M.Z. e K.S.F. e questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione assegnata nell'ambito del Pitt Innovation Challenge (PInCh), attraverso il Clinical and Translational Science Institute dell'Università di Pittsburgh, e la borsa NHLBI R01 HL153407, assegnata a M.Z.

Il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Pittsburgh ha approvato tutti i protocolli sugli animali specificati nella presente pubblicazione prima di intraprendere uno di questi esperimenti sugli animali.
NOTA: Questo protocollo descrive in dettaglio come eseguire studi di clearance mucociliari in vivo utilizzando l'imaging di radionuclidi con uno scanner SPECT/CT a doppia modalità. Le tecniche dimostrate sono l'esecuzione di calibrazioni del sistema, l'anestesia dei topi, l'intubazione tracheale dei topi, l'instillamento dell'isotopo nei polmoni, l'imaging a doppia modalità, la co-registrazione di queste immagini e l'analisi.
1. Configurazione del sistema SPECT/CT
<ol><li>Progettare un flusso di lavoro appropriato e configurare prima di eseguire esperimenti utilizzando animali viventi.<ol>
<li>Utilizzare un'acquisizione SPECT composta da 60 proiezioni con una dimensione del passo di 6o tra le proiezioni con un raggio di rotazione di 40 cm. L'acquisizione di CT è costituita da 220 proiezioni con un angolo di 1,6o tra le proiezioni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Assicurarsi che il sistema abbia in atto i collimatori MWB corretti per i topi e l'imaging SPECT. Se vengono installati collimatori inappropriati, utilizzare la procedura guidata collimatore per installare quelli corretti.</li>
	<li>Eseguire le calibrazioni di sistema necessarie per preparare il sistema per l'uso. NOTA: I componenti SPECT e CT dello scanner necessitano di calibrazione. Calibrare i componenti CT utilizzando un condizionamento della sorgente e una calibrazione Dark/Light (D/L) una volta al giorno, una calibrazione Center Offset (COS) ogni 2 settimane e valutare l'hardware a raggi-X ogni mese. I componenti SPECT devono essere calibrati una volta all'anno.<ol>
<li>Per valutare l'hardware a raggi-X, selezionare la casella Valuta hardware a raggi X durante le calibrazioni CT(Menu di calibrazione CT supplementare).</li>
		<li>Per eseguire il condizionamento della sorgente, selezionare la casella Esegui condizionamento sorgente durante le calibrazioni CT(Menu di calibrazione CT supplementare).</li>
		<li>Per eseguire una calibrazione D/L, selezionare la casella D/L accanto al protocollo di acquisizione CT utilizzato durante gli esperimenti durante le calibrazioni CT. Deselezionare tutti gli altri protocolli(Menu di calibrazione CT supplementare).</li>
		<li>Per eseguire una calibrazione COS, sostituire il letto con lo strumento anello di calibrazione, regolare le impostazioni del tipo di letto in modo che corrispondano alle impostazioni di controllo del movimento e selezionare la casella COS accanto al protocollo di acquisizione CT utilizzato durante gli esperimenti durante le calibrazioni CT. Deselezionare tutti gli altri protocolli(menu di calibrazione CT supplementare, anello di calibrazione supplementare).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Intubazione e instillazione del topo
<ol><li>Pesare i topi da scansionare. Se si scansionano più topi, fare attenzione a contrassegnare i topi a scopo di identificazione utilizzando metodi come la punzonatura dell'orecchio o la marcatura della coda.</li>
	<li>Anestetizzare un topo usando l'1,5% di isoflurane con un flusso di gas di 2 L/min O2 in una camera a gas per ~5 minuti per produrre anestesia di profondità sufficiente, fino a quando la respirazione rallenta a ~ 55-65 respiri al minuto 16 (Figura 1A).</li>
	<li>Rimuovere il mouse dalla camera e sospendere con gli incisivi anteriori su un supporto di intubazione a 45o pendenza. Dotare il supporto di intubazione di un cono del naso per assicurarsi che il mouse sia anestetizzato durante l'intubazione (Figura 1B).</li>
	<li>Collegare un'estremità di un filo in fibra ottica da 50 μm a una sorgente luminosa e infilare una cannula calibro 20 su di essa utilizzando il filo per fungere da guida (Figura 1C).</li>
	<li>Aprire la bocca del mouse e tirare la lingua in avanti usando forcep smussate. Illuminare il filo guida e utilizzarlo per visualizzare le corde vocali (Figura 1D).</li>
	<li>Passare il filo guida attraverso le corde vocali in modo che il filo sia appena oltre le corde vocali e riposare nella trachea superiore. Far scorrere la cannula da 1 pollice in avanti lungo il filo per intubare il mouse, passando la cannula abbastanza in profondità in modo che il suo fulcro sia contro gli incisivi dell'animale (Figura 1E). Rimuovere il filo lasciando la cannula in posizione.</li>
	<li>Testare l'intubazione collegando brevemente la cannula con un dito e controllando i cambiamenti nella respirazione. La respirazione interrotta o la respirazione tesa durante la tappatura e la respirazione accelerata al momento del rilascio sono segni di corretta intubazione tracheale. Se non vi è alcun cambiamento nei modelli respiratori al momento dell' tappatura della cannula, quest'ultima è probabile nell'esofago.</li>
	<li>Preparare 0,2 mCi di colloide tecnezio-zolfo da 99m(99mTc-Sc) in un volume di 10 μL e pipetta nella cannula. Lasciare che il topo lo inali spontaneamente nei polmoni per oltre 1-2 min(Figura 1F). Rimuovere la cannula prima di trasferire il mouse sul pallet dello scanner. NOTA: Il radionuclide è stato preparato e filtrato da Cardinal Health.</li>
</ol>3. Imaging SPECT/CT
<ol><li>Trasferire il mouse su un pallet da 25 mm con un cono del naso e fissare con nastro adesivo, facendo attenzione a non rastremare troppo strettamente il torace e l'addome per evitare di compromettere la respirazione. Fare attenzione a rimuovere eventuali auricolari metallici attaccati al mouse.</li>
	<li>Preparare un fantasma radioattivo costituito da 0,05 mCi in 200 μL e posizionare questa quantità in un tubo PCR da 0,2 ml. Posizionare il tubo toccando il pallet sotto l'addome inferiore del mouse, evitando sovrapposizioni con i polmoni. NOTA: Il fantasma viene utilizzato allo scopo di co-registrare le immagini CT e SPECT, nonché un controllo negativo per la clearance.</li>
	<li>Inserire il mouse nel sistema SPECT/CT, selezionare il flusso di lavoro di imaging ed eseguire setup.</li>
	<li>Impostare il posizionamento dei rilevatori sul mouse ed eseguire il flusso di lavoro di imaging.</li>
	<li>Preparare una gabbia per topi che hanno ricevuto la post-procedura di radioattività, con accesso illimitato a cibo e acqua e etichettatura chiara utilizzando un adesivo di sicurezza per le radiazioni.</li>
	<li>Al termine del flusso di lavoro, rimuovere il mouse dal pallet di imaging e consentirgli di recuperare nella gabbia preparata per una durata di 6 ore tra le scansioni (fine scansione 1 fino all'inizio della scansione 2) con accesso ad libitum a cibo e acqua. 6 h è stato scelto in quanto corrisponde al periodo di tempo in cui il gioco lineare a seconda della funzione ciglia sta avvienendo con pochissima distanza alveolare.</li>
	<li>Dopo 6 ore, riaestestizzare il mouse e scansionare, insieme al fantasma, utilizzando lo stesso flusso di lavoro per misurare la quantità di isotopo cancellata dalle vie aeree. NOTA: È fondamentale consentire al mouse di riprendersi poiché l'anestesia ininterrotta con isoflurana per 6 ore porterà a un significativo effetto depressivo delle ciglia, con conseguente zero clearance mucociliari.</li>
</ol>4. Analisi
<ol><li>Dopo l'imaging, esegui la post-elaborazione per ricostruire le immagini complete dello stack 3D.<ol>
<li>Istogramma le immagini SPECT utilizzando le impostazioni standard di fabbrica per 99mTc, quindi ricostruire utilizzando un algoritmo MAP3D e la ricostruzione della funzione di diffusione del punto (PSF). NOTA: la ricostruzione è stata eseguita utilizzando 8 iterazioni e 6 sottoinsiemi. Una ricostruzione efficace richiede un rapporto tra sottoinsiemi e proiezioni a 1:10 o dividersi uniformemente nel numero di proiezioni, quindi 6 sottoinsiemi sono stati utilizzati a causa dell'acquisizione utilizzando 60 proiezioni.</li>
		<li>Ricostruire le immagini CT utilizzando l'algoritmo Feldkamp e un filtro Shepp-Logan. NOTA: La ricostruzione è stata eseguita utilizzando 4 iterazioni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Elaborare le immagini CT e SPECT in FIJI ImageJ21 utilizzando lo strumento reslice per generare immagini di visualizzazione coronale dalle immagini assiali predefinite. Quindi eseguire una proiezione di somma z-stack sull'immagine SPECT per aggiungere i dati di conteggio da ogni sezione e generare una singola immagine per facilitare l'analisi.</li>
	<li>Ridimensionare e co-registrare le immagini CT e SPECT utilizzando il tubo Eppendorf fantasma come riferimento (Figura 2A,B). Tenere traccia e utilizzare misurazioni di ridimensionamento coerenti in tutti gli esempi.</li>
	<li>Binarizzare l'immagine CT utilizzando la soglia automatica, seguita dall'inversione dello stack e dall'esecuzione di una proiezione di somma z-stack per generare un contorno dei polmoni per l'analisi (Figura 2C).</li>
	<li>Ruotare le immagini CT e SPECT e unire l'immagine utilizzando gli strumenti del canale. Calcolare MCC disegnando un ROI attorno al polmone destro e misurando (Figura 2D). NOTA: Questa misurazione sarà del conteggio totale nel polmone destro per i punti di tempo di 0 e 6 ore, con le immagini di 6 ore corrette per il decadimento radioattivo usando la formula: N(t) = N0e−t. 99m Tc-Sc ha una costante di decadimento di 3,21e−5 al secondo con un'emidità di ~6 ore. Questi valori possono quindi essere utilizzati per calcolare una percentuale di gioco. NOTA: Il polmone destro viene scelto per il prelievo e la misurazione del ROI poiché l'autorizzazione mucociliaria trasporterà il radioisotopo dai polmoni alla faringe da dove verrà inghiottito e finirà nello stomaco. Abbastanza spesso, i conteggi possono essere visti nello stomaco che possono sovrapporsi al polmone sinistro e quindi produrre conteggi erronei. Questa confusione può essere evitata misurando i conteggi solo nel polmone destro.</li>
</ol>

<ol>
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Il ruolo delle ciglia respiratorie motili sia nella malattia che nello sviluppo continua ad evolversi ed essere meglio apprezzato. Il battito sincrono e metacronale di ciglia multiple motile sulla superficie apicale delle cellule che rivestono l'albero tracheobronchiale genera un flusso di cefalodi che produce spazio mucociliario o MCC. MCC è compromessa in ciliopatie come PCD22, malattie acquisite come COPD18, e la sua importanza viene riconosciuta nei CHD, non tradizionalmente considerati ciliopatie. Dati recenti hanno mostrato disfunzione ciliaria respiratoria sia in CHD con eterotaxy23 che senza eterotassia7. Tale disfunzione della ciglia mobile ha dimostrato di tradursi in sintomirespiratori maggiori 9 e in una maggiore morbilità post-operatoria8. La maggior parte, se non tutte, di queste malattie, hanno modelli di topi disponibili e il nostro protocollo per misurare MCC nei topi è uno strumento prezioso che può essere utilizzato per testare potenziali terapie.
I modelli animali forniscono utilità per la comprensione delle malattie e lo sviluppo di terapie. L'imaging animale in vivo fornisce ulteriore utilità con la capacità di acquisire più punti dati dagli stessi animali, senza la necessità di sacrificare gli animali, consentendo agli investigatori di seguire il decorso longitudinale della malattia e di studiare la durata degli effetti del trattamento. Il modello di topo di MCC è stato sviluppato nel corso di decenni da più investigatori, inizialmente eseguito su cani beagle utilizzando la scintigrafia planare, una tecnica di imaging nucleare bidimensionale24. La tecnica è stata adattata per l'uso nei topi un decennio dopo, seguita dall'adattamento all'imaging SPECTun decennio dopo quel 25,26. Lo sviluppo di questa tecnica nei modelli di topo è stato uno sviluppo importante nella pertinenza di questa tecnica, a causa della disponibilità di più modelli di topi di malattie umane come la PCD in cui la funzione ciliaria è significativamente alterata. McC è stato valutato in modelli di topo di denervazione polmonare e immunosoppressione, e ha il potenziale per essere utilizzato in combinazione con altrimodelli 19,26. Sono stati condotti studi di misurazione MCC su pazienti umani con malattie delle vie aeree come CF, asma, PCD e ciliopatie associate alla CHD e hanno dato risultati che la tecnica può aiutare sia gli studi di fisiologia polmonare che l'efficaciaterapeutica 13.
Una parte importante di questo protocollo è l'impostazione di acquisizioni con i parametri di imaging corretti per acquisire immagini accurate per la quantificazione. Una serie di fattori sono fondamentali quando si progettano le impostazioni di acquisizione SPECT, tra cui quali collimatori vengono utilizzati, il numero di proiezioni da acquisire per rivoluzione e la dimensione del passo di rotazione. La selezione del collimatore è un fattore importante nella sensibilità e nella risoluzione dell'acquisizione e potrebbe essere necessario adattare le impostazioni di acquisizione al collimatoreutilizzato 27. In alternativa, quando si utilizzano animali più grandi come i ratti, i collimatori dovrebbero essere regolati. I collimatori a foro stenopeica multipli, ad esempio, sono più sensibili, ma è necessario prestare attenzione quando si seleziona una dimensione del passo al fine di evitare proiezioni sovrapposte e causare multiplexing indesiderato, che può aumentare ulteriormente la sensibilità dell'acquisizione a scapito di alcune ambiguità dell'immagine che possono causare artefatti diricostruzione 25. La configurazione della ricostruzione è anche la chiave per generare immagini quantificabili. MAP3D è un algoritmo di ricostruzione iterativa comunemente usato, e PSF è un modello di ricostruzione comune. Entrambi sono affidabili per la ricostruzione delle immagini, ma è necessario prestare attenzione quando si imposta il numero di iterazioni e sottoinsiemi. Un numero maggiore di iterazioni aumenterà il tempo computazionale necessario per la ricostruzione e aumenterà la qualità della ricostruzione con rendimenti decrescenti con un ulteriore aumento.
Per quantificare le immagini in ImageJ, lo strumento di misurazione ideale da utilizzare è RawIntDen, che restituisce il valore di somma dei pixel in una selezione. Quando si quantificano i dati SPECT tra ROI polmonari di dimensioni diverse, l'uso di RawIntDen fornisce una misura assoluta dei conteggi ed evita di regolare la misurazione nell'area del ROI, come farebbe la misurazione media21.
Questa tecnica ha una serie di fonti di errore associate di cui lo sperimentatore dovrebbe essere consapevole quando applica questa tecnica. Un importante confondatore è l'uso di agenti anestetici. L'isoflurane è un anestetico ad azione rapida e inalato da cui i topi si riprendono rapidamente dopo il completamento di un'acquisizione. Tuttavia, si dovrebbe fare attenzione a fornire ai topi tutto il tempo per riprendersi nelle loro gabbie e non tenere anestetizzato più a lungo del necessario. Nella nostra esperienza personale (dati inediti) i topi che venivano tenuti anestetizzati continuamente utilizzando isoflurane inalato tra il momento di 0 e 6 ore mostravano una distanza trascurabile. Allo stesso modo, è necessaria anche una dose controllata di anestetico per garantire un rapido recupero. Quando si fissa l'animale al pallet per l'imaging, il tubo fantasma utilizzato per la co-registrazione deve essere tenuto basso sullo stomaco per evitare che gli artefatti si sovrappongano ai polmoni. Allo stesso modo, per garantire un'immagine CT di qualità, fare attenzione a rimuovere eventuali tag metallici dal mouse per evitare artefatti dallo scattering a raggi X.
L'attuale protocollo MCC può essere applicato a una miriade di modelli animali. Questa tecnica ha un effetto trascurabile sulla salute dell'animale scansionato, è ben tollerata dai topi e per questo motivo può essere utilizzata con modelli di malattia senza rischiare la salute di topi già delicati. La forza di questa metodologia deriva dal fatto che si tratta di una tecnica in vivo, che consente l'acquisizione di misurazioni coerenti e ripetibili della funzione delle vie aeree senza il sacrificio degli animali alle trachee di accisa per la video-microscopia, che i modelli ex vivorichiedono 26. La coerenza di questa tecnica nella produzione di misurazioni ripetibili su più scansioni degli stessi animali consente di trattare lo stesso animale con agenti diversi o potenziali terapie e confronti statistici effettuati tra lo stesso animale per ridurre la variabilità biologica inerente a qualsiasi modello animale, riducendo così le dimensioni del campione necessarie per mostrare differenze statisticamente significative.
La valutazione della funzione delle vie aeree utilizzando la tecnica MCC può essere regolata su una varietà di modelli animali e applicata a molti diversi modelli di salute delle vie aeree, oltre a testare nuove terapie. Le vie aeree dei modelli di mouse di PCD possono essere valutate utilizzando questa tecnica, così come i modelli di BPCO. Il nostro metodo può anche essere utilizzato per studiare gli effetti differenziali di vari anestetici su MCC che sono di uso clinico comune. Infine, anche gli effetti degli agenti terapeutici sulle vie aeree possono essere valutati utilizzando questo modello. Come detto in precedenza, ma porta ripetizione, in quanto è una misurazione in vivo consente di ripetere le valutazioni MCC nel corso di una malattia, nonché i benefici di prova degli interventi terapeutici nel tempo. Inoltre, i topi sono gli animali da laboratorio più comuni utilizzati per imitare / studiare le malattie umane, con, in alcuni casi, più modelli di topi transgenici di malattie umane disponibili tra cui scegliere.

Le ciglia sono organelli cellulari a base di microtubuli conservati nella storia evolutiva dalle alghe agli esseri umani. Emanano dalle superfici cellulari e hanno una serie difunzioni 1,che vanno dal riconoscimento dei segnali sensoriali ambientali locali alla motilità, funzioni che possono essere fatte risalire dall'uomo ai primi organismi eucarioti unicellulari2,3. Cilia può essere non mobili e singola servendo come antenna specializzata di una cellula per elaborare segnali ambientali; o mobili e multipli, battendo in onde metacronali sincronizzate per generare flusso di fluido, come nel rivestimento delle tube di Falloppio e delle vie aeree superiori e inferiori, ad eccezione dei bronchioli terminali che portano agli alveoli1,2.
L'estesa superficie epiteliale delle vie respiratorie è esposta a una costante raffica di contaminazione sotto forma di una varietà di inquinanti e agenti patogeni inalati potenzialmente pericolosi, che richiedono una difesa. Un meccanismo chiave di difesa è l'apparato mucociliare dell'albero tracheobronchiale, dove un flusso continuo di muco secreto viene trasportato meccanicamente fuori dalle vie aeree dal battito di più ciglia motili che rivestono le superfici apicali delle cellule epiteliali tracheo-bronchiali. Questi funzionano per intrappolare i contaminanti inalati e, attraverso il loro battito continuo e sincronale, trasportarli cefalad4,5.
Cilia ha dimostrato di avere ruoli chiave come nello sviluppo del patterning sinistra-destra nello sviluppo di embrioni, dove le ciglia mobile al nodo embrionale romponola simmetria 6. Mutazioni nei geni correlati alle ciglia sono state collegate a malattie come la cardiopatica congenita (CHD) a causa della struttura asimmetrica del cuore6. Recenti studi hanno riportato un'elevata incidenza di disfunzione ciliare nelle vie respiratorie dei pazienti con CHD, nonché una maggiore prevalenza di complicanze respiratorie post-operatorie e sintomi cronici delle vie respiratorie nelle vie aeree superiori einferiori 7,8,9,10. I pazienti con CHD e disfunzione ciliaria, con o senza eterotassia, hanno dimostrato di avere un aumento del rischio di complicanze respiratorie e esiti respiratori negativi post-operatoriamente5,8,10. Al di là del loro ruolo nella segnalazione e nello sviluppo, l'importanza delle ciglia delle vie aeree è stata dimostrata dalle ciliopatie, di cui un primo esempio è la discinesia ciliare primaria (PCD). La PCD è un disturbo congenito derivante da una serie di mutazioni che colpiscono le ciglia respiratorie motili, portando a infezioni polmonari ricorrenti, bronchectasi e potenzialmente la necessità di trapianto polmonare11. Inoltre, anche se le ciglia sono normali nella fibrosi cistica (CF), disturbo congenito più comune nella popolazione caucasica, l'MCC è compromesso a causa di muco spesso e viscoso derivante da mutazioni nel gene CFTR12. Esistono più modelli di mouse di PCD e CF, oltre a un numero sempre crescente di modelli di CHD. In definitiva le ciglia sono strutture versatili con molti ruoli chiave e un metodo per valutare la funzione delle ciglia respiratorie mobile in vivo può essere prezioso per lo studio pre-clinico e la valutazione degli effetti delle mutazioni e dei farmaci sulla clearance mucociliare (MCC)13. Il metodo sarebbe utile anche per valutare gli effetti di nuovi farmaci, terapia genica o interventi su MCC in questi modelli di topo.
Ci sono molti modelli diversi che sono stati utilizzati per valutare MCC. Un metodo degno di nota prevede l'uso di colorante blu metilene che è stato instillato nel bronco, con gioco misurato mediante misurazione fiberottica del movimento del colorante14. Questo metodo è limitato dalla capacità di osservare il movimento del colorante, che è più routine nell'uomo che nei modelli precli clinici del topo. Un altro metodo degno di nota è l'imaging a raggi X synchrotron phase-contrast (PCXI), che può essere usato per tracciare singole particelle in una via aerea. Questo metodo è relativamente nuovo e non ampiamente accessibile15. Esistono numerosi metodi ex vivo per valutare le vie aeree mediante l'accisa di una trachea per la video-microscopia, tuttavia questi modelli forniscono poca utilità nei pazienti umani16. Le tecniche ad alta risoluzione per l'imaging delle ciglia come la tomografia a coerenza ottica sono limitate allo stessomodo 17.
In questo articolo, presentiamo un metodo riproducibile per misurare MCC in vivo che è stato utilizzato per misurare le clearance polmonari in una miriade di modelli animali, nonché studiare MCC nella broncopneumopatia cronica ostruttiva e valutare gli effetti dei farmaci immunosoppressivi18,19. Questo metodo tiene traccia della clearance del colloide radiofarmaceutico 99mtecnezio-zolfo (99mTc-Sc), un radiotracciante particolato insolubile, dopo l'instillazione nei polmoni. Il radionuclide può quindi essere tracciato utilizzando una tomografia computerizzata a emissione di fotoni singola (SPECT)18,20. Abbiamo ulteriormente perfezionato questa tecnica per misurare MCC utilizzando la doppia modalità SPECT e l'imaging di tomografia computerizzata (CT) con co-localizzazione del conteggio dei radioisotopi ai polmoni e misurando la diminuzione di questi conteggi su 6 ore. L'imaging a doppia modalità, con la co-registrazione delle immagini CT e SPECT, consente una localizzazione accurata del conteggio delle radiazioni per la nostra regione di interesse, i polmoni. Sebbene descriviamo in dettaglio il metodo per la misurazione MCC nei topi, il protocollo può essere regolato per studiare MCC nei ratti. I collimatori dovrebbero essere regolati così come la dose di radiazioni. A nostro avviso, le scansioni MCC del topo sono più tecnicamente impegnative a causa delle piccole dimensioni degli animali, ma più utili dei ratti a causa del gran numero di modelli di topi consolidati di una serie di disturbi umani. Inoltre, a causa del loro minor costo e costo di manutenzione nelle colonie animali, una dimensione del campione più grande è più fattibile nei topi.

<table><tbody><tr><td>500 &amp;micro;m Unjacketed Fiber Optic Wire</td><td>Edmund Optics</td><td>02-532</td><td></td></tr><tr><td>99mTechnecium-Sulfur Colloid</td><td>Cardinal Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anesthesia Vaporizer</td><td>Vetland Medical</td><td>A13480</td><td></td></tr><tr><td>Durmont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>99150-20</td><td></td></tr><tr><td>FIJI ImageJ 2.0.0-rc-65/1.52p Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Introcan Safety Catheters 20G 1inch</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1534477</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein</td><td>118-2097</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Intubation Stand</td><td>Kent Scientific</td><td>ETI-MSE-01</td><td></td></tr><tr><td>Siemens Inveon dual-modality SPECT/CT</td><td>Siemens</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single Channel Anesthesia Stand</td><td>Summit Anesthesia Solutions</td><td>22860</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo evaluation of mucociliary clearance in mice

Le ciglia traslittele respiratorie, organelli specializzati della cellula, fiancheggiano la superficie apicale delle cellule epiteliali che rivestono le vie respiratorie. Battendo in modo metacronale, sincronale, questi organelli multipli, motili, a base di actina generano un flusso di fluidi cefalodi che cancella le vie respiratorie da inquinanti e agenti patogeni inalati. Con l'aumento dell'inquinamento ambientale, nuovi agenti patogeni virali e batteri emergenti resistenti a più farmaci, la clearance mucocilia generata dalle ciglia (MCC) è essenziale per mantenere la salute dei polmoni. McC è anche depresso in molteplici disturbi congeniti come la discinesia ciliare primaria, la fibrosi cistica e disturbi acquisiti come la broncopneumopatia cronica ostruttiva. Tutti questi disturbi hanno stabilito, in alcuni casi multipli, modelli di topo. In questa pubblicazione, dettagliamo un metodo utilizzando una piccola quantità di radioattività e imaging SPECT/CT a doppia modalità per misurare in modo accurato e riproducibile MCC nei topi in vivo. Il metodo consente il recupero dei topi dopo l'imaging, rendendo possibili le misurazioni seriali e testando longitudinalmente potenziali terapie nel tempo. I dati nei topi di tipo selvatico dimostrano la riproducibilità della misurazione MCC purché venga prestata un'adeguata attenzione ai dettagli e il protocollo rigorosamente rispettato.

Utilizzando questo protocollo, abbiamo anestetizzato i topi in una camera isoflurana (Figura 1A). Dopo aver raggiunto un livello adeguato di anestesia, i topi sono stati posizionati su supporti verticali (Figura 1B) e le corde vocali sono state visualizzate utilizzando un filo guida illuminato(Figura 1C-1D). I topi sono stati intubati e instillati con 0,2 mCi 99mTc-Sc in volumi di 10 μL attraverso una cannula e topi hanno permesso di inalare spontaneamente nei polmoni (Figura 1E-1F). Dopo l'acquisizione e l'elaborazione delle immagini, le immagini CT e SPECT sono state colocalizzate (Figura 2A) utilizzando il tubo fantasma come punto di riferimento (Figura 2B). Le maschere dei polmoni sono state generate dall'immagine CT (Figura 2C) e utilizzate per disegnare ROM attorno al polmone destro per l'analisi a 0 (Figura 2D) e 6 ore(Figura 2E-2F). Per testare la riproducibilità del protocollo, un totale di 8 topi sono stati scansionati due volte in giorni diversi con condizioni sperimentali identiche, con analisi che utilizzano un test t accoppiato che non mostra alcuna differenza significativa tra le scansioni ripetute (p-value=0.9904) (Figura 3A). Altri 2 topi sono stati scansionati tre volte in giorni diversi con condizioni sperimentali identiche, con un'analisi che utilizza ANOVA unidirezione che mostra una corrispondenza significativa tra le scansioni ripetute (valore p di 0,0041) (Figura 3B). In totale sono stati scansionati 8 topi e sono state visualizzate due immagini rappresentative(figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig01.jpg"> Figura 1: Intubazione del mouse e instillazione dell'isotopo. Immagini dei passaggi necessari per intubare e infondere isotopo nelle vie aeree. A) Il mouse viene anestetizzato in una camera. B) Il mouse anestetizzato è posto su un supporto verticale, sospeso dagli incisivi anteriori. C)Un filo in fibra ottica illuminato da 0,5 mm che funge da filo guida viene preparato facendolo passare attraverso una cannula da 20 G. D) La bocca del mouse viene aperta con le forcelle e illuminata utilizzando il filo guida illuminato per visualizzare le corde vocali. E) La cannula viene spinta attraverso le corde vocali e il filo guida viene rimosso. F)L'isotopo solubile viene instillato nella cannula utilizzando una pipetta e il topo può inalare spontaneamente l'isotopo nei polmoni. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61929/61929fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig02v2.jpg"> Figura 2: Immagini SPECT/CT di una scansione MCC. A) Un'immagine SPECT che è stata co-localizzata con un'immagine CT. B)Un'immagine CT con un tubo fantasma visibile utilizzato per la co-localizzazione. C) Una maschera delle vie aeree derivata binarizzando l'immagine CT ed eseguendo una proiezione di somma z-stack. D) La maschera CT co-localizzata con l'immagine SPECT. Un ROI per l'analisi è stato disegnato intorno al polmone destro. E)Una maschera delle vie aeree a 6 ore. F)Un'immagine co-localizzata CT e SPECT delle vie aeree a 6 ore con un ROI per l'analisi. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61929/61929fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig03.jpg"> Figura 3: Misurazioni di gioco degli stessi topi su più scansioni. A)Sono state misurate due autorizzazioni di ripetizione individuali per 8 topi senza variazioni nelle condizioni sperimentali. Un test t accoppiato ha mostrato che non c'era alcuna differenza significativa tra le scansioni ripetute con un valore p di 0,9904. B)Sono state misurate tre singole autorizzazioni di ripetizione per due topi senza variazioni nelle condizioni sperimentali. Un ANOVA uni-way ha mostrato che c'era una corrispondenza significativa tra le scansioni ripetute con un valore p di 0,0041. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61929/61929fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig04.jpg"> Figura 4: Immagini SPECT/CT colocalizzate delle vie aeree di 0 e 6 ore in 2 topi con ROM disegnate a 0 e 6 ore che delineano il polmone destro. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61929/61929fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Figura supplementare 1: Un video delle corde vocali illuminato da un filo in fibra ottica con l'effetto della respirazione visualizzato. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929supfig01.jpg" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa cifra.</a>
File supplementari. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61929/Supplemental_Files.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questi file.</a>

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In vivo Evaluation of Mucociliary Clearance in Mice

In questa pubblicazione descriviamo protocolli per la valutazione del gioco mucociliare delle vie aeree (MCC) nei topi in vivo utilizzando l'imaging a radionuclide a doppia modalità. Questo protocollo è progettato per una singola tomografia computerizzata ad emissione di fotoni (SPECT) e un protocollo di acquisizione della tomografia computerizzata (CT) utilizzando collimatori a tutto il corpo del mouse (MWB) in un doppio sistema SPECT/CT.

Valutazione in vivo del nulla osta mucociliario nei topi

Respiratory motile cilia, specialized organelles of the cell, line the apical surface of epithelial cells lining the respiratory tract. By beating in a ...

in-vivo-evaluation-of-mucociliary-clearance-in-mice

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

4.3K Views.  University of Pittsburgh School of Medicine. In questa pubblicazione descriviamo protocolli per la valutazione del gioco mucociliare delle vie aeree (MCC) nei topi in vivo utilizzando l'imaging a radionuclide a doppia modalità. Questo protocollo è progettato per una singola tomografia computerizzata ad emissione di fotoni (SPECT) e un protocollo di acquisizione della tomografia computerizzata (CT) utilizzando collimatori a tutto il corpo del mouse (MWB) in un doppio sistema SPECT/CT.

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Murine Model of Allergen Induced Asthma

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, with the prevalence increasing.2 As with other diseases, animal models of allergic airway disease greatly facilitate understanding of the underlying pathophysiology, help identify potential therapeutic targets, and allow preclinical testing of possible new therapies. Models of allergic airway disease have been developed in several animal species, but murine models are particularly attractive due to the low cost, ready availability, and well-characterized immune systems of these animals.3 Availability of a variety of transgenic strains further increases the attractiveness of these models.4 Here we describe two murine models of allergic airway disease, both employing ovalbumin as the antigen. Following initial sensitization by intraperitoneal injection, one model delivers the antigen challenge by nebulization, the other by intratracheal delivery. These two models offer complementary advantages, with each mimicking the major features of human asthma.5
The major features of acute asthma include an exaggerated airway response to stimuli such as methacholine (airway hyperresponsiveness; AHR) and eosinophil-rich airway inflammation. These are also prominent effects of allergen challenge in our murine models,5,6 and we describe techniques for measuring them and thus evaluating the effects of experimental manipulation. Specifically, we describe both invasive7 and non-invasive8 techniques for measuring airway hyperresponsiveness as well as methods for assessing infiltration of inflammatory cells into the airways and the lung. Airway inflammatory cells are collected by bronchoalveolar lavage while lung histopathology is used to assess markers of inflammation throughout the organ. These techniques provide powerful tools for studying asthma in ways that would not be possible in humans.

Experimental mouse models of allergic asthma offer new possibilities for studying disease pathogenesis and developing new therapeutics. These models are well suited to measuring factors governing the allergic immune response, airway inflammation, and pulmonary pathophysiology.

Modello murino di asma indotta da allergene

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly hydrated, forming a substantial endothelial surface layer (ESL) that contributes to the maintenance of endothelial function. As the endothelial glycocalyx is often aberrant in vitro and is lost during standard tissue fixation techniques, study of the ESL requires use of intravital microscopy. To best approximate the complex physiology of the alveolar microvasculature, pulmonary intravital imaging is ideally performed on a freely-moving lung. These preparations, however, typically suffer from extensive motion artifact. We demonstrate how closed-chest intravital microscopy of a freely-moving mouse lung can be used to measure glycocalyx integrity via ESL exclusion of fluorescently-labeled high molecular weight dextrans from the endothelial surface. This non-recovery surgical technique, which requires simultaneous brightfield and fluorescent imaging of the mouse lung, allows for longitudinal observation of the subpleural microvasculature without evidence of inducing confounding lung injury.

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

The endothelial glycocalyx/endothelial surface layer is ideally studied using intravital microscopy. Intravital microscopy is technically challenging in a moving organ such as the lung. We demonstrate how simultaneous brightfield and fluorescent microscopy may be used to estimate endothelial surface layer thickness in a freely-moving in vivo mouse lung.

Nella misura in vivo della superficie polmonare strato endoteliale mouse

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly ...

Medicina

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen interactions take advantage of intraperitoneal injections of select bacteria or pathogen associated molecular patterns (PAMPs) in mice. While these techniques have yielded tremendous data associated with infectious disease pathobiology, intraperitoneal injection models are not always appropriate for host-pathogen interaction studies in the lung. Utilizing an acute lung inflammation model in mice, it is possible to conduct a high resolution analysis of the host innate immune response utilizing lipopolysaccharide (LPS). Here, we describe the methods to administer LPS using nonsurgical oropharyngeal intratracheal administration, monitor clinical parameters associated with disease pathogenesis, and utilize bronchoalveolar lavage fluid to evaluate the host immune response. The techniques that are described are widely applicable for studying the host innate immune response to a diverse range of PAMPs and pathogens. Likewise, with minor modifications, these techniques can also be applied in studies evaluating allergic airway inflammation and in pharmacological applications.

The host immune response to pathogen infection is a tightly regulated process. Utilizing a lipopolysaccharide lung exposure model in mice, it is possible to conduct high resolution evaluations of the complex mechanisms associated with disease pathogenesis.

L&#39;utilizzo di orofaringea intratracheale PAMP Amministrazione e lavaggio broncoalveolare per valutare la risposta immunitaria nei topi Host

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

A Reversible, Non-invasive Method for Airway Resistance Measurements and Bronchoalveolar Lavage Fluid Sampling in Mice

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated procedures to obtain such measurements in the same animal are generally not feasible.  Here, we demonstrate protocols for obtaining from mice repeated measurements of AHR and bronchoalveolar lavage fluid samples.  Mice were challenged intranasally seven times over 14 days with a potent allergen or sham treated.  Prior to the initial challenge, and within 24 hours following each intranasal challenge, the same animals were anesthetized, orally intubated and mechanically ventilated.  AHR, assessed by comparing dose response curves of respiratory system resistance (RRS) induced by increasing intravenous doses of acetylcholine (Ach) chloride between sham and allergen-challenged animals, were determined.  Afterwards, and via the same intubation, the left lung was lavaged so that differential enumeration of airway cells could be performed.  These studies reveal that repeated measurements of AHR and BAL fluid collection are possible from the same animals and that maximal airway hyperresponsiveness and airway eosinophilia are achieved within 7-10 days of initiating allergen challenge.  This novel technique significantly reduces the number of mice required for longitudinal experimentation and is applicable to diverse rodent species, disease models and airway physiology instruments.  

Repeated measurements of rodent respiratory physiology and sampling of airway inflammatory cells are desirable, but generally not feasible. Here we describe a repeatable method for orally intubating mice that permits repeated measurements of airway hyperreactivity and sampling of airway inflammatory cells.

Un reversibile, metodo non invasivo per le misure di resistenza delle vie aeree e liquido di lavaggio broncoalveolare di campionamento nei topi

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated ...

Biologia

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Studiare comunità microbiche<em&gt; In Vivo</em&gt;: Un modello di interazione ospite-mediata tra<em&gt; Candida Albicans</em&gt; E<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Nei Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique

The forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational tool permitting the experimental assessment of lung function in mice in a comprehensive, detailed, precise and reproducible manner. It provides measurements of respiratory system mechanics through the analysis of pressure and volume signals acquired in reaction to predefined, small amplitude, oscillatory airflow waveforms, which are typically applied at the subject's airway opening. The present protocol details the steps required to adequately execute forced oscillation measurements in mice using a computer-controlled piston ventilator (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada). The description is divided into four parts: preparatory steps, mechanical ventilation, lung function measurements, and data analysis. It also includes details of how to assess airway responsiveness to inhaled methacholine in anesthetized mice, a common application of this technique which also extends to other outcomes and various lung pathologies. Measurements obtained in na&iuml;ve mice as well as from an oxidative-stress driven model of airway damage are presented to illustrate how this tool can contribute to a better characterization and understanding of studied physiological changes or disease models as well as to applications in new research areas.

The present protocol provides a detailed step-by-step description of the procedures required to execute measurements of respiratory system mechanics as well as the assessment of airway responsiveness to inhaled methacholine in mice using the forced oscillation technique (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada).

Valutazione della Meccanica Respiratoria sistema nei topi utilizzando la tecnica delle oscillazioni forzate

The  forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational  tool permitting the experimental assessment of lung function in mice ...

Assessment of Respiratory Function in Conscious Mice by Double-chamber Plethysmography

Air volume changes created by a conscious subject breathing spontaneously within a body box are at the basis of plethysmography, a technique used to non-invasively assess some features of the respiratory function in humans as well as in laboratory animals. The present article focuses on the application of the double-chamber plethysmography (DCP) in small animals. It provides background information on the methodology as well as a detailed step-by-step procedure to successfully assess respiratory function in conscious, spontaneously breathing animals in a non-invasive manner. The DCP can be used to monitor the respiratory function of multiple animals in parallel, as well as to identify changes induced by aerosolized substances over a chosen time period and in a repeated manner. Experiments on control and allergic mice are used herein to demonstrate the utility of the technique, explain the associated outcome parameters, as well as to discuss the related advantages and shortcomings. Overall, the DCP provides valid and theoretically sound readouts that can be trusted to evaluate the respiratory function of conscious small animals both at baseline and after challenges with aerosolized substances.

The objective of the present article is to provide a detailed description of the recommended procedures to evaluate respiratory function in conscious mice by double-chamber plethysmography.

Valutazione della funzione respiratoria in topi cosciente da doppia camera pletismografia

Air volume changes created by a conscious subject breathing spontaneously within a body box are at the basis of plethysmography, a technique used to ...

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary clearance function has been established. Freshly harvested mouse trachea is cut longitudinally through the trachealis muscle and mounted in a shallow walled chamber on a glass-bottomed dish. The trachea sample is positioned along its long axis to take advantage of the trachealis muscle to curl longitudinally. This allows imaging of ciliary motion in the profile view along the entire tracheal length. Videos at 200 frames/sec are obtained using differential interference contrast microscopy and a high speed digital camera to allow quantitative analysis of cilia beat frequency and ciliary waveform. With the addition of fluorescent beads during imaging, cilia generated fluid flow also can be determined. The protocol time spans approximately 30 min, with 5 min for chamber preparation, 5-10 min for sample mounting, and 10-15 min for videomicroscopy.

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An easy and reliable technique for visualizing and quantifying airway cilia motility and cilia generated flow using mouse trachea is described. This technique can be modified to determine how a wide range of factors influence cilia motility, including pharmacological agents, genetic factors, environmental exposures, and/or mechanical factors such as mucus load.

Metodo ex vivo per l&#39;imaging ad alta risoluzione di Cilia Motilità in roditori Airway epiteli

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful in cases of attenuated, oligo- or mono-symptomatic forms of CF usually diagnosed later in life, and of CF-related disorders such as congenital bilateral absence of vas deferens, idiopathic chronic pancreatitis, allergic bronchopulmonary aspergillosis, and bronchiectasis. In both clinical and preclinical settings, the test has been used as a biomarker to quantify responses to targeted therapeutic strategies for CF. Adapting the test to a mouse is challenging and can entail an associated mortality. This paper describes the adequate depth of anesthesia required to maintain a nasal catheter in situ for continuous perfusion. It lists measures to avoid broncho-aspiration of solutions perfused in the nose. It also describes the animal care at the end of the test, including administration of a combination of antidotes of the anesthetic drugs, leading to rapidly reversing the anesthesia with full recovery of the animals. Representative data obtained from a CF and a wild-type mouse show that the test discriminates between CF and non-CF. Altogether, the protocol described here allows reliable measurements of the functional status of trans-epithelial chloride and sodium transporters in spontaneously breathing mice, as well as multiple tests in the same animal while reducing test-related mortality.

Here, we present a protocol to measure nasal potential difference in mice. The test quantifies the function of transmembrane ion transporters such as the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and the epithelial sodium channel. It is valuable to evaluate the efficacy of novel therapies for cystic fibrosis.

Differenza di potenziale nasale per quantificare il trasporto Trans-epiteliale ionico in topi

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Pletismografia non invasiva in tempo reale di tutto il corpo per la sensibilità alla tosse nei topi

Methods for Detecting Cough and Airway Inflammation in Mice

Chronic cough, which lasts for more than 8 weeks, is one of the most common complaints requiring medical attention, and patients suffer from a huge socioeconomic burden and a marked decrement in quality of life. Animal models can mimic the complex pathophysiology of the cough and are important tools for cough research. The detection of cough sensitivity and airway inflammation is of great significance for studying the complex pathological mechanism of cough. This article describes the measurement of cough using a noninvasive and real-time whole-body plethysmography (WBP) system and the normative procedures for harvesting tissue samples (including blood, lung, spleen, and trachea) of mice. It introduces some methods to assess airway inflammation, including pathological changes in hematoxylin and eosin (HE)-stained lung and trachea sections, the total protein concentration, the uric acid concentration, and the lactate dehydrogenase (LDH) activity in the supernatant of bronchoalveolar lavage fluid (BALF), and the leukocytes and differential cell counts of BALF. These methods are reproducible and serve as valuable tools to study the complex pathophysiology of cough.

Autore in primo piano: Indagine sulla fisiopatologia della tosse cronica

Here, we describe the measurement of cough using a noninvasive and real-time whole-body plethysmography (WBP) system and the normative procedures for harvesting tissue samples of mice and introduce some methods to assess airway inflammation.

Metodi per rilevare la tosse e l'infiammazione delle vie aeree nei topi

Chronic cough, which lasts for more than 8 weeks, is one of the most common complaints requiring medical attention, and patients suffer from a huge ...

Valutazione in vivo del nulla osta mucociliario nei topi

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