Diese Arbeit wurde durch nihfinanzierte R01GM080376, R35GM118139 und NSF Center for Engineering MechanoBiology CMMI: 15-48571 an Y.E.G. und durch ein NIAID-Prädoktoranden-NRSA-Stipendium F30AI114187 an R.M.J.

HINWEIS: Alle Schritte können im allgemeinen Laborbereich ausgeführt werden.
1. Reinigung von Glasabdeckungen
<ol><li>Um eine saubere Oberfläche für die Verdunstungsablagerung kolloidaler Partikel zu schaffen, legen Sie 24 x 30 mm optische Borosilikatglasabdeckungen (0,16−0,19 mm Dicke) zur Reinigung in die gerillten Einsätze eines Coplinglas-Glasfärbeglases. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Abdecklippen aufrecht stehen und gut getrennt sind, damit alle Oberflächen während des Reinigungsvorgangs deutlich freigelegt werden.</li>
	<li>Gießen Sie genug Aceton in das Färbeglas, um die Decklippen zu bedecken, legen Sie die Abdeckung auf und beschallen Sie sie für 10 min bei 40 ° C.</li>
	<li>Gießen Sie das Aceton aus und spülen Sie die Abdecklippen aus, indem Sie das Färbeglas mit destilliertem H2O füllen und das Wasser ausgießen. Wiederholen Sie 2 weitere Male.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Aceton-Beschallung (Schritte 1.2 und 1.3) noch einmal.</li>
	<li>Gießen Sie genug 200 mM KOH in das Glas, um die Deckrutsche abzudecken und beschallen Sie abgedeckt, für 20 min bei 40 ° C. HINWEIS: Der KOH ätscht das Glas leicht.</li>
	<li>Spülen Sie die Abdecklippen mit destilliertemH2O6 mal aus.</li>
	<li>Ethanol hinzufügen, um die Deckslippen abzudecken, den Deckel hinzufügen und 10 Minuten bei 40 °C beschallen.</li>
	<li>Spülen Sie die Abdecklippen mit destilliertemH2O3 mal aus.</li>
	<li>Nehmen Sie jeden Abdeckr am Rand mit einer sanften Zette auf und trocknen Sie die Abdeckrlips mit N2-Gas. Berühren Sie nur die Kanten des Abdeckungsrutsches. Legen Sie jeden der getrockneten, gereinigten Abdecklippen in eine einzelne saubere Petrischale.</li>
</ol>2. Verdunstungsablagerung von Polystyrolperlen
<ol><li>Um die kolloidale Kristallmaske für das ZMW-Array zu erstellen, zentrifugieren Sie 50 μL mit 1 μm Durchmesser, nicht funktionalisierte Polystyrolperlen (2,5% w/v in Wasser) bei 15.000 x g,25 °C für 5 min. HINWEIS: Vor dem Pipettieren der Perlen sollte die Stammlösung kurz vorgetext werden, falls sich die Perlen auf dem Boden der Flasche abgesetzt haben.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand und lassen Sie so wenig Wasser wie möglich übrig. HINWEIS: Restwasser kann die Verdunstungseigenschaften der Ethanol-Resuspension39verändern, so dass das Entfernen einer kleinen Menge Perlen, um das gesamte Wasser zu entfernen, akzeptabel ist.</li>
	<li>Die Perlen aus Schritt 2.2 werden in 50 μL 1:400 TritonX-100:Ethanol Lösungsmittel resuspendiert. Mehrmals auf und ab pipetten, um die Perlen gründlich mit dem Lösungsmittel zu mischen. HINWEIS: TritonX-100: Ethanol-Lösungsmittel sollte nach Gebrauch mit Paraffinfolie versiegelt und einmal im Monat frisch zubereitet werden. Die Perlen neigen dazu, an den Seiten eines Kunststoffgefäßes zu haften, z. B. an einem Mikrozentrifugenröhrchen, also pipetten Sie entlang der Seiten, um sicherzustellen, dass alle Perlen wieder aufgewendet werden.</li>
	<li>Um eine Feuchtigkeitskammer für die Ablagerung einzurichten, legen Sie 6 Petrischalen mit jeweils einem Deckslip auf eine Bank in einer Linie mit leicht offenen Deckeln. Bewegen Sie in jeder Schüssel den Abdeckungsrutsch in den offenen Bereich, so dass die Abdeckungsrutsche der Umgebung ausgesetzt sind, wenn die Luftfeuchtigkeit im nächsten Schritt erhöht wird.</li>
	<li>Platzieren Sie ein Hygrometer und einen kleinen elektrischen Ventilator zentriert hinter den Petrischalen.</li>
	<li>Zeichnen Sie die beginnende relative Luftfeuchtigkeit (RH) im Labor auf. Füllen Sie ein 200 ml Becherglas mit 150−200 ml ~75 °C Wasser und legen Sie es hinter den Ventilator.</li>
	<li>Schalten Sie den Ventilator ein und bedecken Sie Petrischalen, Ventilator, Becher und Hygrometer mit einem umgekippten, transparenten Kunststoffbehälter (66 cm x 46 cm x 38 cm).</li>
	<li>Lassen Sie die relative Luftfeuchtigkeit in der Kammer auf 70-75% ansteigen, was normalerweise 5-10 Minuten dauert. HINWEIS: Wenn der rh im Umgebungslabor niedrig ist (unter ~ 50%), lassen Sie die Kammer einen höheren RH erreichen, aber nicht höher als 80%, um den Feuchtigkeitsverlust während der Ablagerung auszugleichen (siehe unten).</li>
	<li>Wenn der relative Stand 70-75% erreicht, zeichnen Sie die relative Luftfeuchtigkeit auf und heben Sie den Kunststoffbehälter leicht an, um schnell Abdeckungen auf die Petrischalen zu legen, wodurch eine Überbenetzung der Abdecklippen verhindert wird. HINWEIS: Die Temperatur in der Kammer ist aufgrund der Befeuchtung etwas wärmer als die Raumtemperatur, typischerweise 25-26 ° C. Wenn Feuchtigkeit auf den Abdecklippen sichtbar ist, sind die Glasoberflächen zu nass. Ein kommerzielles Handschuhfach kann diesen Teil des Protokolls vereinfachen.</li>
	<li>Lassen Sie die relative Luftfeuchtigkeit in der Kammer weiterhin auf 85% steigen. Zeichnen Sie an diesem Punkt die relative Luftfeuchtigkeit in der Feuchtigkeitskammer auf und pipetetten Sie 5 μL der Perlensuspension auf die Mitte jedes Abdecks.</li>
	<li>Schließen Sie die Kammer und die Petrischalen nach jeder Ablagerung, um den Feuchtigkeitsverlust zu minimieren. Ziel ist es, alle 6 Ablagerungen innerhalb von 2 Minuten zu beenden.</li>
	<li>Notieren Sie die relative Luftfeuchtigkeit in der Kammer nach der Ablagerung. HINWEIS: Die relative Luftfeuchtigkeit nach der Abscheidung hilft zu messen, wie schnell feuchtigkeit während der Ablagerung verloren ging, was von den Umgebungsbedingungen im Labor abhängt. Für einen typischen erfolgreichen Lauf beginnt die Kammer vor der Ablagerung bei 85% RH und endet nach der Ablagerung bei 70-75% RH.</li>
	<li>Die Perlentröpfchen verteilen lassen und 5 min trocknen lassen. HINWEIS: Wenn die kolloidalen Kristalle viele Löcher oder mehrschichtige Regionen haben, war die Kammer wahrscheinlich zu feucht bzw. trocken. Stellen Sie die relative Luftfeuchtigkeit ein, bei der die Petrischalen geschlossen und die Ablagerungen begonnen werden sollen (siehe Abschnitt Ergebnisse für weitere Diskussionen zur Optimierung).</li>
</ol>3. Perlenglühen zur Reduzierung der Porengröße in der kolloidalen Kristallschablone
<ol><li>Um eine gleichmäßige Temperaturoberfläche für das Glühen der Polystyrolperlen zu schaffen, die die Zwischenkugel-Zwischenpunkte verengt und die Ecken der Zwischenabstande rundet, legen Sie eine flache, gefräste Aluminiumplatte auf eine Standard-Keramik-Heizplatte.</li>
	<li>Stellen Sie die Temperatur der Heizplatte auf 107 °C ein, die Glasübergangstemperatur von Polystyrol40. HINWEIS: Um eine stabile und genaue Temperatur zu erhalten, wurde eine Thermoelementsonde in einem 2-3 mm breiten und 4-5 mm tiefen Loch in der Aluminiumplatte gehalten.</li>
	<li>Legen Sie einen Abdeckrlip mit der Perlenschablone auf die heiße Aluminiumplatte und glühen Sie für 20 s (siehe Diskussionsabschnitt für die Erklärung der Schmelzzeit).</li>
	<li>Entfernen Sie nach dem Erhitzen den Deckdeckel von der Aluminiumplatte und legen Sie ihn sofort auf eine andere Aluminiumoberfläche mit Raumtemperatur, um sie zu kühlen. HINWEIS: Es ist hilfreich, entweder die Abdecklippen leicht über den Rand der Platte hängen zu lassen oder flache Kanäle (siehe begleitendes Video) in die Platte zu fräsen, um die Aufnahme der Abdecklippen zu erleichtern.</li>
</ol>4. Nanofabrikation von Aluminium-Zero-Mode-Wellenleitern mit der kolloidalen Kristallschablone
<ol><li>Mit thermischer oder Elektronenstrahl-Verdunstungsabscheidung lagern Sie 300 nm Kupfer bei 2 Å/s über die kolloidale Kristallschablone ab, um Pfosten in den Zwischenablagen zwischen den Perlen zu erzeugen.</li>
	<li>Entfernen Sie überschüssiges Metall auf den Perlen, indem Sie die Oberfläche vorsichtig mit Klebeband drücken. Ziehen Sie das Klebeband langsam ab, um das Metall abzuziehen. HINWEIS: Einige kleine Flecken von reflektierendem überschüssigem Metall können nach dem Bandzug verbleiben, und diese können oft durch einen Strom vonN2-Gas entfernt werden. Wenn nach dem Bandzug erhebliche Flecken von reflektierendem überschüssigem Metall verbleiben, versuchen Sie, die Schablonen 2 Stunden lang in Toluol einzuweichen, um die Polystyrolperlen teilweise aufzulösen. Waschen Sie die Abdecklappen mit destilliertem Wasser, trocknen Sie sie mitN 2und wiederholen Sie den Bandzug. Das zusätzliche Einweichen sollte die Perlen nicht vollständig auflösen, da die Perlen dazu beitragen, die Pfosten vor Beschädigungen während des Bandzugs zu schützen.</li>
	<li>Um die Polystyrolperlen aufzulösen, legen Sie die Perlenschablonen in Toluol und weichen Sie sie über Nacht ein. ACHTUNG: Toluoldämpfe können giftig sein. Arbeiten Sie mit Toluol unter einer gut belüfteten Kapuze und tragen Sie persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Handschuhe, Schutzbrille und laborbeschichtet. Toluol sollte in belüfteten Schränken gelagert werden, die für brennbare Flüssigkeiten bestimmt sind.</li>
	<li>Nach der Toluol-Inkubation spülen Sie die Schablonen einmal mit Chloroform und zweimal mit Ethanol ab. Behandeln Sie an dieser Stelle vorsichtig die Abdeckungen, da die empfindlichen 200-300 nm hohen Metallpfosten jetzt freigelegt sind. Trocknen Sie die Schablonen mitN 2 und entfernen Sie Restpolymere und Verunreinigungen in einem Sauerstoffplasmareiniger für 30 min. ACHTUNG: Chloroforme Dämpfe können giftig sein. Arbeiten Sie mit Chloroform unter einer gut belüfteten Kapuze und tragen Sie persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Handschuhe, Schutzbrille und einen Laborkittel. Chloroform sollte in belüfteten Schränken fern von anderen brennbaren Lösungsmitteln gelagert werden.</li>
	<li>Mit thermischer oder Elektronenstrahl-Verdunstungsabscheidung 3 nm einer Titanadhäsionsschicht bei 1 Å/s abscheiden, gefolgt von 100−150 nm Aluminium bei 4 Å/s um und auf den Kupferpfosten. HINWEIS: Man kann eine dickere Verkleidung verwenden, um tiefere Führungen und eine bessere Dämpfung der Hintergrundfluoreszenz zu erhalten, aber dies verringert auch die Ausbeute nach dem Freilegen und Auflösen der Pfosten im nächsten Schritt (siehe Diskussionsabschnitt).</li>
	<li>Um die Metallpfosten aufzulösen, weichen Sie die Abdecklippen in Kupferätzmittel (Zitronensäure-basiert; Materialtabelle) für 2 h. ACHTUNG: Metallätzen kann Hautverbrennungen verursachen. Arbeiten Sie mit Ätzmitteln unter einer gut belüfteten Motorhaube und tragen Sie Schutzausrüstung. Waschen Sie die Hände nach der Handhabung gründlich. Metallätzmittel sollten in belüfteten Schränken gelagert werden, die für korrosive Flüssigkeiten bestimmt sind.</li>
	<li>Spülen Sie die Deckzettel mit destilliertem Wasser ab, trocknen Sie sie mit N2und polieren Sie die Oberfläche der Metallverkleidung vorsichtig mit Linsenpapier ab, um alle Pfosten freizulegen, die noch mit der Verkleidung bedeckt sind. Die Abdecks für weitere 2 h wieder in Kupferätzung geben, dann erneut mit destilliertem Wasser abspülen und mitN2 trocknen. HINWEIS: ZMW-Objektträger sollten in abgedeckten, sauberen Petrischalen aufbewahrt werden, um sie frei von Verunreinigungen zu halten.</li>
</ol>5. Nanofabrikation von Gold-Nullmodus-Wellenleitern mit der kolloidalen Kristallschablone
HINWEIS: Die Methode zur Herstellung von Gold-ZMWs (Ergänzende Abbildung 1), die das Protokoll zur Herstellung von Aluminium-ZMWs widerspiegelt, wird in diesem Abschnitt bereitgestellt.
<ol><li>Mit thermischer oder Elektronenstrahlverdunstungsabscheidung 3 nm einer Titanadhäsionsschicht bei 1 Å/s abscheiden, gefolgt von 300 nm Aluminium bei 4 Å/s.</li>
	<li>Entfernen Sie überschüssiges Metall auf den Perlen, indem Sie die Oberfläche vorsichtig mit Klebeband drücken. Ziehen Sie das Klebeband langsam ab, um das Metall abzuziehen.</li>
	<li>Um die Polystyrolperlen aufzulösen, legen Sie die Perlenschablonen in Toluol und weichen Sie sie über Nacht ein.</li>
	<li>Nach der Toluol-Inkubation spülen Sie die Schablonen einmal mit Chloroform und zweimal mit Ethanol ab. Trocknen Sie die Schablonen mitN 2 und entfernen Sie reste Polymerverunreinigungen in einem Sauerstoffplasmareiniger für 30 min.</li>
	<li>Mit thermischer oder Elektronenstrahlverdunstungsabscheidung lagern Sie 100-150 nm Gold bei 5 Å / s um und auf den Aluminiumpfosten ab.</li>
	<li>Um die Metallpfosten aufzulösen, weichen Sie die Abdeckel in Aluminiumätzmittel (auf Phosphorsäurebasis; Materialtabelle) für 1 h.</li>
	<li>Spülen Sie die Deckzettel mit destilliertem Wasser ab, trocknen Sie sie mit N2und polieren Sie die Oberfläche der Metallverkleidung vorsichtig mit Linsenpapier ab, um alle Pfosten freizulegen, die noch mit der Verkleidung bedeckt sind. Legen Sie die Abdeckel für 1 h wieder in Aluminiumätzen, dann erneut mit destilliertem Wasser abspülen und mitN2 trocknen. HINWEIS: ZMW-Dias sollten in abgedeckten, sauberen Petrischalen aufbewahrt werden.</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Für die kolloidale Selbstorganisation (Protokollabschnitt 2) beschleunigt die Verwendung von Ethanol anstelle von Wasser als Suspensionslösungsmittel den Verdampfungsprozess, so dass die Schablonen in 2−3 min nach der Abscheidung fertig sind und nicht wie bei den vorherigen Methoden48,49 in 1−2h. Das hier vorgestellte Verdunstungssedimentationsprotokoll ist auch einfacher als frühere Sedimentationsprotokolle, die die Kontrolle von Oberflächenneigung, Temp...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/t/61154">Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy</a>. A figure was updated.
Figure 3 was updated from:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

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Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

Einzelmolekültechniken wie Einzelmolekül-Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (smFRET) oder Einzelmolekül-Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) sind leistungsfähige Werkzeuge für die molekulare Biophysik, die die Untersuchung dynamischer Bewegungen, Konformationen und Wechselwirkungen einzelner Biomoleküle in Prozessen wie Transkription1,2,3, Translation4,5,6und vielen anderen ermöglichen7. Für smFRET ist die TIRF-Mikroskopie (Total Internal Reflection Fluorescence) eine gängige Methode, da viele angebundene Moleküle im Laufe der Zeit verfolgt werden können und die von TIR erzeugte evaneszente Welle auf einen 100-200-nm-Bereich neben dem Coverslip8beschränkt ist. Trotz dieser Beschränkung des Anregungsvolumens müssen jedoch noch interessante Fluorophore in pM- oder nM-Bereiche verdünnt werden, um Einzelmolekülsignale oberhalb der Hintergrundfluoreszenz9zu detektieren. Da die Michaelis-Menten-Konstanten zellulärer Enzyme typischerweise im Bereich von μM bis mM10 liegen,sind biochemische Reaktionen in Einzelmolekülstudien in der Regel viel langsamer als die in der Zelle. Zum Beispiel findet die Proteinsynthese bei 15-20 Aminosäuren pro Sekunde in E. coli11,12statt, während die meisten prokaryotischen Ribosomen in smFRET-Experimenten bei 0,1-1 Aminosäure pro Sekunde13übersetzen. In der Proteinsynthese zeigten Kristallstrukturen und smFRET an festgefahrenen Ribosomen, dass Transfer-RNAs (tRNAs) vor der tRNA-mRNA-Translokation Schritt14,15zwischen "hybriden" und "klassischen" Zuständen schwanken. Wenn jedoch physiologische Konzentrationen des Translokations-GTPase-Faktors EF-G vorhanden waren, wurde in smFRET 6 eine andere Konformation beobachtet, die zwischen dem hybriden und dem klassischen Zustandliegt. Die Untersuchung dynamischer molekularer Prozesse mit ähnlichen Geschwindigkeiten und Konzentrationen wie in der Zelle ist wichtig, bleibt aber eine technische Herausforderung.
Eine Strategie zur Erhöhung der fluoreszierenden Substratkonzentration ist die Verwendung metallbasierter, subsichtbarer Wellenlängenöffnungen, sogenannte Zero Mode Waveguides (ZMWs), um begrenzte Anregungsfelder zu erzeugen, die selektiv Biomoleküle anregen, die innerhalb der Aperturen lokalisiert sind16 (Abbildung 1). Die Öffnungen sind typischerweise 100−200 nm im Durchmesser und 100−150 nm in der Tiefe17. Oberhalb einer Cutoff-Wellenlänge bezogen auf die Größe und Form der Brunnen (λc ≈ 2,3-facher Durchmesser für kreisförmige Wellenleiter mit Wasser als dielektrischem Medium18)sind im Wellenleiter keine Ausbreitungsmoden erlaubt, daher der Begriff Nullmodus-Wellenleiter. Ein oszillierendes elektromagnetisches Feld, eine evaneszente Welle, exponentiell zerfallende Intensität, tunnelt jedoch immer noch eine kurze Strecke in den Wellenleiter18,19. Obwohl sie den evaneszenten TIR-Wellen ähneln, haben ZMW-evaneszente Wellen eine kürzere Zerfallskonstante, was zu einem effektiven Anregungsbereich von 10-30 nm innerhalb des Wellenleiters führt. Bei mikromolaren Konzentrationen fluoreszierend markierter Liganden sind nur ein oder wenige Moleküle gleichzeitig im Anregungsgebiet vorhanden. Diese Einschränkung des Anregungsvolumens und die daraus resultierende Reduktion der Hintergrundfluoreszenz ermöglicht die Fluoreszenzbildgebung einzelner Moleküle in biologisch relevanten Konzentrationen. Dies wurde auf viele Systeme20angewendet, einschließlich FCS-Messungen der Einzelproteindiffusion21,Einzelmolekül-FRET-Messungen von niedrigaffinen Liganden-Protein-22 und Protein-Protein-Interaktionen23und spektro-elektrochemische Messungen von einzelnen molekularen Umsatzereignissen24.
ZMWs wurden durch direktes Strukturieren einer Metallschicht mit Ionenstrahlfräsen25,26 oder Elektronenstrahllithographie (EBL)hergestellt,gefolgt von Plasmaätzen16,27. Diese maskenlosen Lithographiemethoden erzeugen Wellenleiter in Serie und erfordern in der Regel Zugang zu spezialisierten Nanofabrikationsanlagen, was eine weit verbreitete Einführung der ZMW-Technologie verhindert. Eine andere Methode, ultraviolette Nanoimprint-Lithographie-Lift-off28,verwendet eine Quarz-Diaform, um eine inverse ZMW-Schablone wie einen Stempel auf einen Widerstandsfilm zu drücken. Während diese Methode stromlinienförmiger ist, benötigt sie immer noch EBL für die Herstellung der Quarzform. Dieser Artikel stellt das Protokoll für eine einfache und kostengünstige vorgefertigte Herstellungsmethode vor, die kein EBL- oder Ionenstrahlfräsen erfordert und auf der engen Verpackung von Nanosphären basiert, um eine lithographische Maske zu bilden.
Die Nanosphären- oder "natürliche" Lithographie, die erstmals 1982 von Deckman und Dunsmuir29,30vorgeschlagen wurde, verwendet die Selbstorganisation monodisperser kolloidaler Partikel, die von Dutzenden von Nanometern bis zu Dutzenden von Mikrometern31reichen, um Vorlagen für die Oberflächenstrukturierung durch Ätzen und / oder Abscheiden von Materialien zu erstellen. Die zweidimensionalen (2D) oder dreidimensionalen (3D) erweiterten periodischen Anordnungen kolloidaler Partikel, die als kolloidale Kristalle bezeichnet werden, zeichnen sich durch eine helle Iriseszenz aus Streuung und Beugungaus 32aus. Obwohl diese Maskierungsmethode weniger weit verbreitet ist als Elektronenstrahl- oder Photolithographie, ist sie einfach, kostengünstig und leicht zu verkleinern, um Feature-Größen unter 100 nm zu erzeugen.
Die Selbstorganisation kolloidaler Partikel bestimmt den Erfolg der Verwendung kolloidaler Kristalle als Masken für die Oberflächenstrukturierung. Wenn die Größe und Form der Partikel homogen sind, können kolloidale Partikel leicht mit hexagonaler Packung selbst zusammengesetzt werden, angetrieben durch entropische Erschöpfung33. Die Wasserverdampfung nach der Tropfenbeschichtung ist ein effektiver Weg, um die kolloidalen Partikel zu sedimentieren, obwohl andere Methoden Tauchbeschichtung34, Spinbeschichtung35, elektrophoretische Abscheidung36und Konsolidierung an einer Luft-Wasser-Grenzfläche37umfassen. Das unten vorgestellte Protokoll basiert auf der Verdunstungssedimentationsmethode, die am einfachsten zu implementieren war. Die dreieckigen Zwischenstellen zwischen dicht gepackten Polystyrolperlen bilden Öffnungen, in denen ein Opfermetall plattiert wird, wodurch Pfosten entstehen (Abbildung 2 und ergänzende Abbildung 1). Kurzes Glühen der Perlen vor diesem Schritt passt die Form und den Durchmesser dieser Pfosten an. Die Perlen werden entfernt, eine letzte Metallschicht wird um die Pfosten herum abgelagert und dann werden die Pfosten entfernt. Nach den beiden Metallabscheidungsschritten auf die kolloidale Nanomaske, der Entfernung der Zwischenpfosten und der oberflächenchemischen Modifikation zur Passivierung und Anbindeung sind die ZMW-Arrays für die Einzelmolekülbildgebung einsatzbereit. Eine weitergehende Charakterisierung der optischen Eigenschaften des ZMW nach der Herstellung findet sich in einem begleitenden Artikel38. Neben einem thermischen Verdampfer zur Dampfabscheidung der Metalle sind keine Spezialwerkzeuge erforderlich.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;1. Glass Coverslip Cleaning&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma</td><td>32201</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Coplin glass staining jar</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-817</td><td>Staining jar with 8 grooves and molded glass cover</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>VWR</td><td>48404-467</td><td>24 mm x 30 mm (No.1&amp;frac12;, Rectangular)</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>1 L</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>30603</td><td>Potassium hydroxide</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>R80115TS</td><td>100 mm diameter, 15 mm deep</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td>Z245143</td><td>Tabletop ultrasonic cleaner, 5510</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clear storage container</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-110-8222</td><td>26 x 18 x 15 in.</td></tr><tr><td>Desk fan</td><td>O2Cool</td><td>FD05001A</td><td>Any small desk (~5 in.) fan will work</td></tr><tr><td>Glass beaker</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-555-25B</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>Humidity meter</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-661-19</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-402-903</td><td>1.5 mL</td></tr><tr><td>Polystyrene microspheres</td><td>Polysciences</td><td>18602-15</td><td>1.00 &amp;micro;m diameter, non-functionalized</td></tr><tr><td>Triton X-100 deturgent</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aluminum plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA11062RY</td><td>Customized in-house to 14 cm x 14 cm</td></tr><tr><td>Ceramic hotplate</td><td>Fisher Scientific</td><td>HP88857100</td><td>13 x 8.2 x 3.8 in.</td></tr><tr><td>Temperature controller</td><td>McMaster-Carr</td><td>38615K71</td><td>Read temperature with thermocouple probe</td></tr><tr><td>Thermocouple probe</td><td>McMaster-Carr</td><td>9251T93</td><td>Type K, surface probe</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aluminum etchant</td><td>Transene</td><td>Type A</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum pellets</td><td>Kurt J. Lesker</td><td>EVMAL40QXHB</td><td>For electron beam evaporation</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>288306</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Copper etchant</td><td>Transene</td><td>49-1</td><td></td></tr><tr><td>Copper pellets</td><td>Kurt J. Lesker</td><td>EVMCU40QXQA</td><td>For electron beam evaporation</td></tr><tr><td>Gold pellets</td><td>Kurt J. Lesker</td><td>EVMAUXX40G</td><td>For electron beam evaporation</td></tr><tr><td>Lens paper</td><td>Thorlabs</td><td>MC-5</td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Scotch tape</td><td>Staples</td><td>MMM119</td><td></td></tr><tr><td>Thin film deposition system</td><td>Kurt J. Lesker</td><td>PVD-75</td><td>Tabletop thermal evaporation system will also work</td></tr><tr><td>Titanium pellets</td><td>Kurt J. Lesker</td><td>EVMTI45QXQA</td><td>For electron beam evaporation</td></tr><tr><td>Toluene</td><td>Sigma</td><td>244511</td><td>1 L</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Representative Results&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>COMSOL Multiphysics Modeling Software</td><td>COMSOL, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dual View spectral splitter</td><td>Photometrics, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fabrication of zero mode waveguides for high concentration single molecule microscopy

In der Einzelmolekülfluoreszenzenzymologie begrenzt die Hintergrundfluoreszenz von markierten Substraten in Lösung die Fluorophorkonzentration oft auf pico- bis nanomolare Bereiche, mehrere Größenordnungen weniger als viele physiologische Ligandenkonzentrationen. Optische Nanostrukturen, sogenannte Zero Mode Waveguides (ZMWs), bei denen es sich um Aperturen mit einem Durchmesser von 100-200 nm handelt, die in einem dünnen leitenden Metall wie Aluminium oder Gold hergestellt werden, ermöglichen die Abbildung einzelner Moleküle bei mikromolaren Konzentrationen von Fluorophoren, indem sie die Anregung des sichtbaren Lichts auf zeptoliterische effektive Volumina beschränken. Der Bedarf an teuren und spezialisierten Nanofabrikationsgeräten hat jedoch die weit verbreitete Verwendung von ZMWs ausgeschlossen. Typischerweise werden Nanostrukturen wie ZMWs durch direktes Schreiben mit Elektronenstrahllithographie erhalten, die sequenziell und langsam ist. Hier wird die kolloidale oder Nanosphärenlithographie als alternative Strategie verwendet, um Masken im Nanometerbereich für die Wellenleiterherstellung herzustellen. Dieser Bericht beschreibt den Ansatz ausführlich mit praktischen Überlegungen für jede Phase. Das Verfahren ermöglicht es, Tausende von Aluminium- oder Gold-ZMWs parallel mit endgültigen Wellenleiterdurchmessern und Tiefen von 100-200 nm zu machen. Es werden nur gängige Laborgeräte und ein thermischer Verdampfer für die Metallabscheidung benötigt. Indem ZMWs für die biochemische Gemeinschaft zugänglicher gemacht werden, kann diese Methode die Untersuchung molekularer Prozesse bei zellulären Konzentrationen und Raten erleichtern.

Die Selbstorganisation der kolloidalen Polystyrolpartikel durch Verdunstungssedimentation (Schritte 2.1−2.13) kann zu einer Reihe von Ergebnissen führen, da sie eine Kontrolle der Lösungsmittelverdampfungsrate erfordert. Da die Ablagerungen jedoch schnell sind (10-15 min pro Runde), kann das Verfahren schnell für unterschiedliche Umgebungsbedingungen im Labor optimiert werden. Abbildung 3A zeigt eine wohlgeformte kolloidale Schablone nach Ablagerung und Verdampfung. Makroskopisch ist de...

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Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

Hier wird eine Nanosphärenlithographiemethode zur parallelen Herstellung von Nullmoduswellenleitern beschrieben, bei denen es sich um Arrays von Nanoaperturen in einem metallbeschichteten Glasmikroskopie-Coverlip für die Einzelmolekülbildgebung bei nano- bis mikromolaren Konzentrationen von Fluorophoren handelt. Die Methode nutzt die Kolloidalkristall-Selbstorganisation, um eine Hohlleiterschablone zu erstellen.

Herstellung von Zero Mode Waveguides für die hochkonzentrierte Einzelmolekülmikroskopie

In single molecule fluorescence enzymology, background fluorescence from labeled substrates in solution often limits fluorophore concentration to pico- to ...

fabrication-zero-mode-waveguides-for-high-concentration-single

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.9K Aufrufe.  University of Pennsylvania. Hier wird eine Nanosphärenlithographiemethode zur parallelen Herstellung von Nullmoduswellenleitern beschrieben, bei denen es sich um Arrays von Nanoaperturen in einem metallbeschichteten Glasmikroskopie-Coverlip für die Einzelmolekülbildgebung bei nano- bis mikromolaren Konzentrationen von Fluorophoren handelt. Die Methode nutzt die Kolloidalkristall-Selbstorganisation, um eine Hohlleiterschablone zu erstellen.

Serie: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

Fabrication of Silica Ultra High Quality Factor Microresonators

Whispering gallery resonant cavities confine light in circular orbits at their periphery.1-2 The photon storage lifetime in the cavity, quantified by the quality factor (Q) of the cavity, can be in excess of 500ns for cavities with Q factors above 100 million. As a result of their low material losses, silica microcavities have demonstrated some of the longest photon lifetimes to date1-2. Since a portion of the circulating light extends outside the resonator, these devices can also be used to probe the surroundings. This interaction has enabled numerous experiments in biology, such as single molecule biodetection and antibody-antigen kinetics, as well as discoveries in other fields, such as development of ultra-low-threshold microlasers, characterization of thin films, and cavity quantum electrodynamics studies.3-7
The two primary silica resonant cavity geometries are the microsphere and the microtoroid. Both devices rely on a carbon dioxide laser reflow step to achieve their ultra-high-Q factors (Q&gt;100 million).1-2,8-9 However, there are several notable differences between the two structures. Silica microspheres are free-standing, supported by a single optical fiber, whereas silica microtoroids can be fabricated on a silicon wafer in large arrays using a combination of lithography and etching steps. These differences influence which device is optimal for a given experiment.
Here, we present detailed fabrication protocols for both types of resonant cavities. While the fabrication of microsphere resonant cavities is fairly straightforward, the fabrication of microtoroid resonant cavities requires additional specialized equipment and facilities (cleanroom). Therefore, this additional requirement may also influence which device is selected for a given experiment.
Introduction
An optical resonator efficiently confines light at specific wavelengths, known as the resonant wavelengths of the device. 1-2 The common figure of merit for these optical resonators is the quality factor or Q. This term describes the photon lifetime (&tau;o) within the resonator, which is directly related to the resonator's optical losses. Therefore, an optical resonator with a high Q factor has low optical losses, long photon lifetimes, and very low photon decay rates (1/&tau;o). As a result of the long photon lifetimes, it is possible to build-up extremely large circulating optical field intensities in these devices. This very unique property has allowed these devices to be used as laser sources and integrated biosensors.10
A unique sub-class of resonators is the whispering gallery mode optical microcavity. In these devices, the light is confined in circular orbits at the periphery. Therefore, the field is not completely confined within the device, but evanesces into the environment. Whispering gallery mode optical cavities have demonstrated some of the highest quality factors of any optical resonant cavity to date.9,11 Therefore, these devices are used throughout science and engineering, including in fundamental physics studies and in telecommunications as well as in biodetection experiments. 3-7,12
Optical microcavities can be fabricated from a wide range of materials and in a wide variety of geometries. A few examples include silica and silicon microtoroids, silicon, silicon nitride, and silica microdisks, micropillars, and silica and polymer microrings.13-17 The range in quality factor (Q) varies as dramatically as the geometry. Although both geometry and high Q are important considerations in any field, in many applications, there is far greater leverage in boosting device performance through Q enhancement. Among the numerous options detailed previously, the silica microsphere and the silica microtoroid resonator have achieved some of the highest Q factors to date.1,9 Additionally, as a result of the extremely low optical loss of silica from the visible through the near-IR, both microspheres and microtoroids are able to maintain their Q factors over a wide range of testing wavelengths.18 Finally, because silica is inherently biocompatible, it is routinely used in biodetection experiments.
In addition to high material absorption, there are several other potential loss mechanisms, including surface roughness, radiation loss, and contamination loss.2 Through an optimization of the device size, it is possible to eliminate radiation losses, which arise from poor optical field confinement within the device. Similarly, by storing a device in an appropriately clean environment, contamination of the surface can be minimized. Therefore, in addition to material loss, surface scattering is the primary loss mechanism of concern.2,8
In silica devices, surface scattering is minimized by using a laser reflow technique, which melts the silica through surface tension induced reflow. While spherical optical resonators have been studied for many years, it is only with recent advances in fabrication technologies that researchers been able to fabricate high quality silica optical toroidal microresonators (Q&gt;100 million) on a silicon substrate, thus paving the way for integration with microfluidics.1
The present series of protocols details how to fabricate both silica microsphere and microtoroid resonant cavities. While silica microsphere resonant cavities are well-established, microtoroid resonant cavities were only recently invented.1 As many of the fundamental methods used to fabricate the microsphere are also used in the more complex microtoroid fabrication procedure, by including both in a single protocol it will enable researchers to more easily trouble-shoot their experiments.

We describe the use of a carbon dioxide laser reflow technique to fabricate silica resonant cavities, including free-standing microspheres and on-chip microtoroids. The reflow method removes surface imperfections, allowing long photon lifetimes within both devices. The resulting devices have ultra high quality factors, enabling applications ranging from telecommunications to biodetection.

Herstellung von Silica Ultra High Quality Factor Mikroresonatoren

Whispering gallery resonant cavities confine light in circular orbits at their periphery.1-2 The photon storage lifetime in the cavity, quantified by the ...

Forschung

Ingenieurwesen

Terahertz Microfluidic Sensing Using a Parallel-plate Waveguide Sensor

Refractive index (RI) sensing is a powerful noninvasive and label-free sensing technique for the identification, detection and monitoring of microfluidic samples with a wide range of possible sensor designs such as interferometers and resonators 1,2. Most of the existing RI sensing applications focus on biological materials in aqueous solutions in visible and IR frequencies, such as DNA hybridization and genome sequencing. At terahertz frequencies, applications include quality control, monitoring of industrial processes and sensing and detection applications involving nonpolar materials.
Several potential designs for refractive index sensors in the terahertz regime exist, including photonic crystal waveguides 3, asymmetric split-ring resonators 4, and photonic band gap structures integrated into parallel-plate waveguides 5. Many of these designs are based on optical resonators such as rings or cavities. The resonant frequencies of these structures are dependent on the refractive index of the material in or around the resonator. By monitoring the shifts in resonant frequency the refractive index of a sample can be accurately measured and this in turn can be used to identify a material, monitor contamination or dilution, etc.
The sensor design we use here is based on a simple parallel-plate waveguide 6,7. A rectangular groove machined into one face acts as a resonant cavity (Figures 1 and 2). When terahertz radiation is coupled into the waveguide and propagates in the lowest-order transverse-electric (TE1) mode, the result is a single strong resonant feature with a tunable resonant frequency that is dependent on the geometry of the groove 6,8. This groove can be filled with nonpolar liquid microfluidic samples which cause a shift in the observed resonant frequency that depends on the amount of liquid in the groove and its refractive index 9.
Our technique has an advantage over other terahertz techniques in its simplicity, both in fabrication and implementation, since the procedure can be accomplished with standard laboratory equipment without the need for a clean room or any special fabrication or experimental techniques. It can also be easily expanded to multichannel operation by the incorporation of multiple grooves 10. In this video we will describe our complete experimental procedure, from the design of the sensor to the data analysis and determination of the sample refractive index.

The procedure for implementing a refractive index sensor for terahertz frequencies based on a grooved parallel-plate waveguide geometry is described here. The method yields a measurement of the refractive index of a small volume of liquid through monitoring of the shift in the resonant frequency of the waveguide structure

Terahertz Microfluidic Sensing mit einem Parallel-Platte Waveguide Sensor

Refractive index (RI) sensing is a powerful noninvasive and label-free sensing technique for the identification, detection and monitoring of microfluidic ...

Fabrication And Characterization Of Photonic Crystal Slow Light Waveguides And Cavities

Slow light has been one of the hot topics in the photonics community in the past decade, generating great interest both from a fundamental point of view and for its considerable potential for practical applications. Slow light photonic crystal waveguides, in particular, have played a major part and have been successfully employed for delaying optical signals1-4 and the enhancement of both linear5-7 and nonlinear devices.8-11
Photonic crystal cavities achieve similar effects to that of slow light waveguides, but over a reduced band-width. These cavities offer high Q-factor/volume ratio, for the realization of optically12 and electrically13 pumped ultra-low threshold lasers and the enhancement of nonlinear effects.14-16 Furthermore, passive filters17 and modulators18-19 have been demonstrated, exhibiting ultra-narrow line-width, high free-spectral range and record values of low energy consumption.
To attain these exciting results, a robust repeatable fabrication protocol must be developed. In this paper we take an in-depth look at our fabrication protocol which employs electron-beam lithography for the definition of photonic crystal patterns and uses wet and dry etching techniques. Our optimised fabrication recipe results in photonic crystals that do not suffer from vertical asymmetry and exhibit very good edge-wall roughness. We discuss the results of varying the etching parameters and the detrimental effects that they can have on a device, leading to a diagnostic route that can be taken to identify and eliminate similar issues.
The key to evaluating slow light waveguides is the passive characterization of transmission and group index spectra. Various methods have been reported, most notably resolving the Fabry-Perot fringes of the transmission spectrum20-21 and interferometric techniques.22-25 Here, we describe a direct, broadband measurement technique combining spectral interferometry with Fourier transform analysis.26 Our method stands out for its simplicity and power, as we can characterise a bare photonic crystal with access waveguides, without need for on-chip interference components, and the setup only consists of a Mach-Zehnder interferometer, with no need for moving parts and delay scans.
When characterising photonic crystal cavities, techniques involving internal sources21 or external waveguides directly coupled to the cavity27 impact on the performance of the cavity itself, thereby distorting the measurement. Here, we describe a novel and non-intrusive technique that makes use of a cross-polarised probe beam and is known as resonant scattering (RS), where the probe is coupled out-of plane into the cavity through an objective. The technique was first demonstrated by McCutcheon et al.28 and further developed by Galli et al.29

Use of photonic crystal slow light waveguides and cavities has been widely adopted by the photonics community in many differing applications. Therefore fabrication and characterization of these devices are of great interest. This paper outlines our fabrication technique and two optical characterization methods, namely: interferometric (waveguides) and resonant scattering (cavities).

Herstellung und Charakterisierung von Photonic Crystal Langsam Lichtwellenleitern und Hohlräume

Slow light has been one of the hot topics in the photonics community in the past decade, generating great interest both from a fundamental point of view ...

Synthesis and Operation of Fluorescent-core Microcavities for Refractometric Sensing

This paper discusses fluorescent core microcavity-based sensors that can operate in a microfluidic analysis setup. These structures are based on the formation of a fluorescent quantum-dot (QD) coating on the channel surface of a conventional microcapillary. Silicon QDs are especially attractive for this application, owing in part to their negligible toxicity compared to the II-VI and II-VI compound QDs, which are legislatively controlled substances in many countries. While the ensemble emission spectrum is broad and featureless, an Si-QD film on the channel wall of a capillary features a set of sharp, narrow peaks in the fluorescence spectrum, corresponding to the electromagnetic resonances for light trapped within the film. The peak wavelength of these resonances is sensitive to the external medium, thus permitting the device to function as a refractometric sensor in which the QDs never come into physical contact with the analyte. The experimental methods associated with the fabrication of the fluorescent-core microcapillaries are discussed in detail, as well as the analysis methods. Finally, a comparison is made between these structures and the more widely investigated liquid-core optical ring resonators, in terms of microfluidic sensing capabilities.

Fluorescent-core microcavity sensors employ a high-index quantum-dot coating in the channel of silica microcapillaries. Changes in the refractive index of fluids pumped into the capillary channel cause shifts in the microcavity fluorescence spectrum that can be used to analyze the channel medium.

Synthese und Betrieb von Leuchtstofflampen-core Mikrokavitäten für Refraktometrische Sensing

This paper discusses  fluorescent core microcavity-based sensors that can operate in a microfluidic  analysis setup. These structures are based on the ...

Fabrication, Operation and Flow Visualization in Surface-acoustic-wave-driven Acoustic-counterflow Microfluidics

Surface acoustic waves (SAWs) can be used to drive liquids in portable microfluidic chips via the acoustic counterflow phenomenon. In this video we present the fabrication protocol for a multilayered SAW acoustic counterflow device. The device is fabricated starting from a lithium niobate (LN) substrate onto which two interdigital transducers (IDTs) and appropriate markers are patterned. A polydimethylsiloxane (PDMS) channel cast on an SU8 master mold is finally bonded on the patterned substrate. Following the fabrication procedure, we show the techniques that allow the characterization and operation of the acoustic counterflow device in order to pump fluids through the PDMS channel grid. We finally present the procedure to visualize liquid flow in the channels. The protocol is used to show on-chip fluid pumping under different flow regimes such as laminar flow and more complicated dynamics characterized by vortices and particle accumulation domains.

In this video we first describe fabrication and operation procedures of a surface acoustic wave (SAW) acoustic counterflow device. We then demonstrate an experimental setup that allows for both qualitative flow visualization and quantitative analysis of complex flows within the SAW pumping device.

Fabrication, Operation and Flow Visualization in Oberflächenschallwellen-wave-driven Acoustic-Gegenstrom Mikrofluidik

Surface acoustic waves (SAWs) can be used to drive liquids in portable microfluidic chips via the acoustic counterflow phenomenon. In this video we ...

Implementation of a Reference Interferometer for Nanodetection

A thermally and mechanically stabilized fiber interferometer suited for examining ultra-high quality factor microcavities is fashioned. After assessing its free spectral range (FSR), the module is put in parallel with a fiber taper-microcavity system and then calibrated through isolating and eliminating random shifts in the laser frequency (i.e. laser jitter noise). To realize the taper-microcavity junction and to maximize the optical power that is transferred to the resonator, a single-mode optical fiber waveguide is pulled. Solutions containing polystyrene nanobeads are then prepared and flown to the microcavity in order to demonstrate the system&#8217;s ability to sense binding to the surface of the microcavity. Data is post-processed via adaptive curve fitting, which allows for high-resolution measurements of the quality factor as well as the plotting of time-dependent parameters, such as resonant wavelength and split frequency shifts. By carefully inspecting steps in the time-domain response and shifting in the frequency-domain response, this instrument can quantify discrete binding events.

A reference interferometer technique, which is designed to remove undesirable laser jitter noise for nanodetection, is utilized for probing an ultra-high quality factor microcavity. Instructions for assembly, setup, and data acquisition are provided, alongside the measurement process for specifying the cavity quality factor.

Implementierung eines Referenz-Interferometer für Nanodetection

A thermally and mechanically stabilized fiber interferometer suited for examining ultra-high quality factor microcavities is fashioned. After assessing ...

Stimulated Stokes and Antistokes Raman Scattering in Microspherical Whispering Gallery Mode Resonators

Dielectric microspheres can confine light and sound for a length of time through high quality factor whispering gallery modes (WGM). Glass microspheres can be thought as a store of energy with a huge variety of applications: compact laser sources, highly sensitive biochemical sensors and nonlinear phenomena. A protocol for the fabrication of both the microspheres and coupling system is given. The couplers described here are tapered fibers. Efficient generation of nonlinear phenomena related to third order optical non-linear susceptibility &#935;(3) interactions in triply resonant silica microspheres is presented in this paper. The interactions here reported are: Stimulated Raman Scattering (SRS), and four wave mixing processes comprising Stimulated Anti-stokes Raman Scattering (SARS). A proof of the cavity-enhanced phenomenon is given by the lack of correlation among the pump, signal and idler: a resonant mode has to exist in order to obtain the pair of signal and idler. In the case of hyperparametric oscillations (four wave mixing and stimulated anti-stokes Raman scattering), the modes must fulfill the energy and momentum conservation and, last but not least, have a good spatial overlap.

Efficient generation of nonlinear phenomena related to third order optical non-linear susceptibility &#935;(3) interactions in triply resonant silica microspheres is presented in this paper. The interactions here reported are: Stimulated Raman Scattering (SRS), and four wave mixing processes comprising Stimulated Anti-stokes Raman Scattering (SARS).

Stimulated Stokes und Antistokes Raman Scattering in Mikrosphärische Whispering Gallery-Modus Resona

Dielectric microspheres can confine light and sound for a length of time through high quality factor whispering gallery modes (WGM). Glass microspheres ...

Fabrication of 1-D Photonic Crystal Cavity on a Nanofiber Using Femtosecond Laser-induced Ablation

We present a protocol for fabricating 1-D Photonic Crystal (PhC) cavities on subwavelength-diameter tapered optical fibers, optical nanofibers, using femtosecond laser-induced ablation. We show that thousands of periodic nano-craters are fabricated on an optical nanofiber by irradiating with just a single femtosecond laser pulse. For a typical sample, periodic nano-craters with a period of 350 nm and with diameter gradually varying from 50 - 250 nm over a length of 1 mm are fabricated on a nanofiber with diameter around 450 - 550 nm. A key aspect of such a nanofabrication is that the nanofiber itself acts as a cylindrical lens and focuses the femtosecond laser beam on its shadow surface. Moreover, the single-shot fabrication makes it immune to mechanical instabilities and other fabrication imperfections. Such periodic nano-craters on nanofiber, act as a 1-D PhC and enable strong and broadband reflection while maintaining the high transmission out of the stopband. We also present a method to control the profile of the nano-crater array to fabricate apodized and defect-induced PhC cavities on the nanofiber. The strong confinement of the field, both transverse and longitudinal, in the nanofiber-based PhC cavities and the efficient integration to the fiber networks, may open new possibilities for nanophotonic applications and quantum information science.

We present a protocol for fabricating 1-D photonic crystal cavities on subwavelength diameter silica fibers (optical nanofibers) using femtosecond laser-induced ablation.

Die Herstellung von 1-D Photonic Kristallhöhle auf einer Nanofaser Mit Femtosekunden-Laser-induzierte Ablation

We present a protocol for fabricating 1-D Photonic Crystal (PhC) cavities on subwavelength-diameter tapered optical fibers, optical nanofibers, using ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced contrast due to optical sectioning. The conventional approach is to use high numerical aperture microscope TIRF objectives for both excitation and collection, severely limiting the field of view and throughput. We present a novel approach to generating TIRF excitation for imaging with optical waveguides, called chip-based nanoscopy. The aim of this protocol is to demonstrate how chip-based imaging is performed in an already built setup. The main advantage of chip-based nanoscopy is that the excitation and collection pathways are decoupled. Imaging can then be done with a low magnification lens, resulting in large field of view TIRF images, at the price of a small reduction in resolution. Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) were imaged using direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM), showing a resolution comparable to traditional super-resolution microscopes. In addition, we demonstrate the high-throughput capabilities by imaging a 500 &#181;m x 500 &#181;m region with a low magnification lens, providing a resolution of 76 nm. Through its compact character, chip-based imaging can be retrofitted into most common microscopes and can be combined with other on-chip optical techniques, such as on-chip sensing, spectroscopy, optical trapping, etc. The technique is thus ideally suited for high throughput 2D super-resolution imaging, but also offers great opportunities for multi-modal analysis.

Chip-based super-resolution optical microscopy is a novel approach to fluorescence microscopy and offers advantages in cost effectiveness and throughput. Here, the protocols for chip preparation and imaging are shown for TIRF microscopy and localization-based super-resolution microscopy.

Hochdurchsatz totale interne Reflexionfluoreszenz und direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie mit einem Photonischen Chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Biochemie

Fabrication of Refractive-index-matched Devices for Biomedical Microfluidics

The use of microfluidic devices has emerged as a defining tool for biomedical applications. When combined with modern microscopy techniques, these devices can be implemented as part of a robust platform capable of making simultaneous complementary measurements. The primary challenge created by the combination of these two techniques is the mismatch in refractive index between the materials traditionally used to make microfluidic devices and the aqueous solutions typically used in biomedicine. This mismatch can create optical artifacts near the channel or device edges. One solution is to reduce the refractive index of the material used to fabricate the device by using a fluorinated polymer such as MY133-V2000 whose refractive index is similar to that of water (n = 1.33). Here, the construction of a microfluidic device made out of MY133-V2000 using soft lithography techniques is demonstrated, using O2 plasma in conjunction with an acrylic holder to increase the adhesion between the MY133-V2000 fabricated device and the polydimethylsiloxane (PDMS) substrate. The device is then tested by incubating it filled with cell culture media for 24 h to demonstrate the ability of the device to maintain cell culture conditions during the course of a typical imaging experiment. Finally, quantitative phase microscopy (QPM) is used to measure the distribution of mass within the live adherent cells in the microchannel. This way, the increased precision, enabled by fabricating the device from a low index of refraction polymer such as MY133-V2000 in lieu of traditional soft lithography materials such as PDMS, is demonstrated. Overall, this approach for fabricating microfluidic devices can be readily integrated into existing soft lithography workflows in order to reduce optical artifacts and increase measurement precision.

This protocol describes the fabrication of microfluidic devices from MY133-V2000 to eliminate artifacts that often arise in microchannels due to the mismatching refractive indices between microchannel structures and an aqueous solution. This protocol uses an acrylic holder to compress the encapsulated device, improving adhesion both chemically and mechanically.

Herstellung von refraktiven Index passende Geräte für biomedizinische Mikrofluidik

The use of microfluidic devices has emerged as a defining tool for biomedical applications. When combined with modern microscopy techniques, these devices ...