Nasır üretimi için eksplant olarak genç çiçeklenmeler, hızlı ve verimli bir gen dönüşümü ve gen fonksiyonunu ortaya çıkarmak ve mahsul üniversiyonu için bir rejenerasyon yöntemi oluşturmak için önemlidir. Nasır üretimi için eksplant olarak genç çiçeklenmeler, hızlı ve verimli bir gen dönüşümü ve gen fonksiyonunu ortaya çıkarmak için rejenerasyon yönteminin oluşturulması nda önemlidir. Bu tekniğin video gösterimi, izleyicinin zaman ve çaba harcamadan istenen transgenik hizalamayı üretmek için malzemeleri koruma sürecini anlamasına yardımcı olacaktır.
Onlar yaprak kılıfı ile kaplı olduğundan emin olmak, çeltik alanından veya meyozaşamasında bir sera genç pirinç çiçeklenmeleri toplayarak başlayın. Her çiçeklenmeyi %70 alkol bezi ile silin ve kesmeden önce kurutun. Çiçeklenmeyi steril bir laboratuvar tezgahına getirin ve sterilize edilmiş makasla küçük parçalara bölün, ardından kesimleri NBD2 ortamı içeren bir Petri plakasına aktarın.
Nasırı indüklemek için 10 ila 14 gün boyunca 26 santigrat derecede karanlıkta plakayı kuluçkaya yatırın. Dönüşümü gerçekleştirmek için, seçici antibiyotiklerle beyaz EB plakasından tek bir koloniyi 50 mililitrelik konik steril test tüpünde aynı antibiyotikleri içeren beş mililitre likit YEB ortamına aktarın. Bakteriler 0,5 OD 600 büyüyene kadar 250 kez g ve 25-28 santigrat derece bir orbital shaker üzerinde tüp çalkalayın.
250 mililitrelik konik bir şişede aynı seçici antibiyotiklerle 100 mililitre YEB ortamına bir mililitre bakteriyel süspansiyon ekleyin ve dört saat boyunca 250 kez g ve 28 santigrat derecede bir orbital shaker üzerindeki şişeyi sallayın. Bakteri toplamak için oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 4, 000 g kültür santrifüj. Supernatant atın ve aam as orta ile pelet resuspend, sonra 0,4 bir OD 600 süspansiyon seyreltin.
Kuluçka sonra, 150 mililitre steril şişe içine yaklaşık 150 sağlıklı açık sarı embriyojenik calli toplamak. Şişeiçine bakteri hücresi süspansiyon 50 ila 75 mililitre ekleyin ve sonra 10 ila 20 dakika için calli batırmak için orta taze AAM olarak 10 ila 25 mililitre ekleyin, zaman zaman sallayarak. Şişeden bakteriyel süspansiyonu dikkatlice dökün ve calli'yi steril filtre kağıdıyla kurulayın, ardından NBD AS orta ile bir Petri kabına yerleştirin ve filtre kağıdıyla kapatın.
Calli'yi 25-28 derecede karanlıkta üç gün boyunca kuluçkaya yatırın, bakteriyel aşırı büyüme kontrol edin. Üç günlük birlikte ekimden sonra calli'yi filtre kağıdı kullanarak steril bir Petri kabına aktarın, ardından temiz bir bankta iki saat boyunca havakuru. Calli'nin filtre kağıdına yapışmadığından emin olun ve bunları birincil seçim ortamı NBD2'ye aktarın.
İki hafta sonra, taze seçim ortamı içeren yeni bir plaka eşit calli aktarın, sonra farklılaşma için taze MS orta calli hareket ve daha fazla sürgünler çoğaltmak için litre Hygromycin başına 10 miligram ile MS orta ateş tomurcukları. Kök indüksiyonu için yeni sürgünleri yarı MS ortamına aktarın ve 25-28 santigrat derecede ışık altında kültürleyin. Dönüştürülmüş bitkiler iki hafta içinde kök üretmelidir.
Üreme fenotip gözlemi yapmak için, florid'den palea ve lemma'yı çıkarın ve tüm anthers'ı stereo mikroskop altında görüntüleyin. Polen canlılığını gözlemlemek için, çiçek tezinden önce olgun pirinç başaklarını toplayıp palea ve lemma'yı çıkartın. Altı anthers alın ve bir cam slayt üzerine yerleştirin.
Distile su bir damla ekleyin, polen taneleri serbest bırakmak için cımbız ile anther ezmek, sonra iyot çözeltisi iki ila üç damla ekleyin ve bir coverslip ile kaplayın. Düşük büyütme mikroskobu altında slayt gözlemleyin. Siyaha boyanan polen taneleri, rengi olmayan veya boyalı sarı kahverengi taneler bodur veya dejenere olurken daha güçlü bir canlılık gösterir.
Enine kesitli mikroskopi yapmak için, slaytları 30 dakika boyunca lekelemek için %0,5 toluidin mavisi solüsyonu kullanın, ardından suyla durulayın ve duman kaputunda kurulayın. Kurutuldıktan sonra, nötr ağaç tutkal ile slaytmühür, yavaşça slayt üzerine bir coverslip yerleştirin ve duman kaputunda kuru, sonra bir mikroskop altında örnek görüntü. Bu protokol pirinç Agrobacterium aracılı genetik dönüşüm tarafından steril bir çizgi oluşturmak için kullanılmıştır.
Embriyojenik calli doğrudan dönüşüm için kullanılan veya daha fazla enfeksiyon için daha calli elde etmek için proliferasyon için alt kültüre. 48 saat boyunca birlikte işlendikten sonra, calli ikinci tur seçim ortamına kaydırıldı. 10 ila 14 gün sonra, dönüştürülmüş calli yeni oluşan microcalli gösterdi ise dönüştürülmemiş calli kahverengi döndü ve öldü.
Daha sonra sağlıklı ve kremsi renkli calli rejenerasyon ortamına aktarıldı. Dönüştürülmüş calli yavaş yavaş yeşil noktalar gösterdi. Bu yeşil noktalar, sürgün büyümesi için rejenerasyon orta kültürlü ve daha sonra kökleri ikna etmek için yarım MS orta kaymıştır.
Daha sonra, iyi gelişmiş kökleri ile sağlıklı ve güçlü büyüyen sürgünler hasat edildi. Toplamda 21 rejenere fide elde edildi. Hygromycin bölgesi için PCR amplifikasyonu dönüşüm sıklığının yaklaşık %85.71 olduğunu gösterdi Transformantlar sgRNA hedef bölgelerindeki mutasyonları tanımlamak için genotipli edildi.
18 transgenik bitki arasında sekiz heterozigot çizgi ve üç homozigot çizgi CRISPR CAS9 pozitif idi. Homozigot nakavt mutantları temel erkek üreme organı gözlemi ile doğrulandı. osabcg15 anthers vahşi tip daha küçük ve soluk ve olgun polen taneleri yoktu.
Osabcg15'te anther morfolojik defektlerini araştırmak için enine kesit mikroskopisi yapıldı. Evre 10,vahşi tip mikrosporlar yuvarlak şekilli hale geldi ve koyu mavi lekeli exine ile aşılandı. Buna karşılık, osabcg15 mikrosporlar çöktü ve bozuldu.
Bu protokolü denerken, toplanan malzemenin meyozaşamasında olduğundan emin olmak ve calli'nin hava kurak zamanını kontrol etmek önemlidir.
