С появлением новых материалов для медицинского применения первоначальный скрининг должен проводиться систематически, поэтому этот протокол может стать фундаментальным инструментом для исследователей, стремящихся разработать и охарактеризовать новые биоматериалы. Методология позволяет количественно и качественно оценивать цитотоксичность и биологическую активность биоматериалов и фармацевтических препаратов, как твердых, так и жидких. После воздействия на клетки можно провести несколько дополнительных анализов.
Установление цитотоксичности биоматериала может иметь соответствующие последствия для клинической практики. Например, эти знания могут дать клиницисту возможность выбрать наиболее подходящий биоматериал для конкретного пациента или состояния. Этот протокол позволяет характеризовать новые биоматериалы в различных областях, таких как стоматология, ортопедия, хирургия, офтальмология, кардиология и другие.
Результаты оценки должны позволить сделать вывод о биологической активности биоматериала в живых тканях, помимо цитотоксичности. Как можно ближе к началу эксперимента с помощью шпателя загрузите свежеприготовленный биоматериал в формы из ПВХ и дайте материалу застыть в течение соответствующего времени при комнатной температуре. Когда материал затвердеет, выньте гранулы из форм и поместите их в контейнер соответствующего размера.
Затем стерилизуйте гранулы под ультрафиолетовой лампой по 20 минут с каждой стороны. Чтобы извлечь биоматериалы из гранул, поместите стерилизованные гранулы в 50-миллилитровую пробирку и добавьте к гранулам соответствующую среду для культивирования клеток. Поместите пробирки при температуре 37 градусов Цельсия на 24 часа.
На следующий день используйте свежую среду, чтобы разбавить экстракт до соответствующих интересующих объемов. Чтобы оценить морфологию клеток в ответ на воздействие биоматериала, используйте стерильный пинцет, чтобы поместить стерильное стеклянное стекло соответствующего размера в каждую лунку многолуночной пластины. Добавьте клетки в каждое покровное стекло в адекватной концентрации и поместите в инкубатор на ночь.
Добавьте соответствующий объем интересующего разбавления экстракта в каждую лунку и верните клетки в инкубатор клеточных культур на соответствующий инкубационный период. В конце инкубации аспирируйте надосадочную жидкость из каждой лунки, чтобы покровные стекла высохли при комнатной температуре. Когда образцы высохнут, покройте каждое покровное стекло достаточным объемом раствора Мэя-Грюнвальда для трехминутной инкубации при комнатной температуре.
После удаления красителя промойте покровные стекла соответствующим объемом дистиллированной воды в течение одной минуты с последующей 15-минутной инкубацией в достаточном объеме раствора Гимзы. В конце инкубации промойте покровные стекла в проточной воде и сделайте снимок клеток с помощью световой микроскопии. Чтобы оценить функцию клеток путем оценки экспрессии белка после воздействия интересующего биоматериала, как показано, промойте каждую лунку клеток PBS перед фиксацией клеток 3,7% параформальдегидом в течение 30 минут при комнатной температуре.
В конце инкубации промойте клетки два раза PBS и пропейте клетки 0,5% Triton в PBS в течение 15 минут. В конце проникновения заблокируйте пероксидазу 0,3%-ной перекисью водорода в PBS на пять минут, а затем две промывки PBS. После второй промывки промойте клетки два раза 0,5% BSA, прежде чем блокировать неспецифическое связывание 2% BSA в течение 45 минут.
В конце инкубации промойте клетки один раз 0,5% BSA перед инкубацией клеток с первичным антителом против интересующего белка в течение 60 минут при комнатной температуре, а затем пять промывок свежим 0,5% BSA. После последней промывки инкубируйте клетки с соответствующим вторичным антителом, представляющим интерес, в течение 90 минут при комнатной температуре, а затем пять одноминутных промывок в 0,5% BSA. После последней промывки инкубируйте клетки с соответствующей смесью субстрата и хромогена при концентрации 20 микролитров хромогена на миллилитр субстрата в течение 25 минут.
В конце инкубации промывают культуры два раза 0,5%БСА в PBS и противоокрашивают клетки гематоксилином в течение 15 минут. Вымойте окрашенные клетки в течение пяти минут с 0,037 моля на литр нашатырного спирта. Затем промойте в течение пяти минут дистиллированной водой, чтобы удалить излишки красителя, и используйте глицерин, чтобы закрепить покровные стекла на предметных стеклах.
Чтобы оценить образование минерализованных отложений в клеточных культурах, обработанных экстрактом, промойте каждую лунку три раза PBS, прежде чем фиксировать клетки 4% параформальдегидом в течение 15 минут при комнатной температуре. После последней стирки окрашивайте клетки соответствующим объемом красного окрашивающего раствора ализарина в течение 20 минут при температуре 37 градусов Цельсия в темноте. В конце инкубации промывайте лунки PBS до полного удаления излишков красителя и визуализируйте клетки с помощью световой микроскопии.
Затем добавьте экстракционный раствор в каждую лунку для 40-минутной инкубации с перемешиванием при комнатной температуре и измерьте поглощение в каждой лунке на спектрофотометре на длине волны 490 нанометров. Анализ МТТ может быть использован для быстрого и простого получения обзора цитотоксичности материалов, измеряемой его влиянием на метаболическую активность. Анализ жизнеспособности клеток также позволяет оценить цитотоксичность интересующего материала, поскольку материалы с более высокой цитотоксичностью вызывают более высокий процент гибели клеток при той же концентрации.
Сокращение более чем на 30% считается критическим и определяет материалы как подверженные риску низкой биосовместимости. Кроме того, большее количество цитотоксических материалов характеризуется выраженным снижением жизнеспособности клеток и поздним профилем гибели клеток апоптоза и некроза, в то время как меньшее количество цитотоксических материалов индуцирует меньшую гибель клеток и более апоптотический и поздний апоптотический профиль. Морфологическая оценка дополняет оценку жизнеспособности клеток, поскольку изменения в морфологии клеток могут указывать на апоптотический или некротический профиль, а также выявлять присутствие частиц материала.
Кроме того, влияние интересующих материалов на экспрессию белка можно наблюдать независимо от воздействия на жизнеспособность. Например, в этом анализе один материал индуцировал увеличение экспрессии белка, в то время как другой способствовал значительному снижению. В обоих случаях концентрация экстрактов напрямую влияла на экспрессию белка.
При приготовлении экстрактов решающее значение имеет соответствующее соотношение поверхности биоматериала и среднего объема. Кроме того, образцы должны быть стерилизованы с использованием методов, которые не изменяют их свойства. Еще одна деталь, о которой следует помнить, - это выдержки pH, которые должны регистрироваться без корректировки.
При необходимости выполните дополнительные элементы управления. Экстракты биоматериала могут быть использованы для химических и биохимических исследований, а также для некоторых других методов молекулярной биологии. Полученные результаты дают основу для будущих испытаний биосовместимости in vivo.
Оценка цитотоксичности имеет решающее значение для разработки любого материала, предназначенного для медицинского использования. Таким образом, этот протокол обеспечивает систематический и всесторонний подход к оценке новых биоматериалов или новых применений других, уже существующих в различных областях медицины.
