ここで紹介するのは、前転移で同期した細胞における生細胞紡糸ディスク共焦点イメージングを用いて微小管ダイナミクスを解析する堅牢で簡単な方法であり、その後MATLABベースのプラットフォームで画像を解析します。赤色シフト蛍光タンパク質を紡糸ディスク顕微鏡と組み合わせて使用することで、光毒性を低減します。したがって、同じ調製物内で、より多くの細胞を画像化することができます。
微小管の動性は、多数の病理学的状態において変化する。したがって、これらのプロセスにおける微小管ダイナミクスの調節と挙動を理解することは、病気のメカニズムを理解し、最終的にはそれらを補うための治療法を開発するのに役立ちます。また、この方法は大規模でもあり、創薬の取り組みに適用される可能性があります。
この方法は、蛍光脱同期プロトコルを変更し、細胞周期の異なる段階から細胞を得ることによって変更することができる。これは、微小管に対して薬物をスクリーニングし、分裂細胞および非分裂細胞の欠陥を特定する場合に有用である。細胞種ごとにトランスフェクションプロトコルと播種密度を最適化する必要があります。
単一の成長する微小管を検出するために、EB3の発現レベルは低いはずです。DPBSでHeLa細胞を非同期的に増殖させてから始め、37°Cで5分間トリプシン-EDTAでインキュベートします。3対1の比率で10%の熱不活化FCSを添加したRPMI-1640培地を添加することによってトリプシンを停止し、トリプシン-EDTAを添加する。
原稿の方向に従って細胞の濃度を計算し、調製されたチャンバーカバースリップの各ウェルに50,000個の細胞を播種する。カバースリップをインキュベーターに戻し、摂氏37度と二酸化炭素5%で24時間細胞を成長させます。翌日、培養器から細胞を取り出し、100マイクロリットルのトランスフェクション混合物を各ウェルに滴下する。
培養器に細胞を戻し、4時間培養した後、新鮮な培地で細胞を補い、さらに20時間インキュベートする。ジメチレンジナストロン(DME)の2.5マイクロモル溶液をフェノールレッドフリーDMEMで調製し、10%FCSおよび2ミリモルL-グルタミンを補う。チャンバーカバースリップ中の成長培地をDME成長培地に交換し、細胞をインキュベーターに戻します。
3.5時間のインキュベーションの後、チャンバーカバースリップを37°Cと5%の二酸化炭素に設定した環境チャンバーに取り付け、画像化用の暗いパネルで顕微鏡にセルを移します。その後、合計4時間インキュベーションを続けます。100X、1.49個の開口、油浸し目的、デュアルディスク共焦点システム、および信頼性の高いオートフォーカスシステムを備えた反転顕微鏡でタイムラプスイメージングを実行します。
テキスト原稿に記述されているように、イメージングパラメータを定義します。プロフェーズで細胞を見つけ、単極有糸夫の中心に対応するZ平面に焦点を当てます。その後、5秒ごとに、合計1分間、ビニングなし、露光間の照明なしで画像を取得します。
まず、数値解析ソフトウェアをロードし、u-track V2.2.0 フォルダをコマンド ウィンドウからムービー セレクタ GUI と呼ばれるソフトウェア検索パスに追加します。次に、画像取得ソフトウェアによって生成された生のファイルをインポートします。手動で、目的の開口数とイメージングに使用する時間間隔を入力します。
すべての画像がロードされたら、ムービーリストとして保存を選択し、ダイアログウィンドウの右側にあるuトラックオプションを選択して、入力されたタイムラプスシリーズをムービーとして保存します。ポップアップメニューから「微小管プラスエンド」を選択し、「大丈夫」をクリックすると、新しいダイアログ・ウィンドウが開き、解析の3つのステップのパラメータを決定します。手順 1 では、[設定] をクリックし、ドロップダウン メニューから [彗星検出] を選択します。
原稿に記述されているように、ガウスフィルタと流域セグメンテーションの違いのパラメータを定義します。次に、[すべてのムービーに設定を適用する] を選択し、[適用] をクリックします。ステップ 2 では、マイクロチューブプラスエンドダイナミクスを選択し、テキスト原稿に従って、リンク、ギャップのクローズ、マージ、分割、およびカルマンフィルタ関数の値を定義する設定オプションを使用します。
次元の問題については、ドロップダウンメニューから2つを選択し、最大ギャップを閉じるための5つのフレームを使用し、最初のステップからトラックセグメントの最小長に3フレームを使用します。以前と同様に、[すべてのムービーに設定を適用する] を選択して[適用] をクリックします。ステップ 3 では、トラック解析方法として微小管力学分類を選択し、設定ボタンを使用してパラメーターを定義します。
ムービーの先頭と末尾のトラックを削除するボックスを選択し、統計情報ヒストグラムを作成します。ドロップダウン リストから、前方ギャップの前に 2 ~ 3 フレーム、前方ギャップ速度分布の 95 パーセンタイルをそれぞれ選択して、順方向と後方の再分類を行います。すべてのパラメータを定義したら、[すべてのムービーにチェック/オフを適用する]を選択し、コントロールペインのUトラックウィンドウからすべてのムービーボックスを実行し、実行を押します。
ムービー処理が完了すると、メッセージが表示されます。pEB3-tdTomatoプラスミドをHeLa細胞で一過性発現させた。細胞をDME処理と同期させた。
微小チューブ成長のタイムラプスムービーを解析し、その結果の成長速度と動的性をプロットした。最大ギャップ長や最大収縮率など、解析に影響を与えるパラメータを同じタイムラプスムービーに対して変更しました。成長速度と動的性の対応する値を計算しました。
結果として生じる成長速度は大きな影響を受けなかったが、最大ギャップ長を変更した場合、動的性は異なっていた。3つのケースすべてにおいて、微小管サブトラックの検出は同様であったが、最大ギャップ長を15に設定した場合、完全なMT軌道の再構築はほとんど影響を受けた。イメージング条件が微小管挙動を妨げているかどうかを評価するために、タイムラプス系列の第1および第2の半分を別々に分析し、対応する成長速度と動的性を比較した。
予想通り、有意差は検出されなかった。細胞は前転移で同期するため、微小管の密度が非常に高いことを覚えておいてください。したがって、解析のパラメータを非常に慎重に設定する必要があり、異なる微小管を誤って識別する必要はありません。
この方法による微小管ダイナミクスの測定は、直接、間接的に、微小管を調節する他の生物学的標的の研究と比較することができる。
