이 작품은 NIH 보조금 R01GM080376, R35GM118139 및 NSF 엔지니어링 메카노생물학 CMMI 센터: 15-48571에서 Y.E.G.에, 그리고 NIAID 전 박사 NRSA 펠로우십 F30AI114187에서 Rj.j..M.

참고: 모든 단계는 일반 실험실 공간에서 완료할 수 있습니다.
1. 유리 커버 슬립 청소
<ol><li>콜로이드 입자의 증발 증착을 위한 깨끗한 표면을 제공하기 위해 24 x 30mm 광학 보로실리케이트 유리 커버립(0.16-0.19 mm 두께)을 세척용 코플린 유리 스테닝 항아리의 홈 인서트 내에 배치합니다. 참고: 커버립이 똑바로 서 있고 잘 분리되어 있는지 확인하여 청소 과정에서 모든 표면이 명확하게 노출되도록 합니다.</li>
	<li>염색 항아리에 충분한 아세톤을 부어 커버를 덮고 커버를 배치하고 40 °C에서 10 분 동안 초음파 처리하십시오.</li>
	<li>아세톤을 붓고 염색 된 항아리를 증류 한 H2O로 채우고 물을 부어 커버스립을 헹구습니다. 2회 더 반복합니다.</li>
	<li>아세톤 초음파 처리(1.2 단계 및 1.3 단계)를 다시 한 번 반복합니다.</li>
	<li>40°C에서 20분 동안 커버립을 커버하고 초음파 처리하여 항아리에 충분히 200mM KOH를 붓습니다. 참고 : KOH는 유리를 약간 등점합니다.</li>
	<li>증류된 H2O 6번으로 커버립을 헹구습니다.</li>
	<li>에탄올을 추가하여 커버립을 덮고 뚜껑을 추가하고 40°C에서 10분 동안 초음파 처리합니다.</li>
	<li>증류된 H2O 3번으로 커버립을 헹구습니다.</li>
	<li>부드러운 집게를 사용하여 가장자리의 각 커버슬립을 선택하고 N2 가스로 커버립을 건조시다. 커버슬립의 가장자리만 터치합니다. 말린 청소 커버립을 각각 개별 깨끗한 페트리 접시에 놓습니다.</li>
</ol>2. 폴리스티렌 구슬의 증발 증착
<ol><li>ZMW 어레이에 대한 콜로이드 크리스탈 마스크를 생성하기 위해, 1 μm 직경의 원심분리기 50 μL, 비기능성 폴리스티렌 구슬(물 2.5% w/v)에서 15,000 x g,25°C에서 5분 동안. 참고: 구슬을 파이프팅하기 전에 구슬이 병 바닥에 정착한 경우 주식 솔루션이 잠시 소용돌이쳐야 합니다.</li>
	<li>상체를 버리고 가능한 한 적은 물을 남깁니다. 참고: 잔류물은 에탄올재서스펜션(39)의증발 특성을 변경할 수 있으므로, 모든 물을 제거하기 위해 소량의 구슬을 제거할 수 있다.</li>
	<li>1:400 TritonX-100:에탄올 용매의 50 μL에서 2.2 단계에서 구슬을 재차질한다. 파이펫을 여러 번 위아래로 사용하여 구슬을 용매와 철저히 혼합합니다. 참고: TritonX-100:에탄올 용매는 사용 후 파라핀 필름으로 밀봉하고 한 달에 한 번 신선하게 준비해야 합니다. 구슬은 마이크로 센세이퍼튜브와 같은 플라스틱 용기의 측면을 고수하는 경향이 있으므로 측면을 따라 파이펫을 사용하여 모든 구슬이 재주중단되도록 합니다.</li>
	<li>증착을 위한 습도 챔버를 설치하려면 뚜껑이 약간 남아 있는 벤치에 뚜껑이 있는 6개의 페트리 접시를 뚜껑이 있는 벤치에 놓습니다. 각 접시에서 커버슬립을 열린 영역으로 이동하여 다음 단계에서 습도가 증가할 때 커버립이 환경에 노출되도록 합니다.</li>
	<li>페트리 접시 뒤에 는 히그로미터와 작은 전기 팬을 배치합니다.</li>
	<li>실험실에서 시작 상대 습도(RH)를 기록합니다. 200mL 비커를 150-200mL의 ~75°C 물로 채우고 팬 뒤에 놓습니다.</li>
	<li>팬을 켜고 페트리 접시, 팬, 비커 및 히그로미터를 뒤집고 투명한 플라스틱 저장 용기(66cm x 46cm x 38cm)로 덮습니다.</li>
	<li>챔버의 RH가 일반적으로 5-10 분 소요 70-75 %로 상승하자. 참고: 주변 실험실 RH가 낮으면(~50% 미만)인 경우, 증착 시 습도 의 손실을 보상하기 위해 챔버가 더 높은 RH에 도달하지만 80 % 이상은 없습니다 (아래 참조).</li>
	<li>RH가 70-75%에 도달하면 RH를 기록하고 플라스틱 저장 용기를 약간 들어 올려 페트리 접시에 커버를 빠르게 배치하여 커버립의 과도하게 젖은 것을 방지합니다. 참고: 챔버의 온도는 가습의 결과로 실온, 전형적으로 25-26°C보다 약간 따뜻할 것입니다. 커버립에 습기가 보이면 유리 표면이 너무 젖습니다. 상용 장갑 상자는 프로토콜의 이 부분을 단순화할 수 있습니다.</li>
	<li>챔버의 RH가 계속 상승하여 85%로 상승하게 하십시오. 그 시점에서, 습도 챔버와 피펫 5 μL의 각 커버슬립의 중앙에 RH를 기록한다.</li>
	<li>각 증착 후 챔버와 페트리 접시를 닫아 습도의 손실을 최소화하십시오. 2분 이내에 6개의 기탁을 모두 완료하는 것을 목표로 합니다.</li>
	<li>증착 후 챔버에 RH를 기록합니다. 참고: 증착 후 RH는 증착 중에 습도가 얼마나 빨리 손실되었는지 측정하는 데 도움이 되며, 이는 주변 실험실 조건에 따라 달라집니다. 일반적인 성공적인 실행을 위해, 챔버는 증착 하기 전에 85% RH에서 시작하고 증착 후 70-75% RH에서 끝납니다.</li>
	<li>비드 방울을 5분 동안 퍼지고 건조시키십시오. 참고: 콜로이드 결정이 많은 구멍 이나 다층 영역이 있는 경우, 챔버는 각각 너무 습하거나 건조 가능성이 있었다. 페트리 접시를 닫고 기탁을 시작하는 상대 습도를 조정합니다(최적화에 대한 추가 논의를 위한 결과 섹션 참조).</li>
</ol>3. 콜로이드 크리스탈 템플릿에서 모공 크기를 줄이기위한 비드 어닐링
<ol><li>비드 간 interstices를 좁히고 interstices의 모서리를 반올림 폴리스티렌 구슬의 어닐링에 대한 균일 한 온도 표면을 제공하기 위해, 표준 세라믹 핫 플레이트 위에 평평하고 밀링 알루미늄 접시를 배치합니다.</li>
	<li>핫 플레이트의 온도를 107°C로 설정하이고,폴리스티렌(40)의유리 전이 온도. 참고: 안정적이고 정확한 온도를 얻기 위해 열전대 프로브는 알루미늄 플레이트에 2-3mm 너비와 4-5mm 깊이 구멍으로 고정되었습니다.</li>
	<li>뜨거운 알루미늄 판에 비드 템플릿이 들어 있는 커버슬립과 20s의 음막을 놓습니다(용융 시간에 대한 설명을 위한 토론 섹션 참조).</li>
	<li>가열 후 알루미늄 플레이트에서 덮개 슬립을 제거하고 신속하게 다른 실온 알루미늄 표면에 배치하여 냉각시하십시오. 참고: 커버립이 플레이트 의 가장자리에 약간 걸려 있거나 얕은 채널(첨부 된 비디오 참조)을 접시에 넣고 커버립을 쉽게 픽업하는 것이 도움이됩니다.</li>
</ol>4. 콜로이드 크리스탈 템플릿을 사용하여 알루미늄 제로 모드 도파관의 나노 제작
<ol><li>열 또는 전자 빔 증발 증착을 사용하여, 구슬 사이의 interstices에서 게시물을 생성하기 위해 콜로이드 결정 템플릿 위에 2 Å /s에 구리 의 300 nm를 예금.</li>
	<li>테이프로 표면을 부드럽게 눌러 구슬 위에 과도한 금속을 제거합니다. 테이프를 천천히 벗겨 금속을 벗깁니다. 참고: 테이프를 당긴 후에도 반사 과잉 금속의 일부 작은 패치가 남아 있을 수 있으며, 이는 종종N2 가스의 스트림에 의해 제거될 수 있다. 테이프 당김 후 반사 과잉 금속의 상당한 패치가 남아 있는 경우, 폴리스티렌 구슬을 부분적으로 용해하기 위해 2 시간 동안 톨루엔에 템플릿을 담그십시오. 커버립을 증류수로 씻고 N2로말리고 테이프 풀을 반복합니다. 비드가 테이프를 당기는 동안 기둥을 손상으로부터 보호하는 데 도움이 되기 때문에 비드를 완전히 녹여서는 안 됩니다.</li>
	<li>폴리스티렌 구슬을 녹이려면 비드 템플릿을 톨루엔에 놓고 하룻밤 동안 담가 둡니다. 주의: 톨루엔 연기는 독성이 있을 수 있습니다. 통풍이 잘 되는 후드 아래에서 톨루엔과 함께 작업하고 장갑, 안전 안경 및 실험실 코트를 포함한 개인 보호 장비를 착용하십시오. Toluene은 인화성 액체로 지정된 통풍 캐비닛에 보관해야 합니다.</li>
	<li>톨루엔 인큐베이션 후, 클로로폼으로 한 번, 에탄올로 두 번 템플릿을 헹구는 다. 섬세한 200-300 nm 높이의 금속 기둥이 노출되어 있기 때문에 핸들립은 이 시점에서 조심스럽게 커버합니다. N2로 템플릿을 건조하고 산소 플라즈마 클리너에서 잔류 폴리머 및 오염 물질을 30 분 동안 제거하십시오. 주의: 클로로폼 연기가 독성이 있을 수 있습니다. 통풍이 잘 되는 후드 아래에서 클로로폼을 착용하고 장갑, 안전 안경 및 실험실 코트를 포함한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 클로로폼은 다른 인화성 용매에서 멀리 떨어진 통풍 캐비닛에 보관해야 합니다.</li>
	<li>열 또는 전자 빔 증발 증착을 사용하여 티타늄 접착 층의 3 nm를 1 Å/s로 입금한 다음 구리 기둥 의 4 Å/s 주위와 상단에 100-150 nm의 알루미늄을 보관하십시오. 참고: 두꺼운 클래딩을 사용하여 더 깊은 가이드와 배경 형광의 감쇠를 얻을 수 있지만 다음 단계에서 게시물을 노출하고 용해한 후 수율이 감소합니다(토론 섹션 참조).</li>
	<li>금속 기둥을 용해하려면, 구리 에탄 (구연산 기반)에 커버립을 담그십시오. 재료 의 표) 2 시간 동안. 주의: 금속 에티트는 피부 화상을 일으킬 수 있습니다. 통풍이 잘 되는 후드 아래에서 에트와 함께 작업하고 보호 장비를 착용하십시오. 취급 후 손을 철저히 씻으십시오. 금속 에트트는 부식성 액체로 지정된 통풍 캐비닛에 보관해야 합니다.</li>
	<li>커버립을 증류수로 헹구고N2로말리고, 금속 클래딩 표면을 렌즈 페이퍼로 부드럽게 강화하여 클래딩으로 덮여 있는 게시물을 노출시합니다. 커버립을 구리 에트챈트에 다시 넣고 2h를 더 한 다음 증류수로 다시 헹구고 N2로건조시다. 참고: ZMW 슬라이드는 오염 물질이 없도록 커버되고 깨끗한 페트리 접시에 보관해야 합니다.</li>
</ol>5. 콜로이드 크리스탈 템플릿을 사용하여 금 제로 모드 파도파장의 나노 제작
참고: 알루미늄 ZMW를 제조하는 프로토콜을 반영하는 골드 ZMWs(보충도 1)를제조하는 방법이 이 섹션에서 제공됩니다.
<ol><li>열 또는 전자 빔 증발 증착을 사용하여 티타늄 접착 층의 3 nm를 1 Å/s로 입금한 다음 4 Å/s에서 300nm의 알루미늄을 보관하십시오.</li>
	<li>테이프로 표면을 부드럽게 눌러 구슬 위에 과도한 금속을 제거합니다. 테이프를 천천히 벗겨 금속을 벗깁니다.</li>
	<li>폴리스티렌 구슬을 녹이려면 비드 템플릿을 톨루엔에 놓고 하룻밤 동안 담가 둡니다.</li>
	<li>톨루엔 인큐베이션 후, 클로로폼으로 한 번, 에탄올로 두 번 템플릿을 헹구는 다. N2로 템플릿을 건조하고 산소 플라즈마 클리너에서 잔류 폴리머 오염 물질을 30 분 동안 제거하십시오.</li>
	<li>열 또는 전자 빔 증발 증착을 사용하여 알루미늄 기둥 의 주위에 5 Å / s 주위에 금 100-150 nm를 입금하십시오.</li>
	<li>금속 기둥을 용해하려면 알루미늄 에탕트(인산 계)에 커버립을 담그십시오. 재료 의 표) 1 시간 동안.</li>
	<li>커버립을 증류수로 헹구고N2로말리고, 금속 클래딩 표면을 렌즈 페이퍼로 부드럽게 강화하여 클래딩으로 덮여 있는 게시물을 노출시합니다. 커버립을 알루미늄 에트챈트에 1시간 동안 다시 넣고 증류수로 다시 헹구고 N2로건조시다. 참고: ZMW 슬라이드는 덮여 깨끗한 페트리 접시에 보관해야합니다.</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

콜로이드 자체 조립(프로토콜 섹션 2)의 경우, 서스펜션 용매가 증발 공정을 가속화함에 따라 물 대신 에탄올을 사용하여 이전방법(48,49)과마찬가지로 1-2h가 아닌 증착 후 2-3분 안에 템플릿을 준비한다. 여기에 제시된 증발 침전 프로토콜은 또한서스펜션(49,50,51)의표면 기울기, 온도 및 공기 ?...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/t/61154">Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy</a>. A figure was updated.
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<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

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Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

단일 분자 형광 공명 에너지 전달(smFRET) 또는 단일 분자 형광 상관 분광법(FCS)과 같은 단일 분자 기술은 분자 생물물리학을 위한 강력한 도구로,전사1,2,3,번역4,5,6,기타 7, 기타 7과 같은 공정에서 개별 생체 분자의 동적 움직임, 적합성 및 상호 작용의 연구를 가능하게한다. smFRET의 경우, 많은 테더드 분자가 시간이 지남에 따라 추적될 수 있기 때문에 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경 검사는 일반적인 방법이며, TIR에 의해 생성된 에반센드 파는 커버슬립8에인접한 100-200 nm 영역으로 제한된다. 그러나, 이러한 포주 부피에 대한 제한에도 불구하고, 배경 형광9위의 단일 분자 신호를 검출하기 위해서는 여전히 pM 또는 nM 범위로 희석되어야 한다. 세포 효소의 Michaelis-Menten 상수는 전형적으로 mM 범위10에μM에 있기 때문에, 단일 분자 연구에서 생화확적인 반응은 일반적으로 세포에 있는 것보다 훨씬 느립니다. 예를 들어, 단백질 합성은 대장균11,12에서초당 15-20 아미노산에서 발생하며, 대부분의 대장균 리보솜은 스모트 실험에서 초당 0.1-1아미노산으로 변환된다 13. 단백질 합성에서, 정체된 리보좀에 대한 결정 구조 및 smFRET는 tRNA-mRNA 전좌 단계14,15이전에 '하이브리드'와 '고전적인' 상태 사이에서 전송 RNA(tRNAs)가 변동하는 것으로 나타났다. 그러나, 전좌 GTPase 인자, EF-G의 생리적 농도가 존재했을 때, 하이브리드와 고전 국가 사이의 상이한 형태, 중간, smFRET6에서관찰되었다. 세포에 있는 것과 유사한 비율 그리고 농도에 동적 분자 프로세스를 공부하는 것은 중요합니다, 그러나 기술적인 도전남아 있습니다.
형광 기판 농도를 증가시키는 전략은 제로 모드 파도어(ZMWs)라고 불리는 금속 계의 가시파장 조리개를 사용하여 조리개 내에서 국소화된 생체 분자를 선택적으로 자극하는 제한된 흥분 장을 생성하는 것이다(그림1). 조리개는 일반적으로 직경 100-200 nm, 깊이17에서100-150 nm입니다. 우물의 크기 및 형상과 관련된 컷오프 파장(λc≈ 유전체매체(18)로물을 가진 원형 도파관의 직경은 2.3배≈) 전파 모드가 도파관에 허용되지 않으므로, 따라서 용어 제로 모드 파도가이드. 그러나 진동하는 전자기장은 에반센드 파라고 불리는, 강도가 기하급수적으로 부패하면서도파선(18,19)으로짧은 거리를 터널링한다. TIR 에반센센트 파도와 유사하지만, ZMW 에반센센트 파도는 부패 상수를 가지며, 그 결과 도파관 내에서 10-30 nm 유효 여기 영역이 생성됩니다. 형광 으로 표지된 리간드의 미세 몰라 농도에서, 단지 하나 또는 몇몇 분자는 흥분 지역 안에 동시에 존재합니다. 흥분 부피의 이 제한 및 배경 형광의 결과적인 감소는 생물학으로 관련있는 농도에서 단 하나 분자의 형광 화상 진찰을 가능하게 합니다. 이는 단일 단백질확산(21)의FCS 측정, 저친화성 리간드단백질(22)및 단백질 단백질상호작용(23)의 단일 분자 FRET 측정, 단일 분자 회전율이벤트(24)의분광-전기화학적 측정을 포함한 많은 시스템에 적용되었다.
ZMW는 이온 빔 밀링25,26 또는 전자 빔 리소그래피(EBL)를 사용하여 금속 층을 직접 패터닝한 다음 플라즈마 에칭16,27로생산되었다. 이러한 마스크리스소그래피 방법은 일련의 파관을 생성하고 일반적으로 ZMW 기술의 광범위한 채택을 방지하여 특수 나노 제조 시설에 대한 액세스가 필요합니다. 또 다른 방법, 자외선 나노 임프린트 리소그래피 리프트 오프(28)는석영 슬라이드 금형을 사용하여 스탬프와 같은 저항 필름에 역 ZMW 템플릿을 누릅니다. 이 방법은 더 간소화되어 있지만 석영 금형을 제작하기 위해서는 EBL이 필요합니다. 이 문서에서는 EBL 또는 이온 빔 밀링을 필요로 하지 않으며 소각 마스크를 형성하기 위해 나노스피어의 밀착 포장을 기반으로 하는 간단하고 저렴한 템플릿 제작 방법에 대한 프로토콜을 제시합니다.
1982년 Deckman과 Dunsmuir29,30에의해 처음 제안된 나노스피어 또는 "천연" 리소그래피는 수십 나노미터에서 수십 마이크로미터31에이르는 모노분산 콜로이드 입자의 자체 조립을 사용하여 에칭 및/또는 재료의 증착을 통한 표면 패터닝을 위한 템플릿을 만듭니다. 콜로이드 결정이라고 불리는 콜로이드 입자의 2차원(2D) 또는 3차원(3D) 확장된 주기적인 배열은 산란 및배절(32)으로부터의밝은 무지개빛 물질을 특징으로 한다. 전자 빔이나 포토리스그래피보다 덜 널리 사용되지만 이 마스킹 방법론은 간단하고 저렴한 비용으로 쉽게 축소되어 100 nm 미만의 피처 크기를 만듭니다.
콜로이드 입자의 자체 조립을 지시하는 것은 곡성 결정을 표면 패터닝을 위한 마스크로 사용하는 성공을 결정합니다. 입자의 크기와 모양이 균일한 경우, 콜로이드 입자는 엔트로피고갈기(33)에 의해 구동되는 육각형포장으로 쉽게 자체 조립될 수 있다. 낙하 코팅 후 의 수분 증발은 콜로이드 입자를 침전하는 효과적인 경로이지만, 다른 방법은 딥 코팅(34,스핀 코팅35,전기 지질 증착36)및 공기 물 인터페이스(37)에서통합을 포함한다. 아래에 제시된 프로토콜은 가장 간단한 증발 침전 방법을 기반으로 합니다. 삼각형은 희생 금속을 플레이트하는 개구부를 형성하여 구멍을 형성하는 개구부를 형성한다(그림2 및 보충 도 1). 이 단계 전에 구슬의 간략한 어닐링은 이러한 게시물의 모양과 직경을 조정합니다. 구슬이 제거되고 최종 금속 층이 게시물 주위에 증착된 다음 게시물이 제거됩니다. 콜로이드 나노 마스크에 두 개의 금속 증착 단계 후, 중간 기둥의 제거, 통과 및 테더링을위한 표면 화학 수정, ZMW 어레이는 단일 분자 이미징에 사용할 준비가되어 있습니다. 제조 후 ZMW 광학 특성의 보다 광범위한 특성화는 함께 제공되는 제38에서찾을 수 있다. 금속의 증기 증착을 위한 열 증발기 외에 특수 공구가 필요하지 않습니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;1. Glass Coverslip Cleaning&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma</td><td>32201</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Coplin glass staining jar</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-817</td><td>Staining jar with 8 grooves and molded glass cover</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>VWR</td><td>48404-467</td><td>24 mm x 30 mm (No.1&amp;frac12;, Rectangular)</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>1 L</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>30603</td><td>Potassium hydroxide</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>R80115TS</td><td>100 mm diameter, 15 mm deep</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td>Z245143</td><td>Tabletop ultrasonic cleaner, 5510</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clear storage container</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-110-8222</td><td>26 x 18 x 15 in.</td></tr><tr><td>Desk fan</td><td>O2Cool</td><td>FD05001A</td><td>Any small desk (~5 in.) fan will work</td></tr><tr><td>Glass beaker</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-555-25B</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>Humidity meter</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-661-19</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-402-903</td><td>1.5 mL</td></tr><tr><td>Polystyrene microspheres</td><td>Polysciences</td><td>18602-15</td><td>1.00 &amp;micro;m diameter, non-functionalized</td></tr><tr><td>Triton X-100 deturgent</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aluminum plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA11062RY</td><td>Customized in-house to 14 cm x 14 cm</td></tr><tr><td>Ceramic hotplate</td><td>Fisher Scientific</td><td>HP88857100</td><td>13 x 8.2 x 3.8 in.</td></tr><tr><td>Temperature controller</td><td>McMaster-Carr</td><td>38615K71</td><td>Read temperature with thermocouple probe</td></tr><tr><td>Thermocouple probe</td><td>McMaster-Carr</td><td>9251T93</td><td>Type K, surface probe</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aluminum etchant</td><td>Transene</td><td>Type A</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum pellets</td><td>Kurt J. Lesker</td><td>EVMAL40QXHB</td><td>For electron beam evaporation</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>288306</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Copper etchant</td><td>Transene</td><td>49-1</td><td></td></tr><tr><td>Copper pellets</td><td>Kurt J. Lesker</td><td>EVMCU40QXQA</td><td>For electron beam evaporation</td></tr><tr><td>Gold pellets</td><td>Kurt J. Lesker</td><td>EVMAUXX40G</td><td>For electron beam evaporation</td></tr><tr><td>Lens paper</td><td>Thorlabs</td><td>MC-5</td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Scotch tape</td><td>Staples</td><td>MMM119</td><td></td></tr><tr><td>Thin film deposition system</td><td>Kurt J. Lesker</td><td>PVD-75</td><td>Tabletop thermal evaporation system will also work</td></tr><tr><td>Titanium pellets</td><td>Kurt J. Lesker</td><td>EVMTI45QXQA</td><td>For electron beam evaporation</td></tr><tr><td>Toluene</td><td>Sigma</td><td>244511</td><td>1 L</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Representative Results&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>COMSOL Multiphysics Modeling Software</td><td>COMSOL, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dual View spectral splitter</td><td>Photometrics, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fabrication of zero mode waveguides for high concentration single molecule microscopy

단일 분자 형광 효소학에서, 용액에 표지된 기판에서 배경 형광은 수시로 피코- 나노 몰라 범위에 형광포 농도를 제한하고, 많은 생리적인 리간드 농도 보다는 크기의 몇몇 순서. 알루미늄이나 금과 같은 얇은 전도 금속으로 제작된 직경 100-200 nm의 제로 모드 도파관(ZMWs)이라고 불리는 광학 나노 구조는 가시광선 내분을 제프토리터 유효 볼륨에 국한하여 형광 농도의 미세 모름 농도에서 개별 분자의 이미징을 허용합니다. 그러나, 고가의 특수 나노 제조 장비에 대한 필요성은 ZMWs의 광범위한 사용을 배제하고있다. 여기서, 콜로이드, 또는 나노권, 리소그래피는 와도파 제작을 위한 나노미터 규모의 마스크를 만드는 대안 전략으로 이용됩니다. 이 보고서는 각 단계에 대한 실질적인 고려 사항과 함께 접근 방식을 자세히 설명합니다. 이 방법을 통해 수천 개의 알루미늄 또는 골드 ZMW를 병렬로 만들 수 있으며 최종 파도어 직경과 깊이는 100-200 nm입니다. 금속 증착을 위한 일반적인 실험실 장비와 열 증발기만 필요합니다. ZMWs가 생화학 적 커뮤니티에 더 쉽게 접근 할 수 있도록함으로써,이 방법은 세포 농도 및 비율에 분자 과정의 연구를 용이하게 할 수 있습니다.

증발 침전(steps 2.1−2.13)을 통한 폴리스티렌 콜로이드 입자의 자체 조립은 용매 증발속도를 제어해야 하기 때문에 다양한 결과를 생성할 수 있다. 그러나 기탁이 빠르기 때문에(라운드당 10-15분), 절차는 다양한 주변 실험실 조건에 맞게 신속하게 최적화될 수 있습니다. 도 3A증착 및 증발 후 잘 형성된 콜로이드 템플릿을 나타낸다. 매크로, 구슬의 영역은 원형, 비드의 불투명?...

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Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

여기에 설명된 나노피어 리소그래피 방법은 형광구의 나노-마이크로몰라 농도에서 단일 분자 이미징을 위한 금속 입은 유리 현미경 커버슬립에서 나노 개구체의 배열인 제로 모드 파휘도의 병렬 제작을 위한 나노스피어 리소그래피 방법입니다. 이 방법은 콜로이드 크리스탈 자체 어셈블리를 활용하여 도파관 템플릿을 만듭니다.

고농도 단일 분자 현미경 검사용 제로 모드 파도가이드 제조

In single molecule fluorescence enzymology, background fluorescence from labeled substrates in solution often limits fluorophore concentration to pico- to ...

fabrication-zero-mode-waveguides-for-high-concentration-single

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.9K 조회수.  University of Pennsylvania. 여기에 설명된 나노피어 리소그래피 방법은 형광구의 나노-마이크로몰라 농도에서 단일 분자 이미징을 위한 금속 입은 유리 현미경 커버슬립에서 나노 개구체의 배열인 제로 모드 파휘도의 병렬 제작을 위한 나노스피어 리소그래피 방법입니다. 이 방법은 콜로이드 크리스탈 자체 어셈블리를 활용하여 도파관 템플릿을 만듭니다.

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Fabrication of Silica Ultra High Quality Factor Microresonators

Whispering gallery resonant cavities confine light in circular orbits at their periphery.1-2 The photon storage lifetime in the cavity, quantified by the quality factor (Q) of the cavity, can be in excess of 500ns for cavities with Q factors above 100 million. As a result of their low material losses, silica microcavities have demonstrated some of the longest photon lifetimes to date1-2. Since a portion of the circulating light extends outside the resonator, these devices can also be used to probe the surroundings. This interaction has enabled numerous experiments in biology, such as single molecule biodetection and antibody-antigen kinetics, as well as discoveries in other fields, such as development of ultra-low-threshold microlasers, characterization of thin films, and cavity quantum electrodynamics studies.3-7
The two primary silica resonant cavity geometries are the microsphere and the microtoroid. Both devices rely on a carbon dioxide laser reflow step to achieve their ultra-high-Q factors (Q&gt;100 million).1-2,8-9 However, there are several notable differences between the two structures. Silica microspheres are free-standing, supported by a single optical fiber, whereas silica microtoroids can be fabricated on a silicon wafer in large arrays using a combination of lithography and etching steps. These differences influence which device is optimal for a given experiment.
Here, we present detailed fabrication protocols for both types of resonant cavities. While the fabrication of microsphere resonant cavities is fairly straightforward, the fabrication of microtoroid resonant cavities requires additional specialized equipment and facilities (cleanroom). Therefore, this additional requirement may also influence which device is selected for a given experiment.
Introduction
An optical resonator efficiently confines light at specific wavelengths, known as the resonant wavelengths of the device. 1-2 The common figure of merit for these optical resonators is the quality factor or Q. This term describes the photon lifetime (&tau;o) within the resonator, which is directly related to the resonator's optical losses. Therefore, an optical resonator with a high Q factor has low optical losses, long photon lifetimes, and very low photon decay rates (1/&tau;o). As a result of the long photon lifetimes, it is possible to build-up extremely large circulating optical field intensities in these devices. This very unique property has allowed these devices to be used as laser sources and integrated biosensors.10
A unique sub-class of resonators is the whispering gallery mode optical microcavity. In these devices, the light is confined in circular orbits at the periphery. Therefore, the field is not completely confined within the device, but evanesces into the environment. Whispering gallery mode optical cavities have demonstrated some of the highest quality factors of any optical resonant cavity to date.9,11 Therefore, these devices are used throughout science and engineering, including in fundamental physics studies and in telecommunications as well as in biodetection experiments. 3-7,12
Optical microcavities can be fabricated from a wide range of materials and in a wide variety of geometries. A few examples include silica and silicon microtoroids, silicon, silicon nitride, and silica microdisks, micropillars, and silica and polymer microrings.13-17 The range in quality factor (Q) varies as dramatically as the geometry. Although both geometry and high Q are important considerations in any field, in many applications, there is far greater leverage in boosting device performance through Q enhancement. Among the numerous options detailed previously, the silica microsphere and the silica microtoroid resonator have achieved some of the highest Q factors to date.1,9 Additionally, as a result of the extremely low optical loss of silica from the visible through the near-IR, both microspheres and microtoroids are able to maintain their Q factors over a wide range of testing wavelengths.18 Finally, because silica is inherently biocompatible, it is routinely used in biodetection experiments.
In addition to high material absorption, there are several other potential loss mechanisms, including surface roughness, radiation loss, and contamination loss.2 Through an optimization of the device size, it is possible to eliminate radiation losses, which arise from poor optical field confinement within the device. Similarly, by storing a device in an appropriately clean environment, contamination of the surface can be minimized. Therefore, in addition to material loss, surface scattering is the primary loss mechanism of concern.2,8
In silica devices, surface scattering is minimized by using a laser reflow technique, which melts the silica through surface tension induced reflow. While spherical optical resonators have been studied for many years, it is only with recent advances in fabrication technologies that researchers been able to fabricate high quality silica optical toroidal microresonators (Q&gt;100 million) on a silicon substrate, thus paving the way for integration with microfluidics.1
The present series of protocols details how to fabricate both silica microsphere and microtoroid resonant cavities. While silica microsphere resonant cavities are well-established, microtoroid resonant cavities were only recently invented.1 As many of the fundamental methods used to fabricate the microsphere are also used in the more complex microtoroid fabrication procedure, by including both in a single protocol it will enable researchers to more easily trouble-shoot their experiments.

We describe the use of a carbon dioxide laser reflow technique to fabricate silica resonant cavities, including free-standing microspheres and on-chip microtoroids. The reflow method removes surface imperfections, allowing long photon lifetimes within both devices. The resulting devices have ultra high quality factors, enabling applications ranging from telecommunications to biodetection.

실리카 초고 품질 팩터 Microresonators의 제작

Whispering gallery resonant cavities confine light in circular orbits at their periphery.1-2 The photon storage lifetime in the cavity, quantified by the ...

연구

공학

Terahertz Microfluidic Sensing Using a Parallel-plate Waveguide Sensor

Refractive index (RI) sensing is a powerful noninvasive and label-free sensing technique for the identification, detection and monitoring of microfluidic samples with a wide range of possible sensor designs such as interferometers and resonators 1,2. Most of the existing RI sensing applications focus on biological materials in aqueous solutions in visible and IR frequencies, such as DNA hybridization and genome sequencing. At terahertz frequencies, applications include quality control, monitoring of industrial processes and sensing and detection applications involving nonpolar materials.
Several potential designs for refractive index sensors in the terahertz regime exist, including photonic crystal waveguides 3, asymmetric split-ring resonators 4, and photonic band gap structures integrated into parallel-plate waveguides 5. Many of these designs are based on optical resonators such as rings or cavities. The resonant frequencies of these structures are dependent on the refractive index of the material in or around the resonator. By monitoring the shifts in resonant frequency the refractive index of a sample can be accurately measured and this in turn can be used to identify a material, monitor contamination or dilution, etc.
The sensor design we use here is based on a simple parallel-plate waveguide 6,7. A rectangular groove machined into one face acts as a resonant cavity (Figures 1 and 2). When terahertz radiation is coupled into the waveguide and propagates in the lowest-order transverse-electric (TE1) mode, the result is a single strong resonant feature with a tunable resonant frequency that is dependent on the geometry of the groove 6,8. This groove can be filled with nonpolar liquid microfluidic samples which cause a shift in the observed resonant frequency that depends on the amount of liquid in the groove and its refractive index 9.
Our technique has an advantage over other terahertz techniques in its simplicity, both in fabrication and implementation, since the procedure can be accomplished with standard laboratory equipment without the need for a clean room or any special fabrication or experimental techniques. It can also be easily expanded to multichannel operation by the incorporation of multiple grooves 10. In this video we will describe our complete experimental procedure, from the design of the sensor to the data analysis and determination of the sample refractive index.

The procedure for implementing a refractive index sensor for terahertz frequencies based on a grooved parallel-plate waveguide geometry is described here. The method yields a measurement of the refractive index of a small volume of liquid through monitoring of the shift in the resonant frequency of the waveguide structure

병렬 판 도파관 센서를 사용하여 Terahertz 마이크로 감지

Refractive index (RI) sensing is a powerful noninvasive and label-free sensing technique for the identification, detection and monitoring of microfluidic ...

Fabrication And Characterization Of Photonic Crystal Slow Light Waveguides And Cavities

Slow light has been one of the hot topics in the photonics community in the past decade, generating great interest both from a fundamental point of view and for its considerable potential for practical applications. Slow light photonic crystal waveguides, in particular, have played a major part and have been successfully employed for delaying optical signals1-4 and the enhancement of both linear5-7 and nonlinear devices.8-11
Photonic crystal cavities achieve similar effects to that of slow light waveguides, but over a reduced band-width. These cavities offer high Q-factor/volume ratio, for the realization of optically12 and electrically13 pumped ultra-low threshold lasers and the enhancement of nonlinear effects.14-16 Furthermore, passive filters17 and modulators18-19 have been demonstrated, exhibiting ultra-narrow line-width, high free-spectral range and record values of low energy consumption.
To attain these exciting results, a robust repeatable fabrication protocol must be developed. In this paper we take an in-depth look at our fabrication protocol which employs electron-beam lithography for the definition of photonic crystal patterns and uses wet and dry etching techniques. Our optimised fabrication recipe results in photonic crystals that do not suffer from vertical asymmetry and exhibit very good edge-wall roughness. We discuss the results of varying the etching parameters and the detrimental effects that they can have on a device, leading to a diagnostic route that can be taken to identify and eliminate similar issues.
The key to evaluating slow light waveguides is the passive characterization of transmission and group index spectra. Various methods have been reported, most notably resolving the Fabry-Perot fringes of the transmission spectrum20-21 and interferometric techniques.22-25 Here, we describe a direct, broadband measurement technique combining spectral interferometry with Fourier transform analysis.26 Our method stands out for its simplicity and power, as we can characterise a bare photonic crystal with access waveguides, without need for on-chip interference components, and the setup only consists of a Mach-Zehnder interferometer, with no need for moving parts and delay scans.
When characterising photonic crystal cavities, techniques involving internal sources21 or external waveguides directly coupled to the cavity27 impact on the performance of the cavity itself, thereby distorting the measurement. Here, we describe a novel and non-intrusive technique that makes use of a cross-polarised probe beam and is known as resonant scattering (RS), where the probe is coupled out-of plane into the cavity through an objective. The technique was first demonstrated by McCutcheon et al.28 and further developed by Galli et al.29

Use of photonic crystal slow light waveguides and cavities has been widely adopted by the photonics community in many differing applications. Therefore fabrication and characterization of these devices are of great interest. This paper outlines our fabrication technique and two optical characterization methods, namely: interferometric (waveguides) and resonant scattering (cavities).

광자 크리스탈 느린 경 Waveguides 그리고 안의 공간의 제조 및 특성

Slow light has been one of the hot topics in the photonics community in the past decade, generating great interest both from a fundamental point of view ...

Synthesis and Operation of Fluorescent-core Microcavities for Refractometric Sensing

This paper discusses fluorescent core microcavity-based sensors that can operate in a microfluidic analysis setup. These structures are based on the formation of a fluorescent quantum-dot (QD) coating on the channel surface of a conventional microcapillary. Silicon QDs are especially attractive for this application, owing in part to their negligible toxicity compared to the II-VI and II-VI compound QDs, which are legislatively controlled substances in many countries. While the ensemble emission spectrum is broad and featureless, an Si-QD film on the channel wall of a capillary features a set of sharp, narrow peaks in the fluorescence spectrum, corresponding to the electromagnetic resonances for light trapped within the film. The peak wavelength of these resonances is sensitive to the external medium, thus permitting the device to function as a refractometric sensor in which the QDs never come into physical contact with the analyte. The experimental methods associated with the fabrication of the fluorescent-core microcapillaries are discussed in detail, as well as the analysis methods. Finally, a comparison is made between these structures and the more widely investigated liquid-core optical ring resonators, in terms of microfluidic sensing capabilities.

Fluorescent-core microcavity sensors employ a high-index quantum-dot coating in the channel of silica microcapillaries. Changes in the refractive index of fluids pumped into the capillary channel cause shifts in the microcavity fluorescence spectrum that can be used to analyze the channel medium.

Refractometric 감지 용 형광 코어 Microcavities의 합성 및 운영

This paper discusses  fluorescent core microcavity-based sensors that can operate in a microfluidic  analysis setup. These structures are based on the ...

Fabrication, Operation and Flow Visualization in Surface-acoustic-wave-driven Acoustic-counterflow Microfluidics

Surface acoustic waves (SAWs) can be used to drive liquids in portable microfluidic chips via the acoustic counterflow phenomenon. In this video we present the fabrication protocol for a multilayered SAW acoustic counterflow device. The device is fabricated starting from a lithium niobate (LN) substrate onto which two interdigital transducers (IDTs) and appropriate markers are patterned. A polydimethylsiloxane (PDMS) channel cast on an SU8 master mold is finally bonded on the patterned substrate. Following the fabrication procedure, we show the techniques that allow the characterization and operation of the acoustic counterflow device in order to pump fluids through the PDMS channel grid. We finally present the procedure to visualize liquid flow in the channels. The protocol is used to show on-chip fluid pumping under different flow regimes such as laminar flow and more complicated dynamics characterized by vortices and particle accumulation domains.

In this video we first describe fabrication and operation procedures of a surface acoustic wave (SAW) acoustic counterflow device. We then demonstrate an experimental setup that allows for both qualitative flow visualization and quantitative analysis of complex flows within the SAW pumping device.

Surface acoustic waves (SAWs) can be used to drive liquids in portable microfluidic chips via the acoustic counterflow phenomenon. In this video we ...

Implementation of a Reference Interferometer for Nanodetection

A thermally and mechanically stabilized fiber interferometer suited for examining ultra-high quality factor microcavities is fashioned. After assessing its free spectral range (FSR), the module is put in parallel with a fiber taper-microcavity system and then calibrated through isolating and eliminating random shifts in the laser frequency (i.e. laser jitter noise). To realize the taper-microcavity junction and to maximize the optical power that is transferred to the resonator, a single-mode optical fiber waveguide is pulled. Solutions containing polystyrene nanobeads are then prepared and flown to the microcavity in order to demonstrate the system&#8217;s ability to sense binding to the surface of the microcavity. Data is post-processed via adaptive curve fitting, which allows for high-resolution measurements of the quality factor as well as the plotting of time-dependent parameters, such as resonant wavelength and split frequency shifts. By carefully inspecting steps in the time-domain response and shifting in the frequency-domain response, this instrument can quantify discrete binding events.

A reference interferometer technique, which is designed to remove undesirable laser jitter noise for nanodetection, is utilized for probing an ultra-high quality factor microcavity. Instructions for assembly, setup, and data acquisition are provided, alongside the measurement process for specifying the cavity quality factor.

Nanodetection에 대한 참조 간섭계의 구현

A thermally and mechanically stabilized fiber interferometer suited for examining ultra-high quality factor microcavities is fashioned. After assessing ...

Stimulated Stokes and Antistokes Raman Scattering in Microspherical Whispering Gallery Mode Resonators

Dielectric microspheres can confine light and sound for a length of time through high quality factor whispering gallery modes (WGM). Glass microspheres can be thought as a store of energy with a huge variety of applications: compact laser sources, highly sensitive biochemical sensors and nonlinear phenomena. A protocol for the fabrication of both the microspheres and coupling system is given. The couplers described here are tapered fibers. Efficient generation of nonlinear phenomena related to third order optical non-linear susceptibility &#935;(3) interactions in triply resonant silica microspheres is presented in this paper. The interactions here reported are: Stimulated Raman Scattering (SRS), and four wave mixing processes comprising Stimulated Anti-stokes Raman Scattering (SARS). A proof of the cavity-enhanced phenomenon is given by the lack of correlation among the pump, signal and idler: a resonant mode has to exist in order to obtain the pair of signal and idler. In the case of hyperparametric oscillations (four wave mixing and stimulated anti-stokes Raman scattering), the modes must fulfill the energy and momentum conservation and, last but not least, have a good spatial overlap.

Efficient generation of nonlinear phenomena related to third order optical non-linear susceptibility &#935;(3) interactions in triply resonant silica microspheres is presented in this paper. The interactions here reported are: Stimulated Raman Scattering (SRS), and four wave mixing processes comprising Stimulated Anti-stokes Raman Scattering (SARS).

Microspherical 위스퍼 링 갤러리 모드 공진기에 자극 스톡스와 Antistokes 라만 산란

Dielectric microspheres can confine light and sound for a length of time through high quality factor whispering gallery modes (WGM). Glass microspheres ...

Fabrication of 1-D Photonic Crystal Cavity on a Nanofiber Using Femtosecond Laser-induced Ablation

We present a protocol for fabricating 1-D Photonic Crystal (PhC) cavities on subwavelength-diameter tapered optical fibers, optical nanofibers, using femtosecond laser-induced ablation. We show that thousands of periodic nano-craters are fabricated on an optical nanofiber by irradiating with just a single femtosecond laser pulse. For a typical sample, periodic nano-craters with a period of 350 nm and with diameter gradually varying from 50 - 250 nm over a length of 1 mm are fabricated on a nanofiber with diameter around 450 - 550 nm. A key aspect of such a nanofabrication is that the nanofiber itself acts as a cylindrical lens and focuses the femtosecond laser beam on its shadow surface. Moreover, the single-shot fabrication makes it immune to mechanical instabilities and other fabrication imperfections. Such periodic nano-craters on nanofiber, act as a 1-D PhC and enable strong and broadband reflection while maintaining the high transmission out of the stopband. We also present a method to control the profile of the nano-crater array to fabricate apodized and defect-induced PhC cavities on the nanofiber. The strong confinement of the field, both transverse and longitudinal, in the nanofiber-based PhC cavities and the efficient integration to the fiber networks, may open new possibilities for nanophotonic applications and quantum information science.

We present a protocol for fabricating 1-D photonic crystal cavities on subwavelength diameter silica fibers (optical nanofibers) using femtosecond laser-induced ablation.

펨토초 레이저에 의한 절제를 사용하여 나노 섬유에 1-D 광자 크리스탈 캐비티의 제작

We present a protocol for fabricating 1-D Photonic Crystal (PhC) cavities on subwavelength-diameter tapered optical fibers, optical nanofibers, using ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced contrast due to optical sectioning. The conventional approach is to use high numerical aperture microscope TIRF objectives for both excitation and collection, severely limiting the field of view and throughput. We present a novel approach to generating TIRF excitation for imaging with optical waveguides, called chip-based nanoscopy. The aim of this protocol is to demonstrate how chip-based imaging is performed in an already built setup. The main advantage of chip-based nanoscopy is that the excitation and collection pathways are decoupled. Imaging can then be done with a low magnification lens, resulting in large field of view TIRF images, at the price of a small reduction in resolution. Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) were imaged using direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM), showing a resolution comparable to traditional super-resolution microscopes. In addition, we demonstrate the high-throughput capabilities by imaging a 500 &#181;m x 500 &#181;m region with a low magnification lens, providing a resolution of 76 nm. Through its compact character, chip-based imaging can be retrofitted into most common microscopes and can be combined with other on-chip optical techniques, such as on-chip sensing, spectroscopy, optical trapping, etc. The technique is thus ideally suited for high throughput 2D super-resolution imaging, but also offers great opportunities for multi-modal analysis.

Chip-based super-resolution optical microscopy is a novel approach to fluorescence microscopy and offers advantages in cost effectiveness and throughput. Here, the protocols for chip preparation and imaging are shown for TIRF microscopy and localization-based super-resolution microscopy.

포토닉 칩을 사용한 고처리량 총 내부 반사 형광 및 직접 적층 광학 재건 현미경

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

생화학

Fabrication of Refractive-index-matched Devices for Biomedical Microfluidics

The use of microfluidic devices has emerged as a defining tool for biomedical applications. When combined with modern microscopy techniques, these devices can be implemented as part of a robust platform capable of making simultaneous complementary measurements. The primary challenge created by the combination of these two techniques is the mismatch in refractive index between the materials traditionally used to make microfluidic devices and the aqueous solutions typically used in biomedicine. This mismatch can create optical artifacts near the channel or device edges. One solution is to reduce the refractive index of the material used to fabricate the device by using a fluorinated polymer such as MY133-V2000 whose refractive index is similar to that of water (n = 1.33). Here, the construction of a microfluidic device made out of MY133-V2000 using soft lithography techniques is demonstrated, using O2 plasma in conjunction with an acrylic holder to increase the adhesion between the MY133-V2000 fabricated device and the polydimethylsiloxane (PDMS) substrate. The device is then tested by incubating it filled with cell culture media for 24 h to demonstrate the ability of the device to maintain cell culture conditions during the course of a typical imaging experiment. Finally, quantitative phase microscopy (QPM) is used to measure the distribution of mass within the live adherent cells in the microchannel. This way, the increased precision, enabled by fabricating the device from a low index of refraction polymer such as MY133-V2000 in lieu of traditional soft lithography materials such as PDMS, is demonstrated. Overall, this approach for fabricating microfluidic devices can be readily integrated into existing soft lithography workflows in order to reduce optical artifacts and increase measurement precision.

This protocol describes the fabrication of microfluidic devices from MY133-V2000 to eliminate artifacts that often arise in microchannels due to the mismatching refractive indices between microchannel structures and an aqueous solution. This protocol uses an acrylic holder to compress the encapsulated device, improving adhesion both chemically and mechanically.

생물 의학 마이크로 대 한 굴절 인덱스 일치 장치 제조

The use of microfluidic devices has emerged as a defining tool for biomedical applications. When combined with modern microscopy techniques, these devices ...