Burada sunduğumuz şey, prometafazda senkronize edilmiş hücrelerde canlı hücre dönen disk konfokal görüntülemekullanarak mikrotübül dinamiklerini analiz etmek için sağlam ve basit bir yöntemdir ve görüntüler daha sonra MATLAB tabanlı bir platformda analiz edilir. Dönen disk mikroskobu ile birlikte kırmızı-shifted floresan protein kullanımı fototoksisiteyi azaltır. Bu nedenle, daha fazla sayıda hücre aynı hazırlık içinde görüntülenebilir.
Mikrotübül dinamiği çok sayıda patolojik koşullarda değiştirilir. Bu nedenle, bu süreçlerde mikrotübül dinamiğinin düzenlenmesini ve davranışını anlamak, hastalığın mekanizmasını anlamamıza ve sonunda bunları telafi edecek tedaviler geliştirmemize yardımcı olabilir. Ve yöntem de ölçeklenebilir, bu yüzden potansiyel bir ilaç keşif çabası uygulanabilir.
Yöntem floresan desynchronization protokolü değiştirerek ve hücre döngüsünün farklı aşamalarından hücreleri elde değiştirerek değiştirilebilir. Bu mikrotübüller karşı ilaç tarama ve bölen ve bölünmeyen hücreler üzerinde kusur tespit yararlı olabilir. Her hücre tipi için transfeksiyon protokolünü ve tohumlama yoğunluğunu optimize etmek gerekir.
EB3 ifade düzeyi, tek büyüyen mikrotübülleri tespit etmek için düşük olmalıdır. DPBS'de eşzamanlı olarak büyüyen HeLa hücrelerini durulayarak başlayın, sonra onları 37 derecede beş dakika boyunca tripsin-EDTA ile kuluçkaya yatırın. RPMI-1640 orta ekleyerek tripsinizasyon durdurun 10% ısı inaktive FCS ile üç-bir oranda, eklenen trypsin-EDTA.
El yazması yönlere göre hücrelerin konsantrasyonu hesaplayın ve hazırlanmış, odacıklı coverslip her kuyuiçine 50.000 hücre tohum. Kapak sıvısını kuvöze geri getirin ve hücreleri 24 saat boyunca 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle büyütün. Ertesi gün, kuvözhücreleri çıkarın ve damla akıllıca her kuyuya transfeksiyon karışımı 100 mikrolitre ekleyin.
Hücreleri kuvöze geri döndürün ve dört saatlik kuluçkadan sonra hücreleri taze ortamla tamamlar ve ayrıca 20 saat kuluçkaya yatırın. Fenol kırmızısı serbest DMEM dimetilenastron veya DME 2.5 mikromol çözeltisi hazırlayın, ile birlikte 10%FCS ve iki milimolar L-glutamin. Odacıklı kapaktaki büyüme ortamını DME büyüme ortamıyla değiştirin ve hücreleri kuvöze geri verin.
3,5 saatlik kuluçkadan sonra, hücreleri mikroskopa aktarın ve odacıklı örtüyü 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit olarak belirlenen bir çevre odasına monte edin ve görüntüleme için koyu paneller ile. Sonra toplam dört saat kuluçkaya devam edin. 100X, 1.49 sayısal diyafram açıklığı, yağ daldırma hedefi, çift disk konfokal sistemi ve güvenilir bir otomatik odaklama sistemi ile ters bir mikroskop üzerinde zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirin.
Metin makalesinde açıklandığı gibi görüntüleme parametrelerini tanımlayın. Profazda bir hücre bulun ve monopolar mitotik milin merkezine karşılık gelen Z düzlemine odaklanın. Ardından her 5 saniyede bir, toplam bir dakikadan fazla, hiçbir binning ve pozlama arasında aydınlatma olmadan görüntü elde edin.
Sayısal analiz yazılımını yükleyerek ve komut penceresinden film seçici GUI adı verilen yazılım arama yoluna u-track V2.2.0 klasörünü ekleyerek başlayın. Ardından görüntü edinme yazılımı tarafından oluşturulan ham dosyaları içe aktarın. Hedefin sayısal diyafram açıklığını ve görüntüleme için kullanılan zaman aralığını manuel olarak girin.
Tüm görüntüler yüklendikten sonra, film listesi olarak kaydet'i ve diyalog penceresinin sağ tarafındaki u-track seçeneğini seçerek girilen zaman atlamalı diziyi film olarak kaydedin. Açılır menüden mikrotübül artı uçları seçin ve çözümlemenin üç adımının parametrelerini belirlemek için yeni bir diyalog penceresi açan tamam'ı tıklatın. Birinci adım için ayarlara tıklayın ve açılan menüden kuyruklu yıldız algılamasını seçin.
Makalede açıklandığı gibi Gaussian filtresi ve havza segmentasyonu arasındaki parametreleri tanımlayın. Ardından tüm filmlere uygula ayarlarını seçin ve uygula'yı tıklatın. İkinci adım için, mikrotübül artı uç dinamiklerini seçin ve metin el yazmasına göre bağlama, boşluk kapatma, birleştirme ve bölme ve Kalman filtre işlevleri değerlerini tanımlamak için ayar seçeneklerini kullanın.
Boyutsallıkla ilgili sorunlar için açılır menüden iki tane seçin ve kapatmak için maksimum boşluğun kapanması için beş kare ve ilk adımdan itibaren en az parça kesimi uzunluğu için üç kare kullanın. Daha önce olduğu gibi, tüm filmlere uygula ayarlarını seçin ve uygula'yı tıklatın. Üçüncü adım için, parça analizi yöntemi olarak mikrotübül dinamiği sınıflandırmasını seçin ve parametreleri ayar düğmesi aracılığıyla tanımlayın.
Filmin başındave sonundaki parçaları kaldırmak için kutuları seçin ve istatistik histogramları yapın. Açılan listeden, ileri boşluktan önce iki veya üç kare ve sırasıyla ileri ve geri yeniden sınıflandırma için ileri ve geri hız dağılımının yüzde 95'ini kullanarak seçin. Tüm parametreler tanımlandıktan sonra, tüm filmlere onay/çek uygula'yı seçin ve kontrol bölmeleri u-track penceresinden tüm film kutularını çalıştırın ve ardından çalıştır'a basın.
Film işleme tamamlandıktan sonra bir ileti görüntülenir. pEB3-tdTomato plazmid geçici HeLa hücrelerinde ifade edildi. Hücreler DME tedavisi ile senkronize edildi.
Mikrotübül büyümesinin zaman atlamalı filmleri analiz edildi ve ortaya çıkan büyüme hızı ve dinamiklik çizildi. Maksimum boşluk uzunluğu ve maksimum büzülme faktörü gibi çözümlemesi etkilemek için açıklanan parametreler, aynı zaman atlamalı film kümesi için değiştirildi. Büyüme hızı ve dinamiklik karşılık gelen değerleri hesaplandı.
Ortaya çıkan büyüme hızı önemli ölçüde etkilenmezken, maksimum boşluk uzunluğu değiştirildiğinde dinamiklik farklıydı. Her üç durumda da mikrotübül alt parçalarının saptanması benzerdi, ancak maksimum boşluk uzunluğu 15'e ayarlandığında tam MT yörüngelerinin yeniden yapılandırılması çoğunlukla etkilenmiştir. Görüntüleme koşullarının mikrotübül davranışına müdahale edip etmediğini değerlendirmek için zaman atlamalı serinin birinci ve ikinci yarısı ayrı ayrı analiz edilmiş ve buna karşılık gelen büyüme hızı ve dinamiklik karşılaştırılmıştı.
Beklendiği gibi, önemli bir fark saptadı. Bu akılda tutulması önemlidir, hücreler prometafaz senkronize olduğundan, mikrotübül yoğunluğu çok yüksektir. Bu nedenle, farklı mikrotübül yanlış tanımlamak için değil, çok dikkatli bir şekilde analiz parametrelerini ayarlamak zorunda.
Bu yöntemle mikrotübül dinamiğinin ölçülmesi, diğer biyolojik hedeflerin doğrudan, dolaylı olarak mikrotübüllerin düzenlenmesi çalışmaları ile karşılaştırılabilir.
