Bu çalışma NIH hibeleri R01GM080376, R35GM118139 ve NSF Mühendislik Merkezi MechanoBiology CMMI: 15-48571'den Y.E.G.'ye ve NIAID doktora öncesi NRSA bursu F30AI114187'den R.M.J.'ye desteklendi.

NOT: Tüm adımlar genel laboratuvar alanında tamamlanabilir.
1. Cam kapak temizliği
<ol><li>Kolloidal parçacıkların buharlaştırıcı birikmesi için temiz bir yüzey sağlamak için, temizlik için coplin cam boyama kavanozunun yivli kesici uçlarına 24 x 30 mm optik borosilikat cam kapak örtüleri (0,16−0,19 mm kalınlık) yerleştirin. NOT: Temizlik işlemi sırasında tüm yüzeylerin net bir şekilde açığa çıkması için kapakların dik durduğundan ve iyi ayrıldığından emin olun.</li>
	<li>Boyama kavanozuna örtüleri örtecek, kapağı yerize edecek ve 40 ° C'de 10 dakika boyunca sonicate edecek kadar aseton dökün.</li>
	<li>Asetonu dökün ve boyama kavanozuna damıtılmış H2O doldurup suyu dökerek kapakları durulayın. 2 kez daha tekrarlayın.</li>
	<li>Aseton sonication (adım 1.2 ve 1.3) bir kez daha tekrarlayın.</li>
	<li>40 ° C'de 20 dakika boyunca örtüleri ve sonikatı kaplayacak kadar kavanoza 200 mM KOH dökün. NOT: KOH camı hafifçe etches.</li>
	<li>Kapakları damıtılmış H 2 Oile 6kez durulayın.</li>
	<li>Kapakları örtmek için etanol ekleyin, kapağı ekleyin ve 40 ° C'de 10 dakika boyunca sonicate.</li>
	<li>Kapakları damıtılmış H ile2O 3 kez durulayın.</li>
	<li>Yumuşak tokparlaplar kullanarak her kapak kapağını kenardan alın ve kapakları N2 gazı ile kurutun. Sadece kapak ucunun kenarlarına dokunun. Kurutulmuş, temizlenmiş kapak örtülerinin her birini ayrı bir temiz Petri kabına yerleştirin.</li>
</ol>2. Polistiren boncukların buharlaştırıcı birikmesi
<ol><li>ZMW dizisi için kolloidal kristal maske oluşturmak için, 1 μm çapında 50 μL santrifüj, 15.000 x g,25 °C'de 5 dakika boyunca işlevsel olmayan polistiren boncuklar (suda% 2,5 w/ v). NOT: Boncukları pipetlemeden önce, boncukların şişenin dibine yerleşmesi durumunda stok çözeltisi kısa bir süre girdaplanmalıdır.</li>
	<li>Mümkün olduğunca az su bırakarak süpernatant atın. NOT: Artık su etanol resüspenzyon39buharlaşma özelliklerini değiştirebilir, bu nedenle tüm suyu çıkarmak için az miktarda boncuk çıkarılması kabul edilebilir.</li>
	<li>Boncukları adım 2.2'den 1:400 TritonX-100:etanol çözücünün 50 μL'sinde yeniden atın. Pipet, boncukları çözücü ile iyice karıştırmak için birkaç kez yukarı ve aşağı. NOT: TritonX-100:etanol çözücü kullanımdan sonra parafin filmi ile kapatılmalı ve ayda bir kez taze olarak hazırlanmalıdır. Boncuklar, mikrosantrifüj tüpü gibi plastik bir kabın kenarlarına yapışma eğilimindedir, bu nedenle tüm boncukların yeniden dirilmesini sağlamak için yanlar boyunca pipet.</li>
	<li>Biriktirme için bir nem odası kurmak için, her biri bir kapaklı 6 Petri kabını, kapakları biraz aralık bırakılmış bir çizgide bir bankın üzerine yerleştirin. Her yemekte, bir sonraki adımda nem arttığında kapak örtülerinin ortama maruz kalabilmesi için kapakçığı açık bölgeye taşıyın.</li>
	<li>Petri tabaklarının arkasına bir higrometre ve küçük bir elektrikli fan yerleştirin.</li>
	<li>Laboratuvarda başlangıç bağıl nemini (RH) kaydedin. 200 mL'lik bir kabı 150−200 mL ~75 °C su ile doldurun ve fanın arkasına yerleştirin.</li>
	<li>Fanı açın ve Petri kaplarını, fanı, kabı ve higrometreyi devrilmiş, şeffaf bir plastik saklama kabıyla (66 cm x 46 cm x 38 cm) örtün.</li>
	<li>Haznedeki RH'nin %70−75'e yükselmesine izin verin, bu da tipik olarak 5−10 dakika sürer. NOT: Ortam laboratuvarı RH'si düşükse (~%50'nin altında), biriktirme sırasındaki nem kaybını telafi etmek için odanın daha yüksek bir RH'ye ulaşmasını, ancak% 80'den yüksek olmamasını sağlar (aşağıya bakın).</li>
	<li>RH% 70−75'e ulaştığında, RH'yi kaydedin ve plastik saklama kabını hafifçe kaldırarak petri kaplarına kapakları hızlı bir şekilde yerleştirin, bu da kapakların aşırı ıslanmasını önler. NOT: Haznedeki sıcaklık, nemlendirme sonucu oda sıcaklığından biraz daha sıcak olacaktır, tipik olarak 25−26 °C. Kapaklarda nem görünüyorsa, cam yüzeyler çok ıslaktır. Ticari bir torpido gözü protokolün bu bölümünü basitleştirebilir.</li>
	<li>Odadaki RH%85'e yükselmeye devam etsin. Bu noktada, RH'yi nem haznesine kaydedin ve boncuk süspansiyonunun pipeti 5 μL'yi her kapak kapağının ortasına kaydedin.</li>
	<li>Nem kaybını en aza indirmek için her biriktirmeden sonra odayı ve Petri tabaklarını kapatın. 2 dakika içinde tüm 6 ifadeleri bitirmek hedefleyin.</li>
	<li>İfadeden sonra RH'yı hazneye kaydedin. NOT: Biriktirmeden sonraki RH, ortam laboratuvarı koşullarına bağlı olarak biriktirme sırasında nemin ne kadar hızlı kaybolduğunu ölçmeye yardımcı olacaktır. Tipik bir başarılı çalışma için, oda ifadeden önce% 85 RH'den başlayacak ve ifadeden sonra% 70−75 RH'de sona erecektir.</li>
	<li>Boncuk damlacıklarının yayılmasına ve 5 dakika kurumasına izin verin. NOT: Kolloidal kristallerin çok sayıda deliği veya çok katmanlı bölgesi varsa, oda sırasıyla çok nemli veya kuruydu. Petri kaplarını kapatmak ve ifadelere başlamak için bağıl nemi ayarlayın (optimizasyonun daha fazla tartışılması için sonuçlar bölümüne bakın).</li>
</ol>3. Kolloidal kristal şablonunda gözenek boyutunu azaltmak için boncuk tavlama
<ol><li>Boncuklar arası kesişme yerlerini daraltan ve interstices'in köşelerini yuvarlayan polistiren boncukların tavlama için düzgün bir sıcaklık yüzeyi sağlamak için, standart bir seramik sıcak plakanın üzerine düz, öğütülmüş bir alüminyum plaka yerleştirin.</li>
	<li>Sıcak plakanın sıcaklığını 107 °C'ye, polistirenin cam geçiş sıcaklığını40'aayarlayın. NOT: Kararlı ve doğru sıcaklık elde etmek için alüminyum plakada 2−3 mm genişliğinde ve 4−5 mm derinliğinde bir delikte bir termokuple probu tutulmuş.</li>
	<li>Sıcak alüminyum plakaya boncuk şablonunun ve 20 sn tavlamanın üzerine boncuk şablonunun bulunduğu bir kapak ucu yerleştirin (erime süresinin açıklanması için tartışma bölümüne bakın).</li>
	<li>Isıttıktan sonra, kapak kapağını alüminyum plakadan çıkarın ve soğutmak için derhal başka bir oda sıcaklığındaki alüminyum yüzeye yerleştirin. NOT: Kapakların teslim alımını kolaylaştırmak için kapak kapaklarının plakanın kenarına hafifçe asması veya sığ kanalları (beraberindeki videoya bakın) plakaya asması yararlıdır.</li>
</ol>4. Kolloidal kristal şablonu kullanılarak alüminyum sıfır mod dalga kılavuzlarının nanofabrikasyonu
<ol><li>Termal veya elektron ışını buharlaştırıcı biriktirme kullanarak, boncuklar arasındaki kafeslerde direkler oluşturmak için kolloidal kristal şablonun üzerine 2 Å/sn'de 300 nm bakır biriktirin.</li>
	<li>Yüzeye bantla hafifçe bastırarak boncukların üstündeki fazla metali çıkarın. Metali çıkarmak için bandı yavaşça soyun. NOT: Bant çekildikten sonra bazı küçük yansıtıcı fazla metal lekeleri kalabilir ve bunlar genellikle N2 gazı akışı ile çıkarılabilir. Bant çekildikten sonra önemli yansıtıcı fazla metal lekeleri kalırsa, polistiren boncukları kısmen çözmek için şablonları 2 saat boyunca toluen içine çekmeyi deneyin. Kapakları damıtılmış suyla yıkayın, N2ile kurulayın ve bant çekmesini tekrarlayın. Boncuklar bant çekme sırasında direkleri hasardan korumaya yardımcı olduğu için ek ıslatma boncukları tamamen çözmemelidir.</li>
	<li>Polistiren boncukları çözmek için boncuk şablonlarını toluene yerleştirin ve gece boyunca ıslatın. DİkKAT: Toluen dumanı toksik olabilir. İyi havalandırılmış bir kaputun altında toluen ile çalışın ve eldivenler, güvenlik gözlükleri ve laboratuvar önlüğü de dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipmanlar giyin. Toluen yanıcı sıvılar için belirlenmiş havalandırmalı dolaplarda saklanmalıdır.</li>
	<li>Toluen inkübasyonundan sonra, şablonları bir kez kloroform ve iki kez etanol ile durulayın. Hassas 200−300 nm boyundaki metal direkler artık açığa çıktığı için bu noktada kapak örtülerini dikkatlice tutturun. Şablonları N2 ile kurutun ve oksijen plazma temizleyicisinde kalan polimer ve kirleticileri 30 dakika boyunca çıkarın. DİkKAT: Kloroform dumanlar toksik olabilir. İyi havalandırılmış bir kaputun altında kloroformla çalışın ve eldivenler, güvenlik gözlükleri ve laboratuvar önlüğü de dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipmanlar giyin. Kloroform, diğer yanıcı çözücülerden uzakta havalandırılmış dolaplarda saklanmalıdır.</li>
	<li>Termal veya elektron ışını buharlaştırıcı biriktirme kullanarak, 1 Å/s'de 3 nm titanyum yapışıklık tabakası ve ardından bakır direklerin etrafında ve üstünde 4 Å/s'de 100−150 nm alüminyum biriktirin. NOT: Daha derin kılavuzlar ve arka plan floresanının daha iyi zayıflamasını elde etmek için daha kalın kaplamalar kullanılabilir, ancak bu aynı zamanda bir sonraki adımda gönderileri açığa çıkardıktan ve çözdükten sonra verimi azaltır (tartışma bölümüne bakın).</li>
	<li>Metal direkleri çözmek için, kapakları bakır etchant (sitrik asit bazlı) içine batırın; Malzeme Masası) 2 saat boyunca. DİkKAT: Metal etchant cilt yanıklara neden olabilir. İyi havalandırılmış bir kaputun altında etchantlarla çalışın ve koruyucu ekipman giyin. Elleçlemeden sonra ellerinizi iyice yıkayın. Metal etchant, aşındırıcı sıvılar için belirlenmiş havalandırmalı dolaplarda saklanmalıdır.</li>
	<li>Kapakları damıtılmış suyla durulayın, N2ile kurutun ve hala kaplama ile kaplı herhangi bir gönderiyi ortaya çıkarmak için metal kaplamanın yüzeyini lens kağıdı ile hafifçe buff. Kapakları 2 saat daha bakır vbhant içine yerleştirin, sonra damıtılmış su ile tekrar durulayın ve N2ile kurulayın. NOT: ZMW slaytlar, kirleticilerden uzak tutmak için kapalı, temiz Petri kaplarında saklanmalıdır.</li>
</ol>5. Kolloidal kristal şablonu kullanılarak altın sıfır mod dalga kılavuzlarının nanofabrikasyonu
NOT: Alüminyum ZMWs imal protokolü yansıtan altın ZMWs(Ek Şekil 1)imal yöntemi bu bölümde verilmiştir.
<ol><li>Termal veya elektron ışını buharlaştırıcı biriktirme kullanarak, 1 Å/s'de 3 nm titanyum yapışıklık tabakası ve ardından 4 Å/s'de 300 nm alüminyum biriktirin.</li>
	<li>Yüzeye bantla hafifçe bastırarak boncukların üstündeki fazla metali çıkarın. Metali çıkarmak için bandı yavaşça soyun.</li>
	<li>Polistiren boncukları çözmek için boncuk şablonlarını toluene yerleştirin ve gece boyunca ıslatın.</li>
	<li>Toluen inkübasyonundan sonra, şablonları bir kez kloroform ve iki kez etanol ile durulayın. Şablonları N2 ile kurutun ve oksijen plazma temizleyicisinde kalan polimer kirleticileri 30 dakika boyunca çıkarın.</li>
	<li>Termal veya elektron ışını buharlaştırıcı biriktirmeyi kullanarak, alüminyum direklerin etrafında ve üstünde 5 Å/s'de 100−150 nm altın biriktirin.</li>
	<li>Metal direkleri çözmek için, kapakları alüminyum etchant (fosforik asit bazlı) içine batırın; Malzeme Masası) 1 saat boyunca.</li>
	<li>Kapakları damıtılmış suyla durulayın, N2ile kurutun ve hala kaplama ile kaplı herhangi bir gönderiyi ortaya çıkarmak için metal kaplamanın yüzeyini lens kağıdı ile hafifçe buff. Kapakları 1 saat boyunca alüminyum vbhant içine geri yerleştirin, ardından damıtılmış su ile tekrar durulayın ve N2ile kurulayın. NOT: ZMW slaytlar kapalı, temiz Petri kaplarında saklanmalıdır.</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Kolloidal kendi kendine montaj için (protokol bölüm 2), süspansiyon çözücü olarak su yerine etanol kullanımı buharlaşma işlemini hızlandırır, böylece şablonlar önceki yöntemlerde olduğu gibi 1−2 saat yerine 2−3 dakika içinde hazırlanır48,49. Burada sunulan evaporatif sedimentasyon protokolü, süspansiyon49,50,51'inüzerindeki yüzey eğimini, sıcaklığı ve hava ha...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/t/61154">Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy</a>. A figure was updated.
Figure 3 was updated from:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/t/61154">Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy</a>. A figure was updated.

Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

Tek moleküllü floresan rezonans enerji transferi (smFRET) veya tek moleküllü floresan korelasyon spektroskopisi (FCS) gibi tek moleküllü teknikler moleküler biyofizik için güçlü araçlardır, transkripsiyon1, 2 ,3, çeviri4,5,6ve diğerleri gibi süreçlerde bireysel biyomoleküllerin dinamik hareketlerinin, konformasyonlarının ve etkileşimlerinin incelenmesine izin verir7. SmFRET için, total iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopisi yaygın bir yöntemdir, çünkü birçok bağlı molekül zamanla takip edilebilir ve TIR tarafından oluşturulan evanescent dalgası kapak8'ebitişik 100−200 nm bölgesi ile sınırlıdır. Bununla birlikte, ekscitasyon hacmindeki bu kısıtlamaya rağmen, arka plan floresanının üzerindeki tek molekül sinyallerini tespit etmek için ilgi flüforlarının pM veya nM aralıklarına seyreltilmesi gerekir9. Hücresel enzimlerin Michaelis-Menten sabitleri tipik olarak μM ila mM aralığında10olduğundan, tek molekül çalışmalarında biyokimyasal reaksiyonlar genellikle hücredekilerden çok daha yavaştır. Örneğin, protein sentezi E. coli11 , 12'de saniyede15−20amino asittegerçekleşirken,smFRET deneylerindeki prokaryotik ribozomların çoğu saniyede 0.1−1 amino asitte tercümeedilir 13. Protein sentezinde, duran ribozomlardaki kristal yapılar ve smFRET, transfer RNA'larının (tRNA'lar) tRNA-mRNA translokasyon adımı14,15'denönce 'hibrit' ve 'klasik' durumlar arasında dalgalanarak dalgalandırdığını göstermiştir. Bununla birlikte, translokasyon GTPase faktörüNÜN fizyolojik konsantrasyonları ef-G mevcut olduğunda, smFRET6'damelez ve klasik durumlar arasında orta olan farklı bir konformasyon gözlenmiştir. Dinamik moleküler süreçleri hücredekilere benzer oranlarda ve konsantrasyonlarda incelemek önemlidir, ancak teknik bir zorluk olmaya devam etmektedir.
Floresan substrat konsantrasyonunu artırmaya yönelik bir strateji,16 diyafram açıklıkları içinde lokalize biyomolekülleri seçici olarak heyecanlandıran sınırlı uyarlama alanları oluşturmak için sıfır mod dalga kılavuzları (ZMWs) adı verilen metal bazlı, alt görünür dalga boyu diyaframlarının kullanılmasıdır (Şekil 1). Diyafram açıklıkları tipik olarak 100−200 nm çapında ve 100−150 nm derinlik17' dir. Kuyuların büyüklüğü ve şekli ile ilgili bir kesme dalga boyunun üzerinde (φc ≈ dielektrik orta 18 olarak su ile dairesel dalga kılavuzları için çapın2,3katı), dalga kılavuzunda yayılma modlarına izin verilmez, bu nedenle sıfır mod dalga kılavuzları terimi. Bununla birlikte, salınımlı bir elektromanyetik alan, evanescent dalgası olarak adlandırılan, yoğunlukta katlanarak çürüyen hala dalga kılavuzuna kısa bir mesafe tüneller18,19. TIR evanescent dalgalarına benzer olmasına rağmen, ZMW evanescent dalgaları daha kısa bir çürüme sabitine sahiptir ve bu da dalga kılavuzu içinde 10−30 nm etkili bir eksitasyon bölgesine neden olur. Floresan etiketli ligandların mikromolar konsantrasyonlarında, ekscitasyon bölgesinde aynı anda sadece bir veya birkaç molekül bulunur. Uyarım hacminin bu şekilde kısıtlanması ve bunun sonucunda arka plan floresanının azaltılması, tek moleküllerin biyolojik olarak ilgili konsantrasyonlarda floresan görüntülenmesini sağlar. Bu, tek protein difüzyon21'inFCS ölçümleri, düşük benzeşimli ligand-protein22'nintek moleküllü FRET ölçümleri ve protein-protein etkileşimleri23 ve tek moleküler devir olaylarının spektro-elektrokimyasal ölçümleri dahil olmak üzere birçoksisteme uygulanmıştır 24.
ZMW'ler, iyon ışın frezeleme25, 26veya elektron ışını litografisi (EBL) ve ardından plazma gravür16,27kullanılarak metal bir tabakanın doğrudan desenlenerek üretilmiştir. Bu maskesiz litografi yöntemleri seri olarak dalga kılavuzları oluşturur ve tipik olarak ZMW teknolojisinin yaygın olarak benimsenmesini önleyen özel nanofabrikasyon tesislerine erişim gerektirir. Başka bir yöntem, ultraviyole nanoimprint litografi lift-off28, ters bir ZMW şablonunu damga gibi bir direnç filmine bastırmak için kuvars slayt kalıbı kullanır. Bu yöntem daha aerodinamik olsa da, kuvars kalıbının imalatı için hala EBL gerektirir. Bu makalede, EBL veya iyon ışın frezeleme gerektirmeyen ve litografik bir maske oluşturmak için nanosferlerin yakın paketlenmesine dayanan basit ve ucuz şablonlu bir imalat yöntemi için protokol sunulmaktadır.
İlk olarak 1982 yılında Deckman ve Dunsmuir29,30tarafından önerilen nanosfer veya "doğal" litografi, malzemelerin gravür ve / veya biriktirme yoluyla yüzey deseni için şablonlar oluşturmak için onlarca nanometreden onlarca mikrometre31'ekadar değişen monodisperz kolloidal parçacıkların kendi kendine montajını kullanır. Kolloidal kristaller olarak adlandırılan kolloidal parçacıkların iki boyutlu (2D) veya üç boyutlu (3D) genişletilmiş periyodik dizileri, saçılma ve kırınım32'denparlak bir yanardönerlik ile karakterize edilir. Elektron ışını veya fotolitografiden daha az yaygın olarak kullanılmasına rağmen, bu maskeleme metodolojisi basit, düşük maliyetlidir ve 100 nm'nin altında özellik boyutları oluşturmak için kolayca ölçeklendirilir.
Kolloidal parçacıkların kendi kendine birliğini yönlendirmek, kolloidal kristallerin yüzey desenleme için maske olarak kullanılmasının başarısını belirler. Parçacıkların boyutu ve şekli homojen ise, kolloidal parçacıklar entropik tükenme33tarafından tahrik edilen altıgen ambalaj ile kolayca kendi kendine monte edilebilir. Damla kaplamadan sonra su buharlaşması kolloidal parçacıkları tortulamak için etkili bir yoldur, ancak diğer yöntemler daldırmakaplama 34, spin kaplama35, elektroforetik biriktirme36ve hava-su arayüzünde konsolidasyon37içerir. Aşağıda sunulan protokol, uygulanması en basit olan buharlaşma sedimasyon yöntemine dayanmaktadır. Üçgen, yakın paketlenmiş polistiren boncuklar arasındaki kesişmeler, kurbanlık bir metalin kaplanacağı açıklıklar oluşturur, direkler oluşturur (Şekil 2 ve Ek Şekil 1). Bu adımdan önce boncukların kısa tavlanması, bu direklerin şeklini ve çapını ayarlar. Boncuklar çıkarılır, direklerin etrafına son bir metal tabaka biriktirilir ve ardından direkler kaldırılır. kolloidal nanoküme, ara direklerin çıkarılması ve pasivasyon ve bağlama için yüzey kimyası modifikasyonu üzerine iki metal biriktirme adımından sonra, ZMW dizileri tek molekül görüntüleme için kullanıma hazırdır. İmalat sonrası ZMW optik özelliklerinin daha kapsamlı karakterizasyonu, eşlik eden bir makalede bulunabilir38. Metallerin buhar biriktirmesi için bir termal evaporatör dışında, özel bir alet gerekmez.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;1. Glass Coverslip Cleaning&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma</td><td>32201</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Coplin glass staining jar</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-817</td><td>Staining jar with 8 grooves and molded glass cover</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>VWR</td><td>48404-467</td><td>24 mm x 30 mm (No.1&amp;frac12;, Rectangular)</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>1 L</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>30603</td><td>Potassium hydroxide</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>R80115TS</td><td>100 mm diameter, 15 mm deep</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td>Z245143</td><td>Tabletop ultrasonic cleaner, 5510</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clear storage container</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-110-8222</td><td>26 x 18 x 15 in.</td></tr><tr><td>Desk fan</td><td>O2Cool</td><td>FD05001A</td><td>Any small desk (~5 in.) fan will work</td></tr><tr><td>Glass beaker</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-555-25B</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>Humidity meter</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-661-19</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-402-903</td><td>1.5 mL</td></tr><tr><td>Polystyrene microspheres</td><td>Polysciences</td><td>18602-15</td><td>1.00 &amp;micro;m diameter, non-functionalized</td></tr><tr><td>Triton X-100 deturgent</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aluminum plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA11062RY</td><td>Customized in-house to 14 cm x 14 cm</td></tr><tr><td>Ceramic hotplate</td><td>Fisher Scientific</td><td>HP88857100</td><td>13 x 8.2 x 3.8 in.</td></tr><tr><td>Temperature controller</td><td>McMaster-Carr</td><td>38615K71</td><td>Read temperature with thermocouple probe</td></tr><tr><td>Thermocouple probe</td><td>McMaster-Carr</td><td>9251T93</td><td>Type K, surface probe</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aluminum etchant</td><td>Transene</td><td>Type A</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum pellets</td><td>Kurt J. Lesker</td><td>EVMAL40QXHB</td><td>For electron beam evaporation</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>288306</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Copper etchant</td><td>Transene</td><td>49-1</td><td></td></tr><tr><td>Copper pellets</td><td>Kurt J. Lesker</td><td>EVMCU40QXQA</td><td>For electron beam evaporation</td></tr><tr><td>Gold pellets</td><td>Kurt J. Lesker</td><td>EVMAUXX40G</td><td>For electron beam evaporation</td></tr><tr><td>Lens paper</td><td>Thorlabs</td><td>MC-5</td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Scotch tape</td><td>Staples</td><td>MMM119</td><td></td></tr><tr><td>Thin film deposition system</td><td>Kurt J. Lesker</td><td>PVD-75</td><td>Tabletop thermal evaporation system will also work</td></tr><tr><td>Titanium pellets</td><td>Kurt J. Lesker</td><td>EVMTI45QXQA</td><td>For electron beam evaporation</td></tr><tr><td>Toluene</td><td>Sigma</td><td>244511</td><td>1 L</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Representative Results&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>COMSOL Multiphysics Modeling Software</td><td>COMSOL, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dual View spectral splitter</td><td>Photometrics, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fabrication of zero mode waveguides for high concentration single molecule microscopy

Tek moleküllü floresan enzimolojisinde, çözeltideki etiketli substratlardan gelen arka plan floresanları genellikle florofor konsantrasyonu ile piko- nanomolar aralıkları, birçok fizyolojik ligand konsantrasyonundan daha az büyüklük sırasını sınırlar. Alüminyum veya altın gibi ince iletken bir metalde üretilen 100−200 nm çapında diyafram açıklıkları olan sıfır mod dalga kılavuzları (ZMWs) adı verilen optik nanoyapılar, görünür ışık eksiltmeyi zeptoliter etkili hacimlere hapsederek floroforların mikromoler konsantrasyonlarında tek tek moleküllerin görüntülenmesini sağlar. Bununla birlikte, pahalı ve özel nanofabrikasyon ekipmanına duyulan ihtiyaç, ZMW'lerin yaygın kullanımının önüne geçmektedir. Tipik olarak, ZMWs gibi nanoyapılar, sıralı ve yavaş olan elektron ışını litografisi kullanılarak doğrudan yazılarak elde edilir. Burada kolloidal veya nanosfer litografi, dalga kılavuzu imalatı için nanometre ölçeğinde maskeler oluşturmak için alternatif bir strateji olarak kullanılır. Bu rapor, yaklaşımı her aşama için pratik hususlarla ayrıntılı olarak açıklar. Yöntem, son dalga kılavuzu çapları ve derinlikleri 100−200 nm olan binlerce alüminyum veya altın ZMW'ın paralel olarak yapılmasına izin verir. Metal biriktirme için sadece ortak laboratuvar ekipmanı ve termal evaporatör gereklidir. Bu yöntem, ZMW'leri biyokimyasal topluluk için daha erişilebilir hale getirerek, moleküler süreçlerin hücresel konsantrasyonlarda ve oranlarda incelenmesini kolaylaştırabilir.

Polistiren kolloidal parçacıkların buharlaştırıcı sedimansasyon yoluyla kendi kendine montajı (adım 2.1−2.13), çözücü buharlaşma hızının kontrol edilmesi gerektirdiğinden bir dizi sonuç üretebilir. Bununla birlikte, ifadeler hızlı olduğundan (tur başına 10−15 dk), prosedür farklı ortam laboratuvarı koşulları için hızlı bir şekilde optimize edilebilir. Şekil 3A, biriktirme ve buharlaşmadan sonra iyi biçimlendirilmiş bir kolloidal şablon gösterir. Ma...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy at JoVE.com

Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

Burada açıklanan, nano-mikromolar florofor konsantrasyonlarında tek molekül görüntüleme için metal kaplı cam mikroskopi kapak kapağındaki nanoapertures dizileri olan sıfır mod dalga kılavuzlarının paralel üretimi için bir nanosfer litografi yöntemidir. Yöntem, bir dalga kılavuzu şablonu oluşturmak için kolloidal kristal kendi kendine montajdan yararlanır.

Yüksek Konsantrasyonlı Tek Moleküllü Mikroskopi için Sıfır Mod Dalga Kılavuzlarının İmalatı

In single molecule fluorescence enzymology, background fluorescence from labeled substrates in solution often limits fluorophore concentration to pico- to ...

fabrication-zero-mode-waveguides-for-high-concentration-single

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.9K Görüntüleme.  University of Pennsylvania. Burada açıklanan, nano-mikromolar florofor konsantrasyonlarında tek molekül görüntüleme için metal kaplı cam mikroskopi kapak kapağındaki nanoapertures dizileri olan sıfır mod dalga kılavuzlarının paralel üretimi için bir nanosfer litografi yöntemidir. Yöntem, bir dalga kılavuzu şablonu oluşturmak için kolloidal kristal kendi kendine montajdan yararlanır.

Video: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

Fabrication of Silica Ultra High Quality Factor Microresonators

Whispering gallery resonant cavities confine light in circular orbits at their periphery.1-2 The photon storage lifetime in the cavity, quantified by the quality factor (Q) of the cavity, can be in excess of 500ns for cavities with Q factors above 100 million. As a result of their low material losses, silica microcavities have demonstrated some of the longest photon lifetimes to date1-2. Since a portion of the circulating light extends outside the resonator, these devices can also be used to probe the surroundings. This interaction has enabled numerous experiments in biology, such as single molecule biodetection and antibody-antigen kinetics, as well as discoveries in other fields, such as development of ultra-low-threshold microlasers, characterization of thin films, and cavity quantum electrodynamics studies.3-7
The two primary silica resonant cavity geometries are the microsphere and the microtoroid. Both devices rely on a carbon dioxide laser reflow step to achieve their ultra-high-Q factors (Q&gt;100 million).1-2,8-9 However, there are several notable differences between the two structures. Silica microspheres are free-standing, supported by a single optical fiber, whereas silica microtoroids can be fabricated on a silicon wafer in large arrays using a combination of lithography and etching steps. These differences influence which device is optimal for a given experiment.
Here, we present detailed fabrication protocols for both types of resonant cavities. While the fabrication of microsphere resonant cavities is fairly straightforward, the fabrication of microtoroid resonant cavities requires additional specialized equipment and facilities (cleanroom). Therefore, this additional requirement may also influence which device is selected for a given experiment.
Introduction
An optical resonator efficiently confines light at specific wavelengths, known as the resonant wavelengths of the device. 1-2 The common figure of merit for these optical resonators is the quality factor or Q. This term describes the photon lifetime (&tau;o) within the resonator, which is directly related to the resonator's optical losses. Therefore, an optical resonator with a high Q factor has low optical losses, long photon lifetimes, and very low photon decay rates (1/&tau;o). As a result of the long photon lifetimes, it is possible to build-up extremely large circulating optical field intensities in these devices. This very unique property has allowed these devices to be used as laser sources and integrated biosensors.10
A unique sub-class of resonators is the whispering gallery mode optical microcavity. In these devices, the light is confined in circular orbits at the periphery. Therefore, the field is not completely confined within the device, but evanesces into the environment. Whispering gallery mode optical cavities have demonstrated some of the highest quality factors of any optical resonant cavity to date.9,11 Therefore, these devices are used throughout science and engineering, including in fundamental physics studies and in telecommunications as well as in biodetection experiments. 3-7,12
Optical microcavities can be fabricated from a wide range of materials and in a wide variety of geometries. A few examples include silica and silicon microtoroids, silicon, silicon nitride, and silica microdisks, micropillars, and silica and polymer microrings.13-17 The range in quality factor (Q) varies as dramatically as the geometry. Although both geometry and high Q are important considerations in any field, in many applications, there is far greater leverage in boosting device performance through Q enhancement. Among the numerous options detailed previously, the silica microsphere and the silica microtoroid resonator have achieved some of the highest Q factors to date.1,9 Additionally, as a result of the extremely low optical loss of silica from the visible through the near-IR, both microspheres and microtoroids are able to maintain their Q factors over a wide range of testing wavelengths.18 Finally, because silica is inherently biocompatible, it is routinely used in biodetection experiments.
In addition to high material absorption, there are several other potential loss mechanisms, including surface roughness, radiation loss, and contamination loss.2 Through an optimization of the device size, it is possible to eliminate radiation losses, which arise from poor optical field confinement within the device. Similarly, by storing a device in an appropriately clean environment, contamination of the surface can be minimized. Therefore, in addition to material loss, surface scattering is the primary loss mechanism of concern.2,8
In silica devices, surface scattering is minimized by using a laser reflow technique, which melts the silica through surface tension induced reflow. While spherical optical resonators have been studied for many years, it is only with recent advances in fabrication technologies that researchers been able to fabricate high quality silica optical toroidal microresonators (Q&gt;100 million) on a silicon substrate, thus paving the way for integration with microfluidics.1
The present series of protocols details how to fabricate both silica microsphere and microtoroid resonant cavities. While silica microsphere resonant cavities are well-established, microtoroid resonant cavities were only recently invented.1 As many of the fundamental methods used to fabricate the microsphere are also used in the more complex microtoroid fabrication procedure, by including both in a single protocol it will enable researchers to more easily trouble-shoot their experiments.

We describe the use of a carbon dioxide laser reflow technique to fabricate silica resonant cavities, including free-standing microspheres and on-chip microtoroids. The reflow method removes surface imperfections, allowing long photon lifetimes within both devices. The resulting devices have ultra high quality factors, enabling applications ranging from telecommunications to biodetection.

Silika Ultra Yüksek Kalite Faktörü Microresonators Fabrikasyon

Whispering gallery resonant cavities confine light in circular orbits at their periphery.1-2 The photon storage lifetime in the cavity, quantified by the ...

Mühendislik

Terahertz Microfluidic Sensing Using a Parallel-plate Waveguide Sensor

Refractive index (RI) sensing is a powerful noninvasive and label-free sensing technique for the identification, detection and monitoring of microfluidic samples with a wide range of possible sensor designs such as interferometers and resonators 1,2. Most of the existing RI sensing applications focus on biological materials in aqueous solutions in visible and IR frequencies, such as DNA hybridization and genome sequencing. At terahertz frequencies, applications include quality control, monitoring of industrial processes and sensing and detection applications involving nonpolar materials.
Several potential designs for refractive index sensors in the terahertz regime exist, including photonic crystal waveguides 3, asymmetric split-ring resonators 4, and photonic band gap structures integrated into parallel-plate waveguides 5. Many of these designs are based on optical resonators such as rings or cavities. The resonant frequencies of these structures are dependent on the refractive index of the material in or around the resonator. By monitoring the shifts in resonant frequency the refractive index of a sample can be accurately measured and this in turn can be used to identify a material, monitor contamination or dilution, etc.
The sensor design we use here is based on a simple parallel-plate waveguide 6,7. A rectangular groove machined into one face acts as a resonant cavity (Figures 1 and 2). When terahertz radiation is coupled into the waveguide and propagates in the lowest-order transverse-electric (TE1) mode, the result is a single strong resonant feature with a tunable resonant frequency that is dependent on the geometry of the groove 6,8. This groove can be filled with nonpolar liquid microfluidic samples which cause a shift in the observed resonant frequency that depends on the amount of liquid in the groove and its refractive index 9.
Our technique has an advantage over other terahertz techniques in its simplicity, both in fabrication and implementation, since the procedure can be accomplished with standard laboratory equipment without the need for a clean room or any special fabrication or experimental techniques. It can also be easily expanded to multichannel operation by the incorporation of multiple grooves 10. In this video we will describe our complete experimental procedure, from the design of the sensor to the data analysis and determination of the sample refractive index.

The procedure for implementing a refractive index sensor for terahertz frequencies based on a grooved parallel-plate waveguide geometry is described here. The method yields a measurement of the refractive index of a small volume of liquid through monitoring of the shift in the resonant frequency of the waveguide structure

Paralel plaka Waveguide Sensor Kullanımı Terahertz Mikroakışkan Algılama

Refractive index (RI) sensing is a powerful noninvasive and label-free sensing technique for the identification, detection and monitoring of microfluidic ...

Fabrication And Characterization Of Photonic Crystal Slow Light Waveguides And Cavities

Slow light has been one of the hot topics in the photonics community in the past decade, generating great interest both from a fundamental point of view and for its considerable potential for practical applications. Slow light photonic crystal waveguides, in particular, have played a major part and have been successfully employed for delaying optical signals1-4 and the enhancement of both linear5-7 and nonlinear devices.8-11
Photonic crystal cavities achieve similar effects to that of slow light waveguides, but over a reduced band-width. These cavities offer high Q-factor/volume ratio, for the realization of optically12 and electrically13 pumped ultra-low threshold lasers and the enhancement of nonlinear effects.14-16 Furthermore, passive filters17 and modulators18-19 have been demonstrated, exhibiting ultra-narrow line-width, high free-spectral range and record values of low energy consumption.
To attain these exciting results, a robust repeatable fabrication protocol must be developed. In this paper we take an in-depth look at our fabrication protocol which employs electron-beam lithography for the definition of photonic crystal patterns and uses wet and dry etching techniques. Our optimised fabrication recipe results in photonic crystals that do not suffer from vertical asymmetry and exhibit very good edge-wall roughness. We discuss the results of varying the etching parameters and the detrimental effects that they can have on a device, leading to a diagnostic route that can be taken to identify and eliminate similar issues.
The key to evaluating slow light waveguides is the passive characterization of transmission and group index spectra. Various methods have been reported, most notably resolving the Fabry-Perot fringes of the transmission spectrum20-21 and interferometric techniques.22-25 Here, we describe a direct, broadband measurement technique combining spectral interferometry with Fourier transform analysis.26 Our method stands out for its simplicity and power, as we can characterise a bare photonic crystal with access waveguides, without need for on-chip interference components, and the setup only consists of a Mach-Zehnder interferometer, with no need for moving parts and delay scans.
When characterising photonic crystal cavities, techniques involving internal sources21 or external waveguides directly coupled to the cavity27 impact on the performance of the cavity itself, thereby distorting the measurement. Here, we describe a novel and non-intrusive technique that makes use of a cross-polarised probe beam and is known as resonant scattering (RS), where the probe is coupled out-of plane into the cavity through an objective. The technique was first demonstrated by McCutcheon et al.28 and further developed by Galli et al.29

Use of photonic crystal slow light waveguides and cavities has been widely adopted by the photonics community in many differing applications. Therefore fabrication and characterization of these devices are of great interest. This paper outlines our fabrication technique and two optical characterization methods, namely: interferometric (waveguides) and resonant scattering (cavities).

Fotonik Kristal Yavaş Işık Dalga Kılavuzları Ve Çürükler Üretimi ve Karakterizasyonu

Slow light has been one of the hot topics in the photonics community in the past decade, generating great interest both from a fundamental point of view ...

Synthesis and Operation of Fluorescent-core Microcavities for Refractometric Sensing

This paper discusses fluorescent core microcavity-based sensors that can operate in a microfluidic analysis setup. These structures are based on the formation of a fluorescent quantum-dot (QD) coating on the channel surface of a conventional microcapillary. Silicon QDs are especially attractive for this application, owing in part to their negligible toxicity compared to the II-VI and II-VI compound QDs, which are legislatively controlled substances in many countries. While the ensemble emission spectrum is broad and featureless, an Si-QD film on the channel wall of a capillary features a set of sharp, narrow peaks in the fluorescence spectrum, corresponding to the electromagnetic resonances for light trapped within the film. The peak wavelength of these resonances is sensitive to the external medium, thus permitting the device to function as a refractometric sensor in which the QDs never come into physical contact with the analyte. The experimental methods associated with the fabrication of the fluorescent-core microcapillaries are discussed in detail, as well as the analysis methods. Finally, a comparison is made between these structures and the more widely investigated liquid-core optical ring resonators, in terms of microfluidic sensing capabilities.

Fluorescent-core microcavity sensors employ a high-index quantum-dot coating in the channel of silica microcapillaries. Changes in the refractive index of fluids pumped into the capillary channel cause shifts in the microcavity fluorescence spectrum that can be used to analyze the channel medium.

Refraktometrik Algılama Floresan çekirdekli mikro kavitasyonlar sentezi ve İşletilmesi

This paper discusses  fluorescent core microcavity-based sensors that can operate in a microfluidic  analysis setup. These structures are based on the ...

Fabrication, Operation and Flow Visualization in Surface-acoustic-wave-driven Acoustic-counterflow Microfluidics

Surface acoustic waves (SAWs) can be used to drive liquids in portable microfluidic chips via the acoustic counterflow phenomenon. In this video we present the fabrication protocol for a multilayered SAW acoustic counterflow device. The device is fabricated starting from a lithium niobate (LN) substrate onto which two interdigital transducers (IDTs) and appropriate markers are patterned. A polydimethylsiloxane (PDMS) channel cast on an SU8 master mold is finally bonded on the patterned substrate. Following the fabrication procedure, we show the techniques that allow the characterization and operation of the acoustic counterflow device in order to pump fluids through the PDMS channel grid. We finally present the procedure to visualize liquid flow in the channels. The protocol is used to show on-chip fluid pumping under different flow regimes such as laminar flow and more complicated dynamics characterized by vortices and particle accumulation domains.

In this video we first describe fabrication and operation procedures of a surface acoustic wave (SAW) acoustic counterflow device. We then demonstrate an experimental setup that allows for both qualitative flow visualization and quantitative analysis of complex flows within the SAW pumping device.

Yüzey-akustik dalga odaklı Akustik-ters akışlı Mikroakiskan Fabrikasyon, İşletme ve Akış Görselleştirme

Surface acoustic waves (SAWs) can be used to drive liquids in portable microfluidic chips via the acoustic counterflow phenomenon. In this video we ...

Implementation of a Reference Interferometer for Nanodetection

A thermally and mechanically stabilized fiber interferometer suited for examining ultra-high quality factor microcavities is fashioned. After assessing its free spectral range (FSR), the module is put in parallel with a fiber taper-microcavity system and then calibrated through isolating and eliminating random shifts in the laser frequency (i.e. laser jitter noise). To realize the taper-microcavity junction and to maximize the optical power that is transferred to the resonator, a single-mode optical fiber waveguide is pulled. Solutions containing polystyrene nanobeads are then prepared and flown to the microcavity in order to demonstrate the system&#8217;s ability to sense binding to the surface of the microcavity. Data is post-processed via adaptive curve fitting, which allows for high-resolution measurements of the quality factor as well as the plotting of time-dependent parameters, such as resonant wavelength and split frequency shifts. By carefully inspecting steps in the time-domain response and shifting in the frequency-domain response, this instrument can quantify discrete binding events.

A reference interferometer technique, which is designed to remove undesirable laser jitter noise for nanodetection, is utilized for probing an ultra-high quality factor microcavity. Instructions for assembly, setup, and data acquisition are provided, alongside the measurement process for specifying the cavity quality factor.

Nanodetection için bir referans Interferometer Uygulanması

A thermally and mechanically stabilized fiber interferometer suited for examining ultra-high quality factor microcavities is fashioned. After assessing ...

Stimulated Stokes and Antistokes Raman Scattering in Microspherical Whispering Gallery Mode Resonators

Dielectric microspheres can confine light and sound for a length of time through high quality factor whispering gallery modes (WGM). Glass microspheres can be thought as a store of energy with a huge variety of applications: compact laser sources, highly sensitive biochemical sensors and nonlinear phenomena. A protocol for the fabrication of both the microspheres and coupling system is given. The couplers described here are tapered fibers. Efficient generation of nonlinear phenomena related to third order optical non-linear susceptibility &#935;(3) interactions in triply resonant silica microspheres is presented in this paper. The interactions here reported are: Stimulated Raman Scattering (SRS), and four wave mixing processes comprising Stimulated Anti-stokes Raman Scattering (SARS). A proof of the cavity-enhanced phenomenon is given by the lack of correlation among the pump, signal and idler: a resonant mode has to exist in order to obtain the pair of signal and idler. In the case of hyperparametric oscillations (four wave mixing and stimulated anti-stokes Raman scattering), the modes must fulfill the energy and momentum conservation and, last but not least, have a good spatial overlap.

Efficient generation of nonlinear phenomena related to third order optical non-linear susceptibility &#935;(3) interactions in triply resonant silica microspheres is presented in this paper. The interactions here reported are: Stimulated Raman Scattering (SRS), and four wave mixing processes comprising Stimulated Anti-stokes Raman Scattering (SARS).

Mikrosferik Whispering Galeri Modu Rezonatörler içinde Uyarılmış Stokes ve Antistokes Raman saçılması

Dielectric microspheres can confine light and sound for a length of time through high quality factor whispering gallery modes (WGM). Glass microspheres ...

Fabrication of 1-D Photonic Crystal Cavity on a Nanofiber Using Femtosecond Laser-induced Ablation

We present a protocol for fabricating 1-D Photonic Crystal (PhC) cavities on subwavelength-diameter tapered optical fibers, optical nanofibers, using femtosecond laser-induced ablation. We show that thousands of periodic nano-craters are fabricated on an optical nanofiber by irradiating with just a single femtosecond laser pulse. For a typical sample, periodic nano-craters with a period of 350 nm and with diameter gradually varying from 50 - 250 nm over a length of 1 mm are fabricated on a nanofiber with diameter around 450 - 550 nm. A key aspect of such a nanofabrication is that the nanofiber itself acts as a cylindrical lens and focuses the femtosecond laser beam on its shadow surface. Moreover, the single-shot fabrication makes it immune to mechanical instabilities and other fabrication imperfections. Such periodic nano-craters on nanofiber, act as a 1-D PhC and enable strong and broadband reflection while maintaining the high transmission out of the stopband. We also present a method to control the profile of the nano-crater array to fabricate apodized and defect-induced PhC cavities on the nanofiber. The strong confinement of the field, both transverse and longitudinal, in the nanofiber-based PhC cavities and the efficient integration to the fiber networks, may open new possibilities for nanophotonic applications and quantum information science.

We present a protocol for fabricating 1-D photonic crystal cavities on subwavelength diameter silica fibers (optical nanofibers) using femtosecond laser-induced ablation.

Femtosaniye Lazer kaynaklı Ablasyonu kullanarak nanolif 1-D Fotonik Kristal Kavitenin Fabrikasyon

We present a protocol for fabricating 1-D Photonic Crystal (PhC) cavities on subwavelength-diameter tapered optical fibers, optical nanofibers, using ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced contrast due to optical sectioning. The conventional approach is to use high numerical aperture microscope TIRF objectives for both excitation and collection, severely limiting the field of view and throughput. We present a novel approach to generating TIRF excitation for imaging with optical waveguides, called chip-based nanoscopy. The aim of this protocol is to demonstrate how chip-based imaging is performed in an already built setup. The main advantage of chip-based nanoscopy is that the excitation and collection pathways are decoupled. Imaging can then be done with a low magnification lens, resulting in large field of view TIRF images, at the price of a small reduction in resolution. Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) were imaged using direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM), showing a resolution comparable to traditional super-resolution microscopes. In addition, we demonstrate the high-throughput capabilities by imaging a 500 &#181;m x 500 &#181;m region with a low magnification lens, providing a resolution of 76 nm. Through its compact character, chip-based imaging can be retrofitted into most common microscopes and can be combined with other on-chip optical techniques, such as on-chip sensing, spectroscopy, optical trapping, etc. The technique is thus ideally suited for high throughput 2D super-resolution imaging, but also offers great opportunities for multi-modal analysis.

Chip-based super-resolution optical microscopy is a novel approach to fluorescence microscopy and offers advantages in cost effectiveness and throughput. Here, the protocols for chip preparation and imaging are shown for TIRF microscopy and localization-based super-resolution microscopy.

Fotonik Çip Kullanarak Yüksek İşLeç Toplam İç Yansıma Floresansı ve Direkt Stokastik Optik Rekonstrüksiyon Mikroskobu

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Biyokimya

Fabrication of Refractive-index-matched Devices for Biomedical Microfluidics

The use of microfluidic devices has emerged as a defining tool for biomedical applications. When combined with modern microscopy techniques, these devices can be implemented as part of a robust platform capable of making simultaneous complementary measurements. The primary challenge created by the combination of these two techniques is the mismatch in refractive index between the materials traditionally used to make microfluidic devices and the aqueous solutions typically used in biomedicine. This mismatch can create optical artifacts near the channel or device edges. One solution is to reduce the refractive index of the material used to fabricate the device by using a fluorinated polymer such as MY133-V2000 whose refractive index is similar to that of water (n = 1.33). Here, the construction of a microfluidic device made out of MY133-V2000 using soft lithography techniques is demonstrated, using O2 plasma in conjunction with an acrylic holder to increase the adhesion between the MY133-V2000 fabricated device and the polydimethylsiloxane (PDMS) substrate. The device is then tested by incubating it filled with cell culture media for 24 h to demonstrate the ability of the device to maintain cell culture conditions during the course of a typical imaging experiment. Finally, quantitative phase microscopy (QPM) is used to measure the distribution of mass within the live adherent cells in the microchannel. This way, the increased precision, enabled by fabricating the device from a low index of refraction polymer such as MY133-V2000 in lieu of traditional soft lithography materials such as PDMS, is demonstrated. Overall, this approach for fabricating microfluidic devices can be readily integrated into existing soft lithography workflows in order to reduce optical artifacts and increase measurement precision.

This protocol describes the fabrication of microfluidic devices from MY133-V2000 to eliminate artifacts that often arise in microchannels due to the mismatching refractive indices between microchannel structures and an aqueous solution. This protocol uses an acrylic holder to compress the encapsulated device, improving adhesion both chemically and mechanically.

Biyomedikal Havacilik için refraktif Dizin eşleşen cihazların imalat

The use of microfluidic devices has emerged as a defining tool for biomedical applications. When combined with modern microscopy techniques, these devices ...