kolimatörleri kullanılarak tek bir foton emisyonlu bilgisayarlı tomografi (SPECT) ve bilgisayarlı tomografi (BT) alma protokolü için tasarlanmıştır.

Farelerde Mukozdiliyel Temizliğin In vivo Değerlendirilmesi

Respiratory motile cilia, specialized organelles of the cell, line the apical surface of epithelial cells lining the respiratory tract. By beating in a ...

in-vivo-evaluation-of-mucociliary-clearance-in-mice

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

4.3K Görüntüleme.  University of Pittsburgh School of Medicine. Bu yayında, çift modalite radyonüklid görüntüleme kullanarak in vivo farelerde hava yolu mukozirary boşluğunu (MCC) değerlendirme protokollerini açıklıyoruz. Bu protokol, çift SPECT/CT sisteminde fare tüm gövde (MWB) kolimatörleri kullanılarak tek bir foton emisyonlu bilgisayarlı tomografi (SPECT) ve bilgisayarlı tomografi (BT) alma protokolü için tasarlanmıştır.

Video: In vivo Evaluation of Mucociliary Clearance in Mice

Murine Model of Allergen Induced Asthma

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, with the prevalence increasing.2 As with other diseases, animal models of allergic airway disease greatly facilitate understanding of the underlying pathophysiology, help identify potential therapeutic targets, and allow preclinical testing of possible new therapies. Models of allergic airway disease have been developed in several animal species, but murine models are particularly attractive due to the low cost, ready availability, and well-characterized immune systems of these animals.3 Availability of a variety of transgenic strains further increases the attractiveness of these models.4 Here we describe two murine models of allergic airway disease, both employing ovalbumin as the antigen. Following initial sensitization by intraperitoneal injection, one model delivers the antigen challenge by nebulization, the other by intratracheal delivery. These two models offer complementary advantages, with each mimicking the major features of human asthma.5
The major features of acute asthma include an exaggerated airway response to stimuli such as methacholine (airway hyperresponsiveness; AHR) and eosinophil-rich airway inflammation. These are also prominent effects of allergen challenge in our murine models,5,6 and we describe techniques for measuring them and thus evaluating the effects of experimental manipulation. Specifically, we describe both invasive7 and non-invasive8 techniques for measuring airway hyperresponsiveness as well as methods for assessing infiltration of inflammatory cells into the airways and the lung. Airway inflammatory cells are collected by bronchoalveolar lavage while lung histopathology is used to assess markers of inflammation throughout the organ. These techniques provide powerful tools for studying asthma in ways that would not be possible in humans.

Experimental mouse models of allergic asthma offer new possibilities for studying disease pathogenesis and developing new therapeutics. These models are well suited to measuring factors governing the allergic immune response, airway inflammation, and pulmonary pathophysiology.

Alerjen Bağlı Astım murin Modeli

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly hydrated, forming a substantial endothelial surface layer (ESL) that contributes to the maintenance of endothelial function. As the endothelial glycocalyx is often aberrant in vitro and is lost during standard tissue fixation techniques, study of the ESL requires use of intravital microscopy. To best approximate the complex physiology of the alveolar microvasculature, pulmonary intravital imaging is ideally performed on a freely-moving lung. These preparations, however, typically suffer from extensive motion artifact. We demonstrate how closed-chest intravital microscopy of a freely-moving mouse lung can be used to measure glycocalyx integrity via ESL exclusion of fluorescently-labeled high molecular weight dextrans from the endothelial surface. This non-recovery surgical technique, which requires simultaneous brightfield and fluorescent imaging of the mouse lung, allows for longitudinal observation of the subpleural microvasculature without evidence of inducing confounding lung injury.

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

The endothelial glycocalyx/endothelial surface layer is ideally studied using intravital microscopy. Intravital microscopy is technically challenging in a moving organ such as the lung. We demonstrate how simultaneous brightfield and fluorescent microscopy may be used to estimate endothelial surface layer thickness in a freely-moving in vivo mouse lung.

Fare Pulmoner Endotelyal Yüzey Katman in vivo ölçümü olarak

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly ...

Tıp

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen interactions take advantage of intraperitoneal injections of select bacteria or pathogen associated molecular patterns (PAMPs) in mice. While these techniques have yielded tremendous data associated with infectious disease pathobiology, intraperitoneal injection models are not always appropriate for host-pathogen interaction studies in the lung. Utilizing an acute lung inflammation model in mice, it is possible to conduct a high resolution analysis of the host innate immune response utilizing lipopolysaccharide (LPS). Here, we describe the methods to administer LPS using nonsurgical oropharyngeal intratracheal administration, monitor clinical parameters associated with disease pathogenesis, and utilize bronchoalveolar lavage fluid to evaluate the host immune response. The techniques that are described are widely applicable for studying the host innate immune response to a diverse range of PAMPs and pathogens. Likewise, with minor modifications, these techniques can also be applied in studies evaluating allergic airway inflammation and in pharmacological applications.

The host immune response to pathogen infection is a tightly regulated process. Utilizing a lipopolysaccharide lung exposure model in mice, it is possible to conduct high resolution evaluations of the complex mechanisms associated with disease pathogenesis.

Farelerde Host immün yanıtı değerlendirmek için Orofarengeal intratrakeal PAMP İdaresi ve Bronchoalveolar Lavage Kullanımı

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

A Reversible, Non-invasive Method for Airway Resistance Measurements and Bronchoalveolar Lavage Fluid Sampling in Mice

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated procedures to obtain such measurements in the same animal are generally not feasible.  Here, we demonstrate protocols for obtaining from mice repeated measurements of AHR and bronchoalveolar lavage fluid samples.  Mice were challenged intranasally seven times over 14 days with a potent allergen or sham treated.  Prior to the initial challenge, and within 24 hours following each intranasal challenge, the same animals were anesthetized, orally intubated and mechanically ventilated.  AHR, assessed by comparing dose response curves of respiratory system resistance (RRS) induced by increasing intravenous doses of acetylcholine (Ach) chloride between sham and allergen-challenged animals, were determined.  Afterwards, and via the same intubation, the left lung was lavaged so that differential enumeration of airway cells could be performed.  These studies reveal that repeated measurements of AHR and BAL fluid collection are possible from the same animals and that maximal airway hyperresponsiveness and airway eosinophilia are achieved within 7-10 days of initiating allergen challenge.  This novel technique significantly reduces the number of mice required for longitudinal experimentation and is applicable to diverse rodent species, disease models and airway physiology instruments.  

Repeated measurements of rodent respiratory physiology and sampling of airway inflammatory cells are desirable, but generally not feasible. Here we describe a repeatable method for orally intubating mice that permits repeated measurements of airway hyperreactivity and sampling of airway inflammatory cells.

Havayolu Direnci Ölçümleri ve Fare Bronkoalveolar Lavaj Sıvısı Örnekleme için, geri dönüşümlü, Non-invaziv Yöntemi

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated ...

Biyoloji

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Mikrobiyal Toplulukları incelenmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt;: Arası Ana aracılı Etkileşim Modeli<em&gt; Candida albicans</em&gt; Ve<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique

The forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational tool permitting the experimental assessment of lung function in mice in a comprehensive, detailed, precise and reproducible manner. It provides measurements of respiratory system mechanics through the analysis of pressure and volume signals acquired in reaction to predefined, small amplitude, oscillatory airflow waveforms, which are typically applied at the subject's airway opening. The present protocol details the steps required to adequately execute forced oscillation measurements in mice using a computer-controlled piston ventilator (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada). The description is divided into four parts: preparatory steps, mechanical ventilation, lung function measurements, and data analysis. It also includes details of how to assess airway responsiveness to inhaled methacholine in anesthetized mice, a common application of this technique which also extends to other outcomes and various lung pathologies. Measurements obtained in na&iuml;ve mice as well as from an oxidative-stress driven model of airway damage are presented to illustrate how this tool can contribute to a better characterization and understanding of studied physiological changes or disease models as well as to applications in new research areas.

The present protocol provides a detailed step-by-step description of the procedures required to execute measurements of respiratory system mechanics as well as the assessment of airway responsiveness to inhaled methacholine in mice using the forced oscillation technique (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada).

Zorla Salınım Tekniği kullanarak Fare Solunum Sistemi Mekanik Değerlendirilmesi

The  forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational  tool permitting the experimental assessment of lung function in mice ...

Assessment of Respiratory Function in Conscious Mice by Double-chamber Plethysmography

Air volume changes created by a conscious subject breathing spontaneously within a body box are at the basis of plethysmography, a technique used to non-invasively assess some features of the respiratory function in humans as well as in laboratory animals. The present article focuses on the application of the double-chamber plethysmography (DCP) in small animals. It provides background information on the methodology as well as a detailed step-by-step procedure to successfully assess respiratory function in conscious, spontaneously breathing animals in a non-invasive manner. The DCP can be used to monitor the respiratory function of multiple animals in parallel, as well as to identify changes induced by aerosolized substances over a chosen time period and in a repeated manner. Experiments on control and allergic mice are used herein to demonstrate the utility of the technique, explain the associated outcome parameters, as well as to discuss the related advantages and shortcomings. Overall, the DCP provides valid and theoretically sound readouts that can be trusted to evaluate the respiratory function of conscious small animals both at baseline and after challenges with aerosolized substances.

The objective of the present article is to provide a detailed description of the recommended procedures to evaluate respiratory function in conscious mice by double-chamber plethysmography.

Solunum fonksiyon çift-odası pletismografisi tarafından bilinçli farelerde değerlendirilmesi

Air volume changes created by a conscious subject breathing spontaneously within a body box are at the basis of plethysmography, a technique used to ...

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary clearance function has been established. Freshly harvested mouse trachea is cut longitudinally through the trachealis muscle and mounted in a shallow walled chamber on a glass-bottomed dish. The trachea sample is positioned along its long axis to take advantage of the trachealis muscle to curl longitudinally. This allows imaging of ciliary motion in the profile view along the entire tracheal length. Videos at 200 frames/sec are obtained using differential interference contrast microscopy and a high speed digital camera to allow quantitative analysis of cilia beat frequency and ciliary waveform. With the addition of fluorescent beads during imaging, cilia generated fluid flow also can be determined. The protocol time spans approximately 30 min, with 5 min for chamber preparation, 5-10 min for sample mounting, and 10-15 min for videomicroscopy.

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An easy and reliable technique for visualizing and quantifying airway cilia motility and cilia generated flow using mouse trachea is described. This technique can be modified to determine how a wide range of factors influence cilia motility, including pharmacological agents, genetic factors, environmental exposures, and/or mechanical factors such as mucus load.

Kemirgen Havayolu Epiteli içinde Cilia Motilite Yüksek Çözünürlüklü Görüntüleme için ex vivo Yöntemi

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful in cases of attenuated, oligo- or mono-symptomatic forms of CF usually diagnosed later in life, and of CF-related disorders such as congenital bilateral absence of vas deferens, idiopathic chronic pancreatitis, allergic bronchopulmonary aspergillosis, and bronchiectasis. In both clinical and preclinical settings, the test has been used as a biomarker to quantify responses to targeted therapeutic strategies for CF. Adapting the test to a mouse is challenging and can entail an associated mortality. This paper describes the adequate depth of anesthesia required to maintain a nasal catheter in situ for continuous perfusion. It lists measures to avoid broncho-aspiration of solutions perfused in the nose. It also describes the animal care at the end of the test, including administration of a combination of antidotes of the anesthetic drugs, leading to rapidly reversing the anesthesia with full recovery of the animals. Representative data obtained from a CF and a wild-type mouse show that the test discriminates between CF and non-CF. Altogether, the protocol described here allows reliable measurements of the functional status of trans-epithelial chloride and sodium transporters in spontaneously breathing mice, as well as multiple tests in the same animal while reducing test-related mortality.

Here, we present a protocol to measure nasal potential difference in mice. The test quantifies the function of transmembrane ion transporters such as the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and the epithelial sodium channel. It is valuable to evaluate the efficacy of novel therapies for cystic fibrosis.

Trans-epitel iyon taşıma farelerde ölçmek için burun potansiyel fark

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Farelerde öksürük duyarlılığı için noninvaziv gerçek zamanlı tüm vücut pletismografisi

Methods for Detecting Cough and Airway Inflammation in Mice

Chronic cough, which lasts for more than 8 weeks, is one of the most common complaints requiring medical attention, and patients suffer from a huge socioeconomic burden and a marked decrement in quality of life. Animal models can mimic the complex pathophysiology of the cough and are important tools for cough research. The detection of cough sensitivity and airway inflammation is of great significance for studying the complex pathological mechanism of cough. This article describes the measurement of cough using a noninvasive and real-time whole-body plethysmography (WBP) system and the normative procedures for harvesting tissue samples (including blood, lung, spleen, and trachea) of mice. It introduces some methods to assess airway inflammation, including pathological changes in hematoxylin and eosin (HE)-stained lung and trachea sections, the total protein concentration, the uric acid concentration, and the lactate dehydrogenase (LDH) activity in the supernatant of bronchoalveolar lavage fluid (BALF), and the leukocytes and differential cell counts of BALF. These methods are reproducible and serve as valuable tools to study the complex pathophysiology of cough.

Yazar Spotlight: Kronik Öksürüğün Patofizyolojisinin Araştırılması

Here, we describe the measurement of cough using a noninvasive and real-time whole-body plethysmography (WBP) system and the normative procedures for harvesting tissue samples of mice and introduce some methods to assess airway inflammation.

Farelerde öksürük ve hava yolu iltihabını tespit etme yöntemleri

Chronic cough, which lasts for more than 8 weeks, is one of the most common complaints requiring medical attention, and patients suffer from a huge ...