Tıbbi uygulamalar için yeni malzemelerin patlamasıyla, ilk tarama sistematik olarak yapılmalıdır, bu nedenle bu protokol yeni biyomateryalleri geliştirmeyi ve karakterize etmeyi amaçlayan araştırmacılar için temel bir araç olabilir. Metodoloji, hem katı hem de sıvı biyomateryallerin ve farmasötik formülasyonların sitotoksisite ve biyoaktivitesinin kantitatif ve kalitatif olarak değerlendirilmesine izin verir. Hücre maruziyetini takiben, birkaç tamamlayıcı tahlil yapılabilir.
Biyomateryal sitotoksisitenin kurulmasının klinik uygulama için ilgili etkileri olabilir. Örneğin, bu bilgi klinisyene belirli bir hasta veya durum için en uygun biyomateryali seçme yetkisi verebilir. Bu protokol, diş hekimliği, ortopedi, cerrahi, oftalmoloji, kardiyoloji gibi farklı alanlarda yeni biyomateryallerin karakterizasyonuna izin verir.
Değerlendirme performansı, sitotoksisitenin yanı sıra canlı dokulardaki biyomateryal biyoaktivitesinin sonucuna varılmasını sağlamalıdır. Deneyin başlangıcına mümkün olduğunca yakın, taze hazırlanmış biyomalzemeyi PVC kalıplarına yüklemek için bir spatula kullanın ve malzemenin oda sıcaklığında uygun bir süre için ayarlanmasına izin verin. Malzeme katılaştığında, peletleri kalıplardan çıkarın ve uygun boyutta bir kaba yerleştirin.
Daha sonra peletleri ultraviyole ışık lambası altında her tarafta 20 dakika boyunca sterilize edin. Biyomateryalleri peletlerden çıkarmak için, sterilize edilmiş peletleri 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin ve peletlere uygun hücre kültürü ortamını ekleyin. Tüpleri 24 saat boyunca 37 santigrat dereceye yerleştirin.
Ertesi gün, ekstraktı uygun hacimlerde seyreltmek için taze ortam kullanın. Biyomateryal maruziyetine yanıt olarak hücre morfolojisini değerlendirmek için, çok kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna uygun boyutta steril bir cam kapak parçası yerleştirmek için steril cımbız kullanın. Her bir kapak kaymasına yeterli konsantrasyonda hücreler ekleyin ve gece boyunca inkübatöre yerleştirin.
Her bir kuyucuğa ilgilenilen ekstrakt seyreltmesinin uygun hacmini ekleyin ve hücreleri uygun inkübasyon süresi için hücre kültürü inkübatörüne geri döndürün. Kuluçkanın sonunda, kapakların oda sıcaklığında kurumasını sağlamak için süpernatantı her bir kuyucuktan aspire edin. Numuneler kuruduktan sonra, oda sıcaklığında üç dakikalık bir inkübasyon için her bir kapak fişini yeterli miktarda May-Grunwald çözeltisi ile örtün.
Boyayı çıkardıktan sonra, kapak fişlerini bir dakika boyunca uygun miktarda damıtılmış suyla yıkayın, ardından yeterli miktarda Giemsa çözeltisinde 15 dakikalık bir inkübasyonla yıkayın. Kuluçka işleminin sonunda, kapakları akan suda yıkayın ve hücreleri ışık mikroskobu ile görüntüleyin. Gösterildiği gibi ilgilenilen biyomateryale maruz kaldıktan sonra protein ekspresyon değerlendirmesi ile hücre fonksiyonunu değerlendirmek için, hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 3.7 paraformaldehit ile sabitlemeden önce hücrelerin her bir kuyucuğunu PBS ile yıkayın.
İnkübasyonun sonunda, hücreleri PBS ile iki kez yıkayın ve PBS'de% 0.5 Triton ile hücreleri 15 dakika boyunca geçirgenleştirin. Geçirgenliğin sonunda, peroksidazın PBS'de% 0.3 hidrojen peroksit ile beş dakika boyunca bloke edilmesi, ardından PBS ile iki yıkama yapılması takip edilir. İkinci yıkamadan sonra, spesifik olmayan bağlanmayı 45 dakika boyunca% 2 BSA ile bloke etmeden önce% 0.5 BSA ile hücreleri iki kez yıkayın.
İnkübasyonun sonunda, hücreleri oda sıcaklığında 60 dakika boyunca ilgilenilen proteine karşı birincil bir antikor ile inkübe etmeden önce% 0.5 BSA ile bir kez yıkayın, ardından taze% 0.5 BSA ile beş yıkama yapın. Son yıkamadan sonra, hücreleri oda sıcaklığında 90 dakika boyunca uygun ikincil antikorla inkübe edin, ardından% 0.5 BSA'da beş bir dakikalık yıkama yapın. Son yıkamadan sonra, hücreleri 25 dakika boyunca substrat konsantrasyonlarının mililitresi başına 20 mikrolitre kromojende uygun bir substrat ve kromojen karışımı ile inkübe edin.
İnkübasyonun sonunda, kültürleri PBS'de% 0.5 BSA ile iki kez yıkayın ve hücreleri 15 dakika boyunca hematoksilin ile karşı boyayın. Karşı boyanmış hücreleri beş dakika boyunca litre amonyak başına 0.037 mol ile yıkayın. Daha sonra fazla boyayı çıkarmak için damıtılmış suyla beş dakika yıkayın ve kapakları slaytlara monte etmek için gliserol kullanın.
Ekstraktla muamele edilmiş hücre kültürlerinde mineralize birikintilerin oluşumunu değerlendirmek için, hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitlemeden önce PBS ile her bir kuyuyu üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, hücreleri karanlıkta 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca uygun miktarda alizarin kırmızı boyama çözeltisi ile boyayın. İnkübasyonun sonunda, fazla boya tamamen çıkarılana kadar kuyucukları PBS ile yıkayın ve hücreleri ışık mikroskobu ile görüntüleyin.
Daha sonra, oda sıcaklığında karıştırarak 40 dakikalık bir inkübasyon için her bir kuyucuğa ekstraksiyon çözeltisi ekleyin ve her bir kuyucuktaki emilimi, 490 nanometre dalga boyunda bir spektrofotometre üzerinde ölçün. Bir MTT testi, malzemelerin sitotoksisitesine, metabolik aktivite üzerindeki etkileri ile ölçüldüğü gibi hızlı ve basit bir şekilde genel bir bakış elde etmek için kullanılabilir. Hücre canlılığı analizleri aynı zamanda ilgili bir materyalin sitotoksisitesinin değerlendirilmesine de izin verir, çünkü daha yüksek sitotoksisiteye sahip malzemeler aynı konsantrasyonda daha yüksek bir hücre ölümü yüzdesini indükler.
%30'dan fazla azalma kritik olarak kabul edilir ve malzemeleri düşük biyouyumluluk riski altında olarak tanımlar. Ek olarak, daha fazla sitotoksik materyal, hücre canlılığında vurgulanmış bir azalma ve geç apoptoz ve nekroz hücre ölümü profili ile karakterize edilirken, daha az sitotoksik materyal daha az hücre ölümüne ve daha apoptotik ve geç apoptotik profile neden olur. Morfolojik değerlendirme, hücre morfolojisindeki değişiklikler apoptotik veya nekrotik bir profili gösterebildiği ve materyal parçacıklarının varlığını ortaya çıkardığı için hücre canlılığı değerlendirmesini tamamlar.
Ek olarak, ilgilenilen materyallerin protein ekspresyonu üzerindeki etkileri, canlılık üzerindeki etkilerden bağımsız olarak gözlemlenebilir. Örneğin, bu analizde, bir materyal protein ekspresyonunda bir artışa neden olurken, diğeri önemli bir düşüşü teşvik etti. Her iki durumda da, ekstraktların konsantrasyonu protein ekspresyonunu doğrudan etkiledi.
Ekstraktların hazırlanmasında, uygun biyomateryal yüzeyinin orta hacim oranlarına oranı kritik öneme sahiptir. Ek olarak, numuneler özelliklerini değiştirmeyen yöntemler kullanılarak sterilize edilmelidir. Hatırlanması gereken bir diğer ayrıntı, ayarlanmadan kaydedilmesi gereken pH ekstraktlarıdır.
Gerekirse, ek denetimler gerçekleştirin. Biyomateryal ekstraktları, kimya ve biyokimya çalışmalarının yanı sıra diğer birçok moleküler biyoloji tekniği için de kullanılabilir. Elde edilen sonuçlar, gelecekteki in vivo biyouyumluluk testleri için temel oluşturmaktadır.
Sitotoksisite değerlendirmesi, tıbbi kullanıma yönelik herhangi bir materyalin geliştirilmesi için çok önemlidir. Bu nedenle, bu protokol yeni biyomateryalleri veya halihazırda var olan diğer biyomateryallerin farklı tıbbi alanlarda yeni uygulamalarını değerlendirmek için sistematik ve kapsamlı bir yaklaşım sunmaktadır.
