Avec l’explosion de nouveaux matériaux pour des applications médicales, le dépistage initial devrait être effectué systématiquement, afin que ce protocole puisse être un outil fondamental pour les chercheurs visant à développer et à caractériser de nouveaux biomatériaux. La méthodologie permet l’évaluation quantitative et qualitative de la cytotoxicité et de la bioactivité des biomatériaux et des formulations pharmaceutiques, solides et liquides. Suite à l’exposition cellulaire, plusieurs dosages complémentaires peuvent être effectués.
L’établissement de la cytotoxicité des biomatériaux peut avoir des implications pertinentes pour la pratique clinique. Par exemple, ces connaissances peuvent permettre au clinicien de choisir le biomatériau le plus approprié pour un patient ou une condition spécifique. Ce protocole permet la caractérisation de nouveaux biomatériaux dans différents domaines tels que la dentisterie, l’orthopédie, la chirurgie, l’ophtalmologie, la cardiologie, entre autres.
La performance de l’évaluation devrait permettre de conclure sur la bioactivité des biomatériaux dans les tissus vivants en plus de la cytotoxicité. Aussi près que possible du début de l’expérience, utilisez une spatule pour charger le biomatériau fraîchement préparé dans les moules en PVC et laissez le matériau durcir pendant la durée appropriée à température ambiante. Lorsque le matériau s’est solidifié, retirez les granulés des moules et placez-les dans un récipient de taille appropriée.
Ensuite, stérilisez les granulés sous une lampe à lumière ultraviolette pendant 20 minutes de chaque côté. Pour extraire les biomatériaux des granulés, placez les granulés stérilisés dans un tube de 50 millilitres et ajoutez le milieu de culture cellulaire approprié aux granulés. Placez les tubes à 37 degrés Celsius pendant 24 heures.
Le lendemain, utiliser un milieu frais pour diluer l’extrait aux volumes d’intérêt appropriés. Pour évaluer la morphologie cellulaire en réponse à l’exposition à des biomatériaux, utilisez une pince à épiler stérile pour placer une couche de verre stérile de taille appropriée dans chaque puits d’une plaque multipuits. Ajouter des cellules à chaque lamelle de couverture à une concentration adéquate et placer dans l’incubateur pendant la nuit.
Ajouter le volume approprié de dilution de l’extrait d’intérêt à chaque puits et retourner les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire pour la période d’incubation appropriée. À la fin de l’incubation, aspirer le surnageant de chaque puits pour permettre aux lamelles de couverture de sécher à température ambiante. Lorsque les échantillons ont séché, couvrir chaque lamelle de couverture avec un volume suffisant de solution May-Grunwald pour une incubation de trois minutes à température ambiante.
Après avoir retiré le colorant, laver les lamelles de couverture avec un volume approprié d’eau distillée pendant une minute, suivie d’une incubation de 15 minutes dans un volume suffisant de solution Giemsa. À la fin de l’incubation, lavez les lames de couverture à l’eau courante et imagez les cellules par microscopie optique. Pour évaluer la fonction cellulaire par évaluation de l’expression protéique après exposition au biomatériau d’intérêt tel que démontré, laver chaque puits de cellules avec du PBS avant de fixer les cellules avec 3,7% de paraformaldéhyde pendant 30 minutes à température ambiante.
À la fin de l’incubation, laver les cellules deux fois avec du PBS et perméabiliser les cellules avec 0,5% de Triton dans du PBS pendant 15 minutes. À la fin de la perméation, bloquer la peroxydase avec 0,3% de peroxyde d’hydrogène dans du PBS pendant cinq minutes, suivi de deux lavages avec du PBS. Après le deuxième lavage, laver les cellules deux fois avec 0,5% BSA avant de bloquer la liaison non spécifique avec 2% BSA pendant 45 minutes.
À la fin de l’incubation, laver les cellules une fois avec 0,5% de BSA avant d’incuber les cellules avec un anticorps primaire contre la protéine d’intérêt pendant 60 minutes à température ambiante, suivies de cinq lavages avec 0,5% de BSA frais. Après le dernier lavage, incuber les cellules avec l’anticorps secondaire approprié d’intérêt pendant 90 minutes à température ambiante, suivies de cinq lavages d’une minute dans 0,5% BSA. Après le dernier lavage, incuber les cellules avec un substrat approprié et un mélange de chromogènes à 20 microlitres de chromogène par millilitre de concentrations de substrat pendant 25 minutes.
À la fin de l’incubation, laver les cultures deux fois avec 0,5% de BSA dans du PBS et contre-colorer les cellules avec de l’hématoxyline pendant 15 minutes. Lavez les cellules contre-colorées pendant cinq minutes avec 0,037 mole par litre d’ammoniaque. Ensuite, lavez pendant cinq minutes avec de l’eau distillée pour éliminer tout excès de colorant, et utilisez du glycérol pour monter les lames de couverture sur des lames.
Pour évaluer la formation de dépôts minéralisés dans les cultures cellulaires traitées à l’extrait, laver chaque puits trois fois avec du PBS avant de fixer les cellules avec 4% de paraformaldéhyde pendant 15 minutes à température ambiante. Après le dernier lavage, colorer les cellules avec un volume approprié de solution de coloration rouge alizarine pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius dans l’obscurité. À la fin de l’incubation, laver les puits avec du PBS jusqu’à ce que l’excès de colorant ait été complètement éliminé et imager les cellules par microscopie optique.
Ajoutez ensuite une solution d’extraction à chaque puits pour une incubation de 40 minutes sous agitation à température ambiante et mesurez l’absorbance dans chaque puits sur un spectrophotomètre à une longueur d’onde de 490 nanomètres. Un test MTT peut être utilisé pour obtenir un aperçu de la cytotoxicité des matériaux d’une manière rapide et directe, mesurée par ses effets sur l’activité métabolique. Les analyses de viabilité cellulaire permettent également d’évaluer la cytotoxicité d’un matériau d’intérêt, car les matériaux ayant une cytotoxicité plus élevée induisent un pourcentage plus élevé de mort cellulaire à la même concentration.
Les réductions de plus de 30 % sont considérées comme critiques et définissent les matériaux comme présentant un risque de faible biocompatibilité. En outre, un plus grand nombre de matériaux cytotoxiques sont caractérisés par une diminution accentuée de la viabilité cellulaire et un profil d’apoptose et de nécrose tardives des cellules, tandis que moins de matériaux cytotoxiques induisent moins de mort cellulaire et un profil apoptotique et apoptotique tardif. L’évaluation morphologique complète l’évaluation de la viabilité cellulaire, car les changements dans la morphologie cellulaire peuvent indiquer un profil apoptotique ou nécrotique, ainsi que révéler la présence de particules matérielles.
En outre, les effets des matériaux d’intérêt sur l’expression des protéines peuvent être observés indépendamment des effets sur la viabilité. Par exemple, dans cette analyse, un matériau a induit une augmentation de l’expression des protéines, tandis que l’autre a favorisé une diminution significative. Dans les deux cas, la concentration des extraits a directement influencé l’expression protéique.
Dans la préparation des extraits, des rapports surface / volume moyen appropriés du biomatériau sont essentiels. De plus, les échantillons doivent être stérilisés à l’aide de méthodes qui n’altèrent pas leurs propriétés. Un autre détail à retenir est les extraits de pH, qui doivent être enregistrés sans ajustement.
Si nécessaire, effectuez des contrôles supplémentaires. Les extraits de biomatériaux peuvent être utilisés pour des études de chimie et de biochimie, ainsi que pour plusieurs autres techniques de biologie moléculaire. Les résultats obtenus constituent la base des futurs tests de biocompatibilité in vivo.
L’évaluation de la cytotoxicité est cruciale pour le développement de tout matériel destiné à un usage médical. Par conséquent, ce protocole fournit une approche systématique et complète pour évaluer de nouveaux biomatériaux ou de nouvelles applications d’autres déjà existants dans différents domaines médicaux.
