Junge Blütenstände als Explantation für die Callusproduktion sind wichtig, um eine schnelle und effiziente Gentransformation und eine Regenerationsmethode zur Aufdeckung der Genfunktion sowie zur Verbesserung der Ernte zu etablieren. Junge Blütenstände als Explantation für die Callusproduktion sind wichtig, um eine schnelle und effiziente Gentransformation und die Regenerationsmethode zur Enthüllung der Genfunktion zu etablieren. Video-Demonstration dieser Technik wird dem Betrachter helfen, den Prozess der Wartung der Materialien zu verstehen, um die gewünschte transgene Ausrichtung zu produzieren, ohne Zeit und Mühe zu verschwenden.
Beginnen Sie mit dem Sammeln von jungen ReisBlüten aus dem Reisfeld oder einem Gewächshaus in der Meiose-Phase, um sicherzustellen, dass sie mit dem Blattmantel bedeckt sind. Wischen Sie jeden Blütenstand mit einem 70%alkoholabstrich ab und lassen Sie ihn vor dem Schneiden trocknen. Bringen Sie den Blütenstand auf eine sterile Laborbank und schneiden Sie ihn mit einer sterilisierten Schere in kleine Stücke, und übertragen Sie die Stecklinge dann auf eine Petriplatte, die NBD2-Medium enthält.
Inkubieren Sie die Platte im Dunkeln bei 26 Grad Celsius für 10 bis 14 Tage, um Callus zu induzieren. Um die Transformation durchzuführen, übertragen Sie eine einzelne Kolonie von der weißen EB-Platte mit selektiven Antibiotika auf fünf Milliliter flüssiges YEB-Medium, das die gleichen Antibiotika in einem 50 Milliliter konischen sterilen Reagenzglas enthält. Schütteln Sie die Röhre auf einem Orbital-Shaker bei 250 mal g und 25 bis 28 Grad Celsius, bis Bakterien auf eine OD 600 von 0,5 wachsen.
Fügen Sie einen Milliliter bakterielle Suspension zu 100 Milliliter YEB Medium mit den gleichen selektiven Antibiotika in einem 250 Milliliter konischen Kolben und schütteln Sie den Kolben auf einem Orbital-Shaker bei 250 mal g und 28 Grad Celsius für vier Stunden. Zentrifugieren Sie die Kultur bei 4.000 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur, um die Bakterien zu sammeln. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet mit DemaUM AS Medium wieder auf, und verdünnen Sie die Suspension dann auf eine OD 600 von 0,4.
Sammeln Sie nach der Inkubation rund 150 gesunde hellgelbe embryogene Calli in einen 150 Milliliter sterilen Kolben. Fügen Sie 50 bis 75 Milliliter der bakteriellen Zellsuspension in den Kolben und fügen Sie dann 10 bis 25 Milliliter frisches AAM AS Medium hinzu, um den Calli für 10 bis 20 Minuten einzutauchen, gelegentlich schüttelnd. Gießen Sie die bakterielle Suspension vorsichtig aus dem Kolben und trocknen Sie die Calli mit sterilem Filterpapier, legen Sie sie dann auf eine Petrischale mit NBD AS Medium und bedecken Sie sie mit Filterpapier.
Inkubieren Sie die Calli bei 25 bis 28 Grad Celsius im Dunkeln für drei Tage, überprüfen Sie sie auf bakterielles Überwuchern. Nach drei Tagen Kokultivierung die Calli mit Filterpapier auf eine sterile Petrischale übertragen und dann zwei Stunden auf einer sauberen Bank an die Luft trocknen. Stellen Sie sicher, dass die Calli nicht am Filterpapier behaftet sind, und übertragen Sie sie an das primäre Auswahlmedium NBD2.
Nach zwei Wochen die Calli gleichmäßig auf eine neue Platte mit frischem Selektionsmedium übertragen, dann die Calli zur Differenzierung auf frisches MS-Medium und die Triebknospen mit 10 Milligramm pro Liter Hygromycin auf MS-Medium verschieben, um mehr Triebe zu vermehren. Übertragen Sie die neuen Triebe in das halbe MS-Medium für die Wurzelinduktion und kultiieren Sie sie bei 25 bis 28 Grad Celsius unter Licht. Die transformierten Pflanzen sollten innerhalb von zwei Wochen Wurzeln produzieren.
Um reproduktive Phänotyp Beobachtung durchzuführen, entfernen Sie die Paläa und Lemma aus dem Florid und Bild der ganzen Anther unter einem Stereomikroskop. Um die Lebensfähigkeit der Pollen zu beobachten, pflücken Sie reife Reisspieße vor der Blütenanthese und entfernen Sie die Paläa und das Lemma, um die Anther freizusetzen. Nehmen Sie sechs Anther und legen Sie sie auf eine Glasrutsche.
Fügen Sie einen Tropfen destilliertes Wasser hinzu, zerkleinern Sie den Anther mit einer Pinzette, um die Pollenkörner freizusetzen, dann fügen Sie zwei bis drei Tropfen Jodlösung hinzu und decken Sie ihn mit einem Deckelabschlag ab. Beobachten Sie das Dia unter einem Mikroskop mit niedriger Vergrößerung. Pollenkörner, die schwarz gefärbt sind, zeigen eine kräftigere Lebensfähigkeit, während Körner ohne Farbe oder die gelbbraun gefärbten verkümmert oder degeneriert sind.
Um die Transverformungsmikroskopie durchzuführen, verwenden Sie 0,5% Toluidin-Blaulösung, um die Dias 30 Minuten lang zu färben, dann mit Wasser abspülen und in der Dunstabzugshaube trocknen. Nach dem Trocknen die Dias mit neutralem Baumkleber versiegeln, einen Deckelrutsch vorsichtig auf den Schlitten legen und in der Dunstabzugshaube trocknen und dann die Probe unter dem Mikroskop abbilden. Dieses Protokoll wurde verwendet, um eine männliche sterile Linie von Agrobacterium-vermittelte genetische Transformation in Reis zu schaffen.
Die embryogenen Calli wurden direkt für die Umwandlung verwendet oder für die Proliferation subkultiviert, um mehr Calli für eine weitere Infektion zu erhalten. Nach 48 Stunden Mitkultivierung wurden die Calli in eine zweite Runde des Auswahlmediums verlegt. Nach 10 bis 14 Tagen zeigten transformierte Calli neu gebildete Mikrocalli, während die untransformierten Calli braun wurden und starben.
Später wurden gesunde und cremig gefärbte Calli in regenerationsmittel übertragen. Der verwandelte Calli zeigte nach und nach grüne Flecken. Diese grünen Flecken wurden im Regenerationsmedium kultiviert, um das Triebwachstum zu ermöglichen, und dann in die Hälfte des MS-Mediums verschoben, um Wurzeln zu induzieren.
Später wurden gesunde und kräftig wachsende Triebe mit gut entwickelten Wurzeln geerntet. Insgesamt wurden 21 regenerierte Sämlinge gewonnen. Die PCR-Verstärkung für die Hygromycin-Region zeigte, dass die Transformationshäufigkeit etwa 85,71% betrug. Die Transformationsmittel wurden genotypisiert, um die Mutationen an den sgRNA-Zielstandorten zu identifizieren.
Unter den 18 transgenen Pflanzen waren acht heterozygote Linien und drei homozygote Linien CRISPR CAS9 positiv. Die homozygoten Knockout-Mutanten wurden durch grundlegende männliche Fortpflanzungsorganbeobachtung validiert. Die Anther von osabcg15 waren kleiner und blasser als die der wilden Art und es fehlten reife Pollenkörner.
Transversalschnittmikroskopie wurde durchgeführt, um die anther morphologischen Defekte in osabcg15 zu untersuchen. In Stufe 10 wurden wilde Mikrosporen rund geformt und mit dunkelblau gebeiztem Exine vakant. Im Gegensatz dazu brach die osabcg15 Mikrosporen zusammen und degradierte.
Beim Versuch dieses Protokolls ist es wichtig, sicherzustellen, dass sich das gesammelte Material im Meiosestadium befindet, und die Lufttrockenzeit der Calli zu steuern.
