We like to thank the members of the Dogterom lab for valuable discussions. We acknowledge Stefan Diez and Marcel Janson for reagents, and Samara Reck-Peterson for help with the purification of dynein. This work was supported by funding from the European Research Council (ERC Synergy grant: MODEL-CELL).

<ol>
	<li>Kotak, S., Gonczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+spindle+positioning:+cortical+force+generators+in+the+limelight.">Mechanisms of spindle positioning: cortical force generators in the limelight.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 741-748 (2013).</li><li>Williams, S. E., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oriented+divisions,+fate+decisions.">Oriented divisions, fate decisions.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 749-758 (2013).</li><li>Tanenbaum, M. E., Medema, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+centrosome+separation+and+bipolar+spindle+assembly.">Mechanisms of centrosome separation and bipolar spindle assembly.</a> Dev Cell. 19, 797-806 (2010).</li><li>Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+force+generators+and+chromosome+segregation.">Mitotic force generators and chromosome segregation.</a> Cell Mol Life Sci. 67 (13), 2231-2250 (2010).</li><li>Faivre-Moskalenko, C., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+microtubule+asters+in+microfabricated+chambers:+the+role+of+catastrophes.">Dynamics of microtubule asters in microfabricated chambers: the role of catastrophes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (26), 16788-16793 (2002).</li><li>Janson, M. E., de Dood, M. E., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubules+is+regulated+by+force.">Dynamic instability of microtubules is regulated by force.</a> J Cell Biol. 161 (6), 1029-1034 (2003).</li><li>Laan, L., Husson, J., Munteanu, E. L., Kerssemakers, J. W., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-generation+and+dynamic+instability+of+microtubule+bundles.">Force-generation and dynamic instability of microtubule bundles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8920-8925 (2008).</li><li>Laan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+dynein+controls+microtubule+dynamics+to+generate+pulling+forces+that+position+microtubule+asters.">Cortical dynein controls microtubule dynamics to generate pulling forces that position microtubule asters.</a> Cell. 148 (3), 502-514 (2012).</li><li>Dogterom, M., Yurke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+the+force-velocity+relation+for+growing+microtubules.">Measurement of the force-velocity relation for growing microtubules.</a> Science. 278 (5339), 856-860 (1997).</li><li>Cytrynbaum, E. N., Scholey, J. M., Mogilner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+force+balance+model+of+early+spindle+pole+separation+in+Drosophila+embryos.">A force balance model of early spindle pole separation in Drosophila embryos.</a> Biophys J. 84 (2 Pt 1), 757-769 (2003).</li><li>Kozlowski, C., Srayko, M., Nedelec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+microtubule+contacts+position+the+spindle+in+C.+elegans+embryos.">Cortical microtubule contacts position the spindle in C. elegans embryos.</a> Cell. 129 (3), 499-510 (2007).</li><li>Carminati, J. L., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+orient+the+mitotic+spindle+in+yeast+through+dynein-dependent+interactions+with+the+cell+cortex.">Microtubules orient the mitotic spindle in yeast through dynein-dependent interactions with the cell cortex.</a> J Cell Biol. 138 (3), 629-641 (1997).</li><li>Nguyen-Ngoc, T., Afshar, K., Gonczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+cortical+dynein+and+G+alpha+proteins+mediates+spindle+positioning+in+Caenorhabditis+elegans.">Coupling of cortical dynein and G alpha proteins mediates spindle positioning in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Cell Biol. 9 (11), 1294-1302 (2007).</li><li>Moore, J. K., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+mitosis+with+cell+polarity:+Molecular+motors+at+the+cell+cortex.">Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex.</a> Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).</li><li>Grishchuk, E. L., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+production+by+disassembling+microtubules.">Force production by disassembling microtubules.</a> Nature. 438 (7066), 384-388 (2005).</li><li>Toba, S., Watanabe, T. M., Yamaguchi-Okimoto, L., Toyoshima, Y. Y., Higuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+hand-over-hand+mechanism+of+single+molecular+motility+of+cytoplasmic+dynein.">Overlapping hand-over-hand mechanism of single molecular motility of cytoplasmic dynein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (15), 5741-5745 (2006).</li><li>Ten Hoopen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+for+astral+microtubule+capture+by+cortical+Bud6p+priming+spindle+polarity+in+S.+cerevisiae.">Mechanism for astral microtubule capture by cortical Bud6p priming spindle polarity in S. cerevisiae.</a> Curr Biol. 22 (12), 1075-1083 (2012).</li><li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bipolar+mitotic+kinesin+Eg5+moves+on+both+microtubules+that+it+crosslinks.">The bipolar mitotic kinesin Eg5 moves on both microtubules that it crosslinks.</a> Nature. 435 (7038), 114-118 (2005).</li><li>van den Wildenberg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homotetrameric+kinesin-5+KLP61F+preferentially+crosslinks+microtubules+into+antiparallel+orientations.">The homotetrameric kinesin-5 KLP61F preferentially crosslinks microtubules into antiparallel orientations.</a> Curr Biol. 18 (23), 1860-1864 (2008).</li><li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+cross-linking+triggers+the+directional+motility+of+kinesin-5.">Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5.</a> J Cell Biol. 182 (3), 421-428 (2008).</li><li>Ferenz, N. P., Gable, A., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+functions+of+kinesin-5.">Mitotic functions of kinesin-5.</a> Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 255-259 (2010).</li><li>Schuyler, S. C., Liu, J. Y., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+function+of+Ase1p:+evidence+for+a+MAP-dependent+midzone-specific+spindle+matrix.+Microtubule-associated+proteins.">The molecular function of Ase1p: evidence for a MAP-dependent midzone-specific spindle matrix. Microtubule-associated proteins.</a> J Cell Biol. 160 (4), 517-528 (2003).</li><li>Loiodice, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ase1p+organizes+antiparallel+microtubule+arrays+during+interphase+and+mitosis+in+fission+yeast.">Ase1p organizes antiparallel microtubule arrays during interphase and mitosis in fission yeast.</a> Mol Biol Cell. 16 (4), 1756-1768 (2005).</li><li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-driven+multimerization+recruits+ase1p+onto+overlapping+microtubules.">Microtubule-driven multimerization recruits ase1p onto overlapping microtubules.</a> Curr Biol. 18 (21), 1713-1717 (2008).</li><li>Janson, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosslinkers+and+motors+organize+dynamic+microtubules+to+form+stable+bipolar+arrays+in+fission+yeast.">Crosslinkers and motors organize dynamic microtubules to form stable bipolar arrays in fission yeast.</a> Cell. 128 (2), 357-368 (2007).</li><li>Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+minimal+midzone+protein+module+controls+formation+and+length+of+antiparallel+microtubule+overlaps.">A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps.</a> Cell. 142 (3), 420-432 (2010).</li><li>Mollinari, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRC1+is+a+microtubule+binding+and+bundling+protein+essential+to+maintain+the+mitotic+spindle+midzone.">PRC1 is a microtubule binding and bundling protein essential to maintain the mitotic spindle midzone.</a> J Cell Biol. 157 (7), 1175-1186 (2002).</li><li>Braun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+braking+by+Ase1+prevents+overlapping+microtubules+from+sliding+completely+apart.">Adaptive braking by Ase1 prevents overlapping microtubules from sliding completely apart.</a> Nat Cell Biol. 13 (10), 1259-1264 (2011).</li><li>Lansky, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusible+crosslinkers+generate+directed+forces+in+microtubule+networks.">Diffusible crosslinkers generate directed forces in microtubule networks.</a> Cell. 160 (6), 1159-1168 (2015).</li><li>Yamashita, A., Sato, M., Fujita, A., Yamamoto, M., Toda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+fission+yeast+ase1+in+mitotic+cell+division,+meiotic+nuclear+oscillation,+and+cytokinesis+checkpoint+signaling.">The roles of fission yeast ase1 in mitotic cell division, meiotic nuclear oscillation, and cytokinesis checkpoint signaling.</a> Mol Biol Cell. 16 (3), 1378-1395 (2005).</li><li>Roth, S., Laan, L., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+cortical+Dynein+function.">Reconstitution of cortical Dynein function.</a> Methods Enzymol. 540, 205-230 (2014).</li><li>Moudjou, M., Bornens, M., Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+of+centrosome+isolation+from+cultured+animal+cells.">Method of centrosome isolation from cultured animal cells.</a> Cell Biology: A laboratory handbook. 2, 111-119 (1998).</li><li>Reck-Peterson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+dynein+processivity+and+stepping+behavior.">Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior.</a> Cell. 126 (2), 335-348 (2006).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Lancaster, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+rounding+alters+cell+geometry+to+ensure+efficient+bipolar+spindle+formation.">Mitotic rounding alters cell geometry to ensure efficient bipolar spindle formation.</a> Dev Cell. 25 (3), 270-283 (2013).</li><li>Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+volume+modulates+spindle+size+during+embryogenesis.">Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis.</a> Science. 342 (6160), 856-860 (2013).</li><li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin+and+streptavidin.">Avidin and streptavidin.</a> Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).</li><li>Moore, W., Zhang, C., Clarke, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+RCC1+to+chromosomes+is+required+for+proper+mitotic+spindle+assembly+in+human+cells.">Targeting of RCC1 to chromosomes is required for proper mitotic spindle assembly in human cells.</a> Curr Biol. 12 (16), 1442-1447 (2002).</li><li>Akiyoshi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+directly+stabilizes+reconstituted+kinetochore-microtubule+attachments.">Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments.</a> Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).</li><li>Lawrimore, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+loops+generate+intracentromere+tension+in+mitosis.">DNA loops generate intracentromere tension in mitosis.</a> J Cell Biol. 210 (4), 553-564 (2015).</li><li>Minc, N., Burgess, D., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cell+geometry+on+division-plane+positioning.">Influence of cell geometry on division-plane positioning.</a> Cell. 144 (3), 414-426 (2011).</li><li>Taberner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+systems+for+the+study+of+microtubule-based+cell+polarity+in+fission+yeast.">In vitro systems for the study of microtubule-based cell polarity in fission yeast.</a> Methods Cell Biol. 128, 1-22 (2015).</li><li>Boukellal, H., Selimovic, S., Jia, Y., Cristobal, G., Fraden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+robust+storage+of+drops+and+fluids+in+a+microfluidic+device.">Simple robust storage of drops and fluids in a microfluidic device.</a> Lab Chip. 9 (2), 331-338 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

yöntemleri su içinde yağ emülsiyonu damlacıkları temel mitotik iğ sulandırmak için burada mevcut son çabaları anlattı. geometrik sınırları içinde mili takımını okuyan birçok avantaj sağlamaktadır. Önemli geribildirim mekanizmaları mitotik iğin mikrotübüllerin ve monte edildiği geometrik kısıtlamaları arasında var. Mikrotübülüsler onlar mitotik iğ yerinden neden olabilir geometrik sınırları içine büyüyünce kuvvetleri itme üretebilir. Buna ek olarak, fiziksel bir engel büyüyen mikrotübül felaketler neden olabilir. Ayrıca, dar bir geometriye olan aks takımı da doğrudan mikrotübül büyüme oranı 36 etki gibi tübülin müstakil bileşenler, kademeli bir tükenmesine neden olabilir. Bunlar burada tarif edilen deneyler kullanılarak ele alınabilir mili montaj tüm temel belirleyicileri vardır. tarif edilen deneyler, küçük bir konsantrasyon differe çok duyarlıdırDamlacık bileşenleri nces. Bu küçük konsantrasyon farklılıkları ya da çok yavaş ya da çok hızlı bir mikrotübül büyümesiyle sonuçlanır tubulin, için de geçerlidir. Bu durumda, mikrotübül büyüme oranları genellikle de Deneyin birinci ~ 30 dakika boyunca sıcaklığı ayarlanarak düzeltilebilir. Mitotik iğ takımı ve yerleştirilmesi de (kortikal) kuvveti jeneratör konsantrasyonundaki değişikliklere çok hassastır. Bu temizlenmiş bileşenlerin konsantrasyonu, saflık ve aktivitesine bağlıdır olasıdır ve her yeni saflaştırılmış protein için dikkatle takip edilmesi gerekmektedir. Buna ek olarak, belirli bir dengeler tahlilin doğasına bağlı olarak, görüntüleme ayarlarında yapılmalıdır. Başlangıçta, çözünür floresan tübülin dimerleri yüksek seviyede görüntü bireysel mikrotübüllere güçleştirmektedir. mikrotübüller uzun büyümek ve çözünür tübülin yavaş yavaş tükenmiş gibi, sinyal-gürültü oranı giderek yüksek olur ve individu görüntülenmesine olanak tanımaktadıral mikrotübülüsler. Açık sistemlerde kurulumları aksine, geometrik sınırlandırıcı önemli bir ağartma sonuçlanan bir kütle rezervuar içinde floresan moleküller ve oksijen temizleme sistemi bileşenlerinin alışverişini önler. Özellikle, zaman içinde mili montaj ve yerleştirme kontrolü için, bu da güçlü bir oksijen tutucu sisteminin varlığında, düşük ışık yoğunlukları ile görüntü için gereklidir. Bu yöntemler in vitro basitleştirilmiş aks-benzeri yapıların aşağıdan yukarı sulandırma sağlar. Burada tanıtılan bileşenlere ek olarak, diğer birçok faktöre vb 3 çift kutuplu spiralin teşekkülünün, konumlandırma, yönlendirme, şekillendirme, etkilemek için tarif edilmiştir. Bu sistem ayrıca ilave kuvvet jeneratörler bireysel ve kombine etkilerini incelemek için genişletilebilir. Bu sistem şu anda bulunmadığına iğ oluşumuna önemli katkıda mitotik kromozom vardır. Mitotik kromatin gösterilmiştir&#39;polar-çıkarma kuvvetleri&#39; 3, (2) kromatin bağlı RanGEF RCC1 38 tarafından RanGTP degrade oluşumu, (3) kinetokorlar (depolimerizasyon ile etkileşimde bulunabilirsiniz sözde meydana getirebilirler (1) chromokinesins doğrudan mili oluşumu ) mikrotübüller 39 ve (4) karşıt mikrotübüllerin 40 arasında-mekanik bir yay gibi işlev görebilir kromatin kendisi. Son olarak, açıklanan sistem şu anda sınırlı zamansal ve mekansal aktivite üzerinde kontrol ve tanıtılan kuvvet jeneratörlerin lokalizasyonu sağlar. hücrelerinde, bir çok mil takımı faktörler, belirli bölümlerinde lokalize veya sınırlı bir zaman aralığı içinde etkilidir. Çarpıcı bir örnek özellikle C arka tarafında zenginleştirilmiş dinein aktivitesi olduğunu elegans tek hücreli aşamada embriyo asimetrik iğ konumlandırma ve hücre bölünmesini teşvik etmek. Bu sistemde, şu anda böyle bir t taklit olasılığını araştırıyoropto genetik tekniklerle ödünç emporal ve asimetrik aktivite kullanarak yöntemleri. Buna ek olarak, aynı C için geçerlidir elegans embriyo ve sert hücre duvarı ile hücreler, birçok hücre mitoz kadar yuvarlak değil. Geometrik hapsi şekli miline 41 üzerinde etkili kuvvetlerin üzerinde temel bir etkiye sahip olacaktır. Nedenle potansiyel olarak şekillendirme ve emülsiyon depolanması 42,43 damlacıkları izin daha karmaşık mikroakışkan sistemleri kullanarak, hem de küresel olmayan damlacıkları mili montaj ve konumlandırma sulandırmak için önemli olacaktır. Son olarak, doku, hücre-hücre ve hücre-alt-tabaka sinyal ve bağlantı genellikle epitel hücrelerinde olduğu gibi, yönlendirilmiş mili yönünde çevrilebilir dış işaretlere sağlar ve kök hücreleri. Bu özel tüm yönleriyle bu çalışmada dikkate alınmamıştır ve mitotik iğ assemb in vivo benzeri daha reconstitutions doğru inşa etmek için gelecek zorlukları sağlayabilirly ve konumlandırma.

mitoz sırasında, çoğaltılan genom kromozomları yeni kurulan kızı hücreleri üzerinde kardeş kromozomlardalerde eşit dağılımını sağlamak için hücre ekvatorda düzenlenmektedir. Kromozom konumlandırma ve segregasyon iki karşıt sentrozom kaynaklanan mili mikrotübül onların eki aracılık eder. Sadık kromozom dağılımı sağlamanın yanı sıra, mitotik iğ yönü de hücre bölünmesi uçağı 1 belirler. Hücre bölünmesinin koordine yönlendirme gelişimi birçok aşamaları sırasında ve doku homeostazında 2 için gereklidir. Özellikle, düzenlenen mitotik iğ konumlandırma hücresel içeriği asimetrik dağılımı neden olabilir, hatta farklı boyutlarda 2 kızı hücrelerini üretirler. Mitotik iğ montaj ve oryantasyon profaz başlar ve işbirliği ve kuvvet-jeneratörler 3,4 karşısına arasındaki karmaşık bir etkileşim tarafından orkestra edildiği. kuvvetlerin b oluşuroth çekme ve itme kuvvetleri. Bu kuvvetler, hücre korteks ile iş mili kontaklar olarak silindirin içinde hem de üretildiği ve mikrotübül dinamiklerine göre yanı sıra moleküler motorlar ve çapraz bağlayıcıların (Şekil 1) tarafından oluşturulmuş olabilir. mikrotübülüsler hücre korteks gibi sert yapılara karşı büyüyünce Pushing kuvvetleri oluşturulabilir. Sistem içinde üretilen toplam direnç kuvveti bağlı olarak, bu mitotik iğ (düşük güçler) yeniden konumlandırılması ile sonuçlanabilir veya mikrotübül burkulma veya felaket (yüksek kuvvetler) 5-8 tetikleyebilir. Uzunluğu 9 mikrotübül burkulma güçlü bir belirleyici olduğu iterek oluşturulabilir kuvvetin miktarı, mikrotübül uzunluğuna bağlıdır. Buna ek olarak, tek bir sentrozom kaynaklanan mikrotübüller diğer sentrozom karşı erken profaz 3,10 içinde sentrozom ayırmanın gerçekleştirilmesi için öne sürülmüştür bir mekanizma itebilir. Reklamdabüyüyen mikrotübül tarafından oluşturulan kuvvetleri itme, mikrotübül temas biter hücre korteksine koşul da güçleri 11 çekerek arabuluculuk yapabilirsiniz. Birden laboratuvarların Çalışmalar kortikal kuvvet jeneratör kontrollü aktivite vivo 1 mitotik iğ asimetrik konumlandırma için gerekli olduğunu göstermiştir. Bu çekme kuvveti için gerekli (bundan böyle &#39;dinein &quot;olarak adlandırılır) korteks lokalize sitoplazmik dinein, eksi uç yönlendirilmiş mikrotübül motor proteinlerinden 8,12,13 olup. Örneğin, maya, korteks 14 boyunca kayar motora bağlı mikrotübül mikrotübül kafes sonucu kortikal dinein yanal etkileşimleri tomurcuklanmasına. Ancak, kortikal çekme kuvvetleri de Mikrotübülleri 8 depolimerizasyon için son ekleri oluşturmak için dinein yeteneği ile oluşturulabilir. Mikrotübül büzülme tarafından üretilen enerji genellikle daha yüksek büyüklükte bir sipariş kuvvetler yol açabilir (~ 50 pN (15 referans </syukarı&gt;)) bireysel motorlu proteinler tarafından oluşturulan kuvvetler daha (~ 7-8 pN (ref. 16)). Depolimerizasyon mikrotübül kortikal dinein sonu-on eki tomurcuklanan maya 17 ve C mili konumlandırma teşvik elegans 13. Motor bağımlı kayma ve mikrotübül depolimerizasyon tahrik hem kortikal çekme kuvvetleri işbirliği ya da in vivo birbirini dışlayan olup olmadığını mevcut bilinmeyen yer almaktadır. mikrotübül itme kuvvetleri ve dinein aracılı kortikal çekme kuvveti ek olarak, sentrozom konumlandırma çok sayıda başka proteinlerle mitotik iğ içinden kontrol edilir. Kinesin-5 motorlar, örneğin, dışarı doğru kayar kuvvetleri 18-20 üretimi ile sonuçlanan, antiparalel interpolar mikrotübülleri bağlantı çapraz tetramerler olarak mevcuttur. Kinesin-5 Motor ailesinin üyeleri C haricinde, incelenen tüm ökaryotlarda sentrozom ayırma ve çift kutuplu spiralin montaj için gerekli olan elegans<html> (referans 21 gözden). Ayrıca, ASE1 / PRC1 ailesinin yayılabilir çapraz bağlayıcılar de in vivo ve in vitro 22-27 interpolar mikrotübül mikrotübül bölgelerinin üst üste lokalize edilmesi için bilinmektedir. Örtüşen mikrotübül bölgenin ASE1 odaklı genleşme kuvvetlerin vitro 28,29 bölgesindeki kinesin-14 aracılı sürme kuvvetleri dengelemek için yeterince büyüktür. Hücrelerde, ASE1 / PRC1, mil orta sonda 25-27,30 mikrotübül bölgeleri üst üste yayılabilir çapraz bağlayıcılar tarafından oluşturulan kuvvetleri önemli derecede mili düzenlenmesine katkıda düşündüren kararlı oluşumu için gereklidir. Son olarak, mitoz kromatin gelen kuvvetler ve kinetokorlar çeşitli yollar 3 ile mitotik iğ montaj ve konumlandırma etkilemektedir. Bu bileşenler Burada tarif edilen sulandırma deneyleri parçası olmadığından, bunlar ayrıntılı olarak ele alınmayacaktır. jove_content &quot;&gt; Farklı teoriler yukarıda açıklanan farklı moleküler bileşenleri ve kuvvetler iğ montaj ve konumlandırma işbirliği nasıl var, ancak biz niceliksel bir anlayış hala uzağız. Buna ek olarak deneylere canlı hücrelerde, saflaştırılmış bileşenler ile in vitro deneyler güçlü sağlamak rota Bu hedefe ulaşmak için. Burada, temel iğ su-içinde-yağ emülsiyonu damlacıkları içinde yeniden edildiği en son yayınlanan yöntemlerin adapte edilmiş ve genişletilmiş versiyonu (Roth et al. 31), bir görsel bir kılavuz mevcut bulunduklarında, bir ile başlayan mikroakışkan teknikler kullanılarak bileşenleri minimum sayısıdır., küresel damlacıklar mitotik hücre karşılaştırılabilir boyutlarda oluşturulacak. bu damlacıklar içinde, saflaştırılmış sentrozom ve tübülin, mikrotübül aster dinamikleri üzerinde çalışmak üretimi ve aster-aster etkileşimleri zorlamak için birleştirilebilir. tarafından kortikal (örneğin dinein gibi) ve inter-polar (örneğin kinesin-5 / ASE1) kuvvet jeneratörler tanıtan, bizin vivo durumu benzemeye başlar giderek karmaşık mili benzeri yapılar sulandırmak.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;1. Preparation of microfluidic chips&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photomask (Photomask on film substrate)</td><td>Selba S.A. Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3025</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicon wafer (4 inch silicon wafer p/Boron &amp;lt;1-0-0&gt;10-20 &amp;Omega;-cm, 500-550 &amp;mu;m, SSP, with 2 flats)</td><td>WRS Materials</td><td>4P0SSP-005</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater&amp;nbsp;</td><td>Polos</td><td>SPIN150I</td><td></td></tr><tr><td>PDMS pre-polymer RVT615 A+B</td><td>Lubribond</td><td>9481</td><td></td></tr><tr><td>Corona treater</td><td>Electro-technic products</td><td>BD-20ACV</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2. Microfluidic setup&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840035</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl))</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870285</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650498</td><td></td></tr><tr><td>Glass pipets</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vacuum pump</td><td>Laboport</td><td>KNF</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum chamber</td><td>Kartell</td><td>Polypropylene Vacuum Desiccator</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Surfactant (Span80)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85548</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td>M2800H</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td></td><td></td><td>24 mm x 60 mm, thickness 1.5</td></tr><tr><td>Glass-slides</td><td></td><td></td><td>26 mm x 76 mm</td></tr><tr><td>Puncher</td><td>Harris Uni-Core</td><td>135840/135841/135843</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory sealing film</td><td>Parafilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Valap (Vaseline, lanolin, paraffin wax melted at equal concentrations)</td><td></td><td></td><td>Home made</td></tr><tr><td>Brightfield Microscope</td><td>Leica</td><td>PMIRB&amp;nbsp;</td><td>Any inverted brightfield would suffice</td></tr><tr><td>Pressure controler</td><td>Fluigent</td><td>MFCS-FLEX-4C-1000</td><td></td></tr><tr><td>PEEK Tubing</td><td>Cluzeau Info. Labo, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfluidics vials (Tubes Micrew 0.5 ml and 1 ml)</td><td>VWR, The Netherlands</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;3. Reconstituting spindle formation and positioning&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Dextran-647 nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10,000 MW, Anionic, Fixable)</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA - Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose (D-(+)-Glucose)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Glucose-oxidase (Glucose oxidase from Aspergillus niger)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6125</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-dithioltheitol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Catalase (Catalase form bovine liver)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>Tubulin (Tubulin from bovine brain)</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubulin-488/561 (HiLyte-488/Rhodamine-labeled tubulin from porcine brain)</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GTP (Guanosine-&#039;5-triphosphate, sodium salt hydrate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>&amp;kappa;-casein (&amp;kappa;-casein from bovine serum milk)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0406</td><td></td></tr><tr><td>Airfuge (Air-driven ultracentrifuge)</td><td>Beckman-Coulter</td><td>CLS</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;4. Introducing spindle-assembly factors&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>ATP (Adenosine-&#039;5-triphosphate, disodium salt hydrate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monosodium salt hydrate &amp;ge;97% (enzymatic))</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0564</td><td></td></tr><tr><td>PK/LDH -(Pyruvate kinase/lactic dehydrogenase enzymes from rabbit muscle)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0294</td><td></td></tr></tbody></table>

reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and cross-linkers. Growing microtubules can generate pushing forces, while depolymerizing microtubules can convert the energy from microtubule shrinkage into pulling forces, when attached, for example, to cortical dynein or chromosomes. In addition, motor proteins and diffusible cross-linkers within the spindle contribute to spindle architecture by connecting and sliding anti-parallel microtubules. In vivo, it has proven difficult to unravel the relative contribution of individual players to the overall balance of forces. Here we present the methods that we recently developed in our efforts to reconstitute basic mitotic spindles bottom-up in vitro. Using microfluidic techniques, centrosomes and tubulin are encapsulated in water-in-oil emulsion droplets, leading to the formation of geometrically confined (double) microtubule asters. By additionally introducing cortically anchored dynein, plus-end directed microtubule motors and diffusible cross-linkers, this system is used to reconstitute spindle-like structures. The methods presented here provide a starting point for reconstitution of more complete mitotic spindles, allowing for a detailed study of the contribution of each individual component, and for obtaining an integrated quantitative view of the force-balance within the mitotic spindle.

Önceki bölümlerde sunulan yöntemler su-içinde-yağ emülsiyonu damlacıklarının geometrik tutulmasını kullanılarak karmaşıklığı arttıkça aks-benzeri yapıların tekrar oluşturulmasını sağlar. Bu bölümde niteliksel bu tahlillerin yeteneği gösteren temsili sonuçlarını açıklar. Bir çift kutuplu spiralin monte edildiğinde, mitoz sırasında, hücreler insan hücreleri için ölçülen yaklaşık 15 um bir çapı olan küreler oluşturmak için yuvarlak. Bu özellik mitotik hücre şekil kısıtlar hem iğ boyutunu ve yönlendirmesini 35,36 yönlendiren bir geometrik sınır sağlar. Mikroakışkan teknikleri, doğru canlı hücrelerde gözlenen durumun benzer ve bu nedenle in vitro mitotik iğ aşağıdan yukarıya yeniden izin geometrik hapsi düzeyi sağlamak. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-mikrotübül büyümesi geometrik sınırlarla kısıtlı olduğunda sayfa = &quot;1&quot;&gt; Mikrotubul asters zaten kendileri tarafından karmaşık davranış yeteneğine sahiptirler. mikrotübül büyüdükçe, yeni, tubulin dimerlerinden eklenmesi ile oluşturulan itme kuvvetleri emülsiyon damlacıklarının yanları iki sentrozom sürücü. İlk başta, sentrozomlar serbestçe sınırlı hacim (Şekil 4a, sol panel) içinde yaygın. yaklaşık 20-30 dakika sonra, ilk mikrotübül mikrotübül her yöne korteks karşı büyüdükçe görünür ve sentrozom difüzyon sınırlı olur olur. ara madde uzunlukta (damlacık çapının yaklaşık% 50) mikrotubul Asters (sterik) ve diğer sentrozom korteks birbirlerine karşı itme mikrotübüller ile birlikte, her biri başka bir dağılmasına neden olabilir. Bu birbirine (Şekil 4a, orta panel) karşıt iki sentrozom tipik bir &#39;bipolar&#39; iğ gibi düzenleme ile sonuçlanır. mikrotübül damlacık-dia ~% 50 daha uzun büyüyüncemetre, sentrozomlar damlacık korteks (Şekil 4a, sağ panel) boyunca büyüyen mikrotübül ile damlacık karşıt sınırları daha da itti olsun. Deneylerde mikrotübül büyüme oranları, sıcaklık ve tübülin konsantrasyonlarında hem çok hassas olduğunu not etmek önemlidir. çekirdeklenme ilk gözlendiğinde ve kararlı durum aster pozisyonları ulaşıldığında Bu parametreler, bu nedenle güçlü süresini etkiler. hücrelerde, kortikal çekme kuvvetleri mikrotübül artı sonları ve korteks ile ilişkili dinein arasındaki yük taşıyan ekleri oluşumu yoluyla oluşturulur. Hayvan hücrelerinde, bu ilişki Gαi 1 N-terminal miristoilasyon ile plazma membranına hedeflenen Gαi / LGN / numa kompleksi bağlıdır. Bu yeniden yapılanma tahlillerde, Gαi / LGN / numa kompleksinin gereksinimi doğrudan aracılığıyla biyotinile lipidler için dynein birleştirilmesi suretiyle atlanırbiyotin-streptavidin-biyotin kompleksleri oluşumu. Bu bağlar nispeten sabit (Kd ~ 10 -14 M) 37 ve hızla meydana (genellikle mikrotübül çekirdeklenme belirgin hale gelmeden önce, bir emülsiyon damlacık oluşumundan sonra, 10 dakika içinde) (Şekil 4b). Dinein yokluğunda, sentrozom damlacık korteks (Şekil 4c) karşıt kenarlarına itilir ise kortikal dinein mevcudiyetinde, sentrozom tipik haliyle, daha merkezi olarak korurlar. Biz Bunu önlemek ve mikrotübül iterek kuvvetleri karşı iki etkinin sonucudur muhakeme. (1) Dinein doğrudan mikrotübül felaketleri, böylece mikrotübül uzunluğu kısıtlayan ve aşırı mikrotübül burkulma önlenmesi ve (2) kortikal çekme kuvvetleri aster-aster itme kuvvetleri karşı bireysel asters 8, net merkezleme kuvvetlerine yol teşvik etmektedir. ASE1 f indükleyen yayılabilir çapraz bağlayıcıeğilimi orces anti-paralel mikrotübüllerin 29 örtüşen bölgeyi artırmak için. Bununla uyumlu olarak, (dinein ve yokluğu) ASE1 varlığında sentrozomlar ASE1 interpolar Mikrotübülleri (Şekil 4d) birlikte için lokalize ile birbirine yakın bulunmuştur. kinesin-5 aile fertleri (giriş bölümüne bakınız) mili içinden iterek güçleri sağlayarak sentrozom ayrımı sürücü. Cut7 (S. pombe kinesin-5 ortolog) varlığında, sentrozom da ASE1 (Şekil 4e) varlığında, emülsiyon damlacıklarının karşıt taraflarında itilir. kortikal ve inter-polar kuvvet jeneratörleri birleştirerek, karmaşıklık düzeyi daha nihayetinde bipolar mitotik iğ düzeneğinin kapsamlı bir anlayış neden bu deneylerde artırılabilir. Bu sonuçların detaylı niceliksel açıklamalar, gelecekte var olacak (Roth ve ark., Lığa). <p class="jove_content" fo:keep-together.within sayfa = &quot;1&quot;&gt; zaman içinde sabit anlarda sentrozom konumuna dikkat ve mikrotübül gözlenen uzunlukları davranışlarını ilgili ek olarak, değerli bilgiler üzerinden konumlandırma işlemi uygulayarak elde edilebilir zaman. etki süreleri ve lazer yoğunlukları azaltarak, sadece ~% 30 ağartılması ile en az 1 saat boyunca 2 dakikalık aralıklarla aster konumlandırma takip etmek mümkündür. Bu merkezi aracılığıyla serbestçe difüzyon sentrozom gelen aster montaj ve konumlandırma izleme (0 dak.) Izin verir (12 dk.) Ademi asters (36 dk ve daha fazla) (Şekil 5c) için. Bu kararlı hal davranışı ve mili montaj kinetik hem de çalışma kolaylaştırır. Aynı numunedeki farklı içeriklerle damlacıkların birleştirerek, örneğin, mümkün olan doğrudan (Şekil 5B) ve kortikal güç jeneratörleri olmayan damlacıklar halinde sentrozom konumlandırma ve mil düzeneği kinetiğinin karşılaştırılması vardır. Şekil 1: Kuvvetler Mitotik Mil üzerinde hareket Çeşitli kuvvet üreten moleküller iğ oluşumunu ve konumlandırma teşvik etmek için mitotik milin mikrotübüller hareket.. Hücre korteks içine büyümeye mikrotübül sentrozom bir itme kuvveti oluşturur. (Mor) Kortikal dinein depolimerizasyon mikrotübülleri yakalar ve sentrozom üzerine bir çekme kuvveti oluşturur. PRC1 / ASE1 ailesinin çapraz bağlayıcılar bir kuvvet sürgülü dışa karşı oluşturmak ise mili içinde, kinesin-5 / Cut7 motor proteinler, anti-paralel mikrotübüller üzerinde dışa doğru kayar kuvveti sağlamak. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54278/54278fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için tıklayınız .</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig2.jpg" /> Şekil 2:. 4 mikroakışkan çipleri içeren 4 inçlik photomask mikroakışkan Chip Tasarım (A) tasarımı. (B) tek bir yonga detaylı gösterimidir. Fişleri bir çıkış kanalı ve bir toz filtresi ve ardından üç giriş kanalı ihtiva eder. Giriş kanalı 1 su fazı içeren, lipit / Yağ fazında ve kanal 3 2 kanallı ilave lipit / yağ-fazı ile oluşturulan damlalar seyreltilmesi için de kullanılabilir. (C) (üstten ve alttan gelen) lipit / yağ fazı (soldan geliyor) su fazı ile bir araya geldi kavşak detaylı gösterimi. Kavşakta, damlacıklar oluşturacak ve sağdaki çıkış kanalına doğru akar. (D) 2 mikron kanallı bir toz filtresi detaylı gösterimi. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54278/54278fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54278/54278fig3.jpg" /> Şekil 3:. Su içinde yağ emülsiyonu damla oluşumu için Yöntem (A) parlak alan mikroskop mikroakışkan çipi ve Mikroakiskan boru. Hem su ve lipid / yağ fazı tüpler, sırasıyla çip girişler 1 ve 2&#39;ye bağlıdır. Su ve lipid / yağ safhaları karşılayan Mikroakiskan yonga üzerinde (B) Kısıtlama. basınçları değiştirerek, damlacıklar büyüklüğü kontrol edilebilir. PDMS kaplı akış hücrelerinin (C) tasarımı. akış hücre içine damlacıklar yükledikten sonra, açık uçları ek valap ile kapatılır. (D) damla oluşumunun şematik. Damlacıklar sentrozom, tubulin ve mitotik iğ formasyonu için gerekli olan ek bileşenler kapsüllenmesi için kullanılmaktadır. Kortikal-dynein hedefleme (E) şematik. Biyotinile (Bio) dynein streptavidin (STRP) aracılığıyla biyotinile lipidler hedeflenmektedir. <a= &quot;Https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54278/54278fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot; href&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54278/54278fig4.jpg" /> Şekil 4:. Karmaşıklığı artırılması ile Mili-Reconstitutions Temsilcisi Sonuçlar (A), kısa, orta ve uzun mikrotübül örneklerini gösteren iki sentrozom içeren damlacıkların maksimum yoğunluğu projeksiyonları. Sentrozom ve mikrotübüller,% 10 HiLyte-488 tubulin etiketli ilave tarafından görüntülenmiştir. Ölçek çubukları 10 mikron =. (- Sol) ve streptavidin (STRP) varlığı (+, sağ) yokluğunda GFP biyotin-dinein-TMR (B) lokalizasyonu. Kortikal GFP-biotin-dynein-TMR (sağ +) - (sol) veya varlığı (C) Mikrotubul aster yokluğunda konumlandırma. (D) Mikrotubul aster (sol panel, green ASE1 varlığında) yerleştirme (orta panel, kırmızı). ASE1 ve Cut7 (kinesin-5) (orta panel, kırmızı) varlığında (E) Mikrotubul aster (sol panel, yeşil) konumlandırma. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54278/54278fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54278/54278fig5.jpg" /> Şekil 5: in vitro Görüntüleme Aster Konumlandırma Dinamikleri (A) birçok saat kadar için damlacık görüntüleme sağlayan bir PDMS fincan tasarımı.. (B) Üretimi, depolama ve damlacıkların görüntüleme floresan dekstran yokluğunda (solda) içerme (sağ) (Alexa 647) ile izah farklı içerikleri içeren (iletilen). (C) 60 dk time-lapse Tek düzlemi görüntüleri (2 dk aralıklarla) reklamın z-yığının (2 mikron mesafeler) alınanTek bir centrosome içeren roplet. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54278/54278fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets at JoVE.com

Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

The assembly and positioning of the mitotic spindle depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, motor proteins and cross-linkers. Here we present our recently developed methods in which the geometrical confinement of spherical emulsion droplets is used for the bottom-up reconstitution of basic mitotic spindles.

Küresel emülsiyon damlacıkların Temel Mitotik Mil Sulandırma

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and ...

reconstitution-basic-mitotic-spindles-spherical-emulsion

Universidad de Cartagena UDEC

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 2

Cell Division

SCIENTISTS IN ACTION

9.7K Görüntüleme.  Delft University of Technology. The assembly and positioning of the mitotic spindle depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, motor proteins and cross-linkers. Here we present our recently developed methods in which the geometrical confinement of spherical emulsion droplets is used for the bottom-up reconstitution of basic mitotic spindles.

Video: Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological materials. Such approaches have received considerable attention in research on the boundary between living and nonliving matter and have been used to construct artificial cells over the past two decades. In particular, Giant Vesicles (GVs) have often been used as artificial cell membranes. In this paper, we describe the preparation of GVs encapsulating highly packed microspheres as a model of cells containing highly condensed biomolecules. The GVs were prepared by means of a simple water-in-oil emulsion centrifugation method. Specifically, a homogenizer was used to emulsify an aqueous solution containing the materials to be encapsulated and an oil containing dissolved phospholipids, and the resulting emulsion was layered carefully on the surface of another aqueous solution. The layered system was then centrifuged to generate the GVs. This powerful method was used to encapsulate materials ranging from small molecules to microspheres.

Giant vesicles containing highly packed micrometer-sized components are useful cell models. The water-in-oil emulsion centrifugation method is a simple, powerful tool for the preparation of giant vesicles with encapsulated materials.

bir su-içinde-yağ emülsiyonu santrifüj Dev veziküller Kapsüllenen Mikrokürelerin hazırlanması

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

Biyokimya

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts prepared from Xenopus laevis eggs have been powerful in dissecting biochemical networks underlying the cell-cycle progression, their ensemble average measurement typically leads to a damped oscillation, despite each individual oscillator being sustained. This is due to the difficulty of perfect synchronization among individual oscillators in noisy biological systems. To retrieve the single-cell dynamics of the oscillator, we developed a droplet-based artificial cell system that can reconstitute mitotic cycles in cell-like compartments encapsulating cycling cytoplasmic extracts of Xenopus laevis eggs. These simple cytoplasmic-only cells exhibit sustained oscillations for over 30 cycles. To build more complicated cells with nuclei, we added demembranated sperm chromatin to trigger nuclei self-assembly in the system. We observed a periodic progression of chromosome condensation/decondensation and nuclei envelop breakdown/reformation, like in real cells. This indicates that the mitotic oscillator functions faithfully to drive multiple downstream mitotic events. We simultaneously tracked the dynamics of the mitotic oscillator and downstream processes in individual droplets using multi-channel time-lapse fluorescence microscopy. The artificial cell-cycle system provides a high-throughput framework for quantitative manipulation and analysis of mitotic oscillations with single-cell resolution, which likely provides important insights into the regulatory machinery and functions of the clock.

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

We present a method for the generation of in vitro self-sustained mitotic oscillations at the single-cell level by encapsulating egg extracts of Xenopus laevis in water-in-oil microemulsions.

Microemulsions boş hücre Xenopus yumurtanın hücre döngüsü salınımlarını sulandırma ayıklar

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Fabrication of Spherical and Worm-shaped Micellar Nanocrystals by Combining Electrospray, Self-assembly, and Solvent-based Structure Control

Micellar nanocrystals (micelles with encapsulated nanocrystals) have become an emerging major class of nanobiomaterials. We describe a method of fabricating micellar nanocrystals based on combining top-down electrospray, bottom-up self-assembly, and solvent-based structure control. This method involves first using electrospray to generate uniform ultrafine liquid droplets, each of which functions as a micro-reactor in which self-assembly reaction occurs forming micellar nanocrystals, with the structures (micelle shape and nanocrystal encapsulation) controlled by the organic solvent used. This method is largely continuous and produces high quality micellar nanocrystal products with an inexpensive structure control approach. By using a water-miscible organic solvent tetrahydrofuran (THF), worm-shaped micellar nanocrystals can be produced due to solvent-induced/facilitated micelle fusion. Compared with the common spherical micellar nanocrystals, worm-shaped micellar nanocrystals can offer minimized non-specific cellular uptake, thus enhancing biological targeting. By co-encapsulating multiple nanocrystals into each micelle, multifunctional or synergistic effects can be achieved. Current limitations of this fabrication method, which will be part of the future work, primarily include imperfect encapsulation in the micellar nanocrystal product and the incompletely continuous nature of the process.

The present work describes a method to fabricate micellar nanocrystals, an emerging major class of nanobiomaterials. This method combines top-down electrospray, bottom-up self-assembly, and solvent-based structure control. The fabrication method is largely continuous, can produce high quality products, and possesses an inexpensive means of structure control.

Küresel ve solucan şeklinde Micellar Nanocrystals Electrospray, kendinden montajlı birleştirerek ve Solvent Bazlı Yapı Denetim imalatı

Micellar nanocrystals (micelles with encapsulated nanocrystals) have become an emerging major class of nanobiomaterials. We describe a method of ...

Kimya

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function depends on a robust quality control system to maintain protein homeostasis (proteostasis). Declines in mitochondrial proteostasis have been linked to cancer, aging, neurodegeneration, and many other diseases. Msp1 is a AAA+ ATPase anchored in the outer mitochondrial membrane that maintains proteostasis by removing mislocalized tail-anchored proteins. Using purified components reconstituted into proteoliposomes, we have shown that Msp1 is necessary and sufficient to extract a model tail-anchored protein from a lipid bilayer. Our simplified reconstituted system overcomes several of the technical barriers that have hindered detailed study of membrane protein extraction. Here, we provide detailed methods for the generation of liposomes, membrane protein reconstitution, and the Msp1 extraction assay.

Here, we present a detailed protocol for reconstitution of Msp1 extraction activity with fully purified components in defined proteoliposomes.

Msp1 Ayıklama Etkinliğinin Tamamen Saflaştırılmış Bileşenlerle Yeniden Uzlaştırılması

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...

Self-Assembly of Microtubule Tactoids

The cytoskeleton is responsible for major internal organization and re-organization within the cell, all without a manager to direct the changes. This is especially the case during mitosis or meiosis, where the microtubules form the spindle during cell division. The spindle is the machinery used to segregate genetic material during cell division. Toward creating self-organized spindles in vitro, we recently developed a technique to reconstitute microtubules into spindle-like assemblies with a minimal set of microtubule-associated proteins and crowding agents. Specifically, MAP65 was used, which is an antiparallel microtubule crosslinker from plants, a homolog of Ase1 from yeast and PRC1 from mammalian organisms. This crosslinker self-organizes microtubules into long, thin, spindle-like microtubule self-organized assemblies. These assemblies are also similar to liquid crystal tactoids, and microtubules could be used as mesoscale mesogens. Here, protocols are presented for creating these microtubule tactoids, as well as for characterizing the shape of the assemblies using fluorescence microscopy and the mobility of the constituents using fluorescence recovery after photobleaching.

This article presents a protocol for the formation of microtubule assemblies in the shape of tactoids using MAP65, a plant-based microtubule crosslinker, and PEG as a crowding agent.

Mikrotübül taktoidlerinin kendi kendine montajı

The cytoskeleton is responsible for major internal organization and re-organization within the cell, all without a manager to direct the changes. This is ...

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component in coordinating shape changes like cytokinesis, polarized growth, and migration. Septins are filament-forming proteins that assemble to form diverse higher-order structures and, in many cases, are found in different areas of the plasma membrane, most notably in regions of micron-scale positive curvature. Monitoring the process of septin assembly in vivo is hindered by the limitations of light microscopy in cells, as well as the complexity of interactions with both membranes and cytoskeletal elements, making it difficult to quantify septin dynamics in living systems. Fortunately, there has been substantial progress in the past decade in reconstituting the septin cytoskeleton in a cell-free system to dissect the mechanisms controlling septin assembly at high spatial and temporal resolutions. The core steps of septin assembly include septin heterooligomer association and dissociation with the membrane, polymerization into filaments, and the formation of higher-order structures through interactions between filaments. Here, we present three methods to observe septin assembly in different contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports. These methods can be used to determine the biophysical parameters of septins at different stages of assembly: as single octamers binding the membrane, as filaments, and as assemblies of filaments. We use these parameters paired with measurements of curvature sampling and preferential adsorption to understand how curvature sensing operates at a variety of length and time scales.

Cell-free reconstitution has been a key tool to understand the cytoskeleton assembly, and work in the last decade has established approaches to study septin dynamics in minimal systems. Presented here are three complementary methods to observe septin assembly in different membrane contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports.

Biyofiziksel Özellikleri ve İşlevleri İncelemek için Membranlarda Septin Düzeneğinin Yeniden Sulandırılması

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell deformation, division, migration, and adhesion. However, studying the dynamics and structure of the actin network in vivo is complicated by the biochemical and genetic regulation within live cells. To build a minimal model devoid of intracellular biochemical regulation, actin is encapsulated inside giant unilamellar vesicles (GUVs, also called liposomes). The biomimetic liposomes are cell-sized and facilitate a quantitative insight into the mechanical and dynamical properties of the cytoskeleton network, opening a viable route for bottom-up synthetic biology. To generate liposomes for encapsulation, the inverted emulsion method (also referred to as the emulsion transfer method) is utilized, which is one of the most successful techniques for encapsulating complex solutions into liposomes to prepare various cell-mimicking systems. With this method, a mixture of proteins of interest is added to the inner buffer, which is later emulsified in a phospholipid-containing mineral oil solution to form monolayer lipid droplets. The desired liposomes are generated from monolayer lipid droplets crossing a lipid/oil-water interface. This method enables the encapsulation of concentrated actin polymers into the liposomes with desired lipid components, paving the way for in vitro reconstitution of a biomimicking cytoskeleton network.

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

In this manuscript, we demonstrate the experimental techniques to encapsulate the F-actin cytoskeleton into giant unilamellar lipid vesicles (also called liposomes), and the method to form a cortex-biomimicking F-actin layer at the inner leaflet of the liposome membrane.

İn Vitro Aktin Hücre İskeletinin Dev Unilameller Veziküller İçinde Yeniden Sulandırılması

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell ...

Biyomühendislik

Particle Templated Emulsification enables Microfluidic-Free Droplet Assays

Reactions performed in monodispersed droplets afford enhanced accuracy and sensitivity compared to equivalent ones performed in bulk. However, the requirement of microfluidics to form controlled droplets imposes a barrier to non-experts, limiting their use. Here, we describe particle templated emulsification, an approach to generate monodisperse droplets without microfluidics. Using templating hydrogel spheres, we encapsulate samples in monodispersed droplets by simple vortexing. We demonstrate the approach by using it to perform microfluidic-free digital PCR.

Water-in-oil droplet assays are useful for analytical chemistry, enzyme evolution, and single cell analysis, but typically require microfluidics to form the droplets. Here, we describe particle templated emulsification, a microfluidic-free approach to perform droplet assays.

Parçacık Şablonlu Emülsifikasyonu MikroakışkanSız Damlacık Tahlillerini Mümkün

Reactions performed in monodispersed droplets afford enhanced accuracy and sensitivity compared to equivalent ones performed in bulk. However, the ...

Biyoloji

Reconstitution of Membrane-Tethered Minimal Actin Cortices on Supported Lipid Bilayers

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane with the underlying actin cortex. In the past decades, reconstituted, minimal systems based on supported lipid bilayers in combination with actin filament networks have proven to be very instrumental in unraveling basic mechanisms and consequences of membrane-tethered actin networks, as well as in studying the functions of individual membrane-associated proteins. Here, we describe how to reconstitute such active composite systems in vitro that consist of fluid supported lipid bilayers coupled via membrane-associated actin-binding proteins to dynamic actin filaments and myosin motors that can be readily observed via total internal reflection fluorescence microscopy. An open-chamber design allows one to assemble the system in a step-by-step manner and to systematically control many parameters such as linker protein concentration, actin concentration, actin filament length, actin/myosin ratio, as well as ATP levels. Finally, we discuss how to control the quality of the system, how to detect and troubleshoot commonly occurring problems, and some limitations of this system in comparison with the living cell surface.

This protocol describes the formation of supported lipid bilayers and the addition of cytoskeletal filaments and motor proteins to study the dynamics of reconstituted, membrane-tethered cytoskeletal networks using fluorescence microscopy.

Membrana Bağlı Minimal Aktin Kortekslerinin Desteklenen Lipid Çift Katmanlı Üzerinde Yeniden Sulandırılması

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane ...

Fare Oositlerinde Hücre İskeletinin Nükleer Şekil ve Kondensat Dinamiği Üzerine Etkisi

Capturing Cytoskeleton-Based Agitation of the Mouse Oocyte Nucleus Across Spatial Scales

A major challenge in understanding the causes of female infertility is to elucidate mechanisms governing the development of female germ cells, named oocytes. Their development is marked by cell growth and subsequent divisions, two critical phases that prepare the oocyte for fusion with sperm to initiate embryogenesis. During growth, oocytes reorganize their cytoplasm to position the nucleus at the cell center, an event predictive of successful oocyte development in mice and humans and, thus, their embryogenic potential. In mouse oocytes, this cytoplasmic reorganization was shown to be driven by the cytoskeleton, the activity of which generates mechanical forces that agitate, reposition, and penetrate the nucleus. Consequently, this cytoplasmic-to-nucleoplasmic force transmission tunes the dynamics of nuclear RNA-processing organelles known as biomolecular condensates. This protocol provides an experimental framework to document, with high temporal resolution, the impact of the cytoskeleton on the nucleus across spatial scales in mouse oocytes. It details the imaging and image analysis steps and tools necessary to evaluate i) cytoskeletal activity in the oocyte cytoplasm, ii) cytoskeleton-based agitation of the oocyte nucleus, and iii) its effects on biomolecular condensate dynamics in the oocyte nucleoplasm. Beyond oocyte biology, the methods elaborated here can be adapted for use in somatic cells to similarly address cytoskeleton-based tuning of nuclear dynamics across scales.

Yazar Spot Işığı: Fare Oositlerinde Mekano-Transdüksiyon ve Nükleer Ajitasyon Dinamiklerinin Aydınlatılması

This protocol provides an experimental framework to document the physical impact of the cytoskeleton on nuclear shape and the internal membrane-less organelles in the mouse oocyte system. The framework can be adapted for use in other cell types and contexts.

Fare Oosit Çekirdeğinin Hücre İskeleti Tabanlı Ajitasyonunun Uzamsal Ölçeklerde Yakalanması

A major challenge in understanding the causes of female infertility is to elucidate mechanisms governing the development of female germ cells, named ...