通过旋转磁盘显微镜在单极式斜接主轴中测量微管动力学

我们在这里介绍的是一种可靠而简单的方法，用于在在相相同步的细胞中使用活细胞旋转磁盘共体成像来分析微管动力学，然后通过基于 MATLAB 的平台对图像进行分析。将红移荧光蛋白与旋转盘显微镜结合使用可降低光毒性。因此，可以在相同的准备中对更多的单元格进行成像。

微管动态在大量的病理条件下被改变。因此，了解微管动力学在这些过程中的监管和行为可以帮助我们了解疾病的机制，并最终开发疗法来补偿它们。该方法也是可升级的，因此有可能在药物发现工作中应用。

该方法可以通过改变荧光非同步协议和从细胞周期的不同阶段获取细胞来修改。当对微管筛选药物和识别分裂和非分裂细胞的缺陷时，这非常有用。有必要优化每个细胞类型的转染协议和播种密度。

EB3的表达水平应该很低，以便检测单个生长的微管。首先在DPBS中异步生长的 HeLa 细胞，然后在 37 摄氏度下用三辛-EDTA孵育它们 5 分钟。通过添加 RPMI-1640 介质，并辅以 10% 热灭活 FCS 以 3 比 1 的比例停止尝试性，添加的 trypsin-EDTA。

根据手稿方向计算细胞的浓度，将5万个细胞播种到准备好的、室的盖玻片的每个井中。将盖玻片返回孵化器，在37摄氏度和5%的二氧化碳下24小时生长细胞。第二天，从培养箱中取出细胞，滴入每个井中加入100微升的转染混合物。

将细胞返回到培养箱，经过四个小时的孵育后，用新鲜培养剂补充细胞，并额外孵育20小时。在苯酚红色无 DMEM 中准备 2.5 微摩尔二甲苯胺溶液，辅以 10%FCS 和 2 毫摩尔 L-谷氨酰胺。用 DME 生长介质替换室盖唇中的生长介质，然后将细胞返回到培养箱。

经过3.5小时的孵育，将细胞转移到显微镜上，将室盖玻片安装到37摄氏度和5%的二氧化碳环境室中，并配有用于成像的深色面板。然后继续孵育共四个小时。使用 100X、1.49 数值孔径、油浸目标、双磁盘共聚焦系统和可靠的自动对焦系统在倒置显微镜上执行时间推移成像。

定义文本手稿中描述的成像参数。在前向中查找单元格，并在与单极线粒体主轴中心对应的 Z 平面中对焦。然后每 5 秒获取一次图像，总共一分钟，在曝光之间没有装箱和照明。

首先加载数值分析软件，然后从命令窗口将 u-track V2.2.0 文件夹添加到软件搜索路径（称为影片选择器 GUI）。然后导入图像采集软件生成的原始文件。手动输入目标的数字孔径和用于成像的时间间隔。

加载所有图像后，通过选择"保存为影片列表"和对话窗口右侧的 u-track 选项，将输入的时间推移系列保存为影片。从弹出式菜单中选择微图加端，然后单击"好"，这将打开一个新的对话窗口，以确定分析的三个步骤的参数。对于步骤 1，单击"设置"，然后从下拉菜单中选择彗星检测。

定义高斯滤波器和流域分割差异的参数，如手稿中所述。然后选择"应用设置"到所有影片，然后单击"应用"。对于步骤 2，选择微图加端动力学，并使用设置选项根据文本手稿定义链接、间隙缩小、合并和拆分以及 Kalman 滤镜函数的值。

对于尺寸问题，请从下拉菜单中选择两个，并使用五帧来缩小最大间隙，使用三帧来缩小第一步的轨道段的最小长度。与之前一样，选择"应用于所有影片的设置"，然后单击"应用"。对于步骤三，选择微图动力学分类作为跟踪分析方法，并通过设置按钮定义参数。

选择用于移除影片开头和末尾的曲目的框，并制作统计直方图。从下拉列表中，选择使用前进间隙前的两到三帧，以及前进间隙速度分布的第 95 百分位，分别进行向前和向后重新分类。定义所有参数后，选择"将选中/取消选中"应用于所有影片，然后从控制窗格 u-track 窗口运行所有影片框，然后按"运行"。

影片处理完成后将显示一条消息。pEB3-tdTomato质粒在希拉细胞中短暂表达。细胞与DME治疗同步。

分析了微管生长的时差电影，绘制了由此产生的生长速度和动态性。为同一组时间推移影片修改了用于影响分析的参数，如最大间隙长度和最大收缩系数。计算了生长速度和动态性的相应值。

虽然由此产生的增长速度没有受到显著影响，但修改最大间隙长度时，动态性不同。在所有三种情况下，微管子轨道的检测情况都相似，但当最大间隙长度设置为15时，整个MT轨迹的重建主要受到影响。为了评估成像条件是否干扰微管行为，分别对时间推移序列的第一、二部分进行了分析，并比较了相应的生长速度和动态性。

如预期的那样，未检测到显著差异。重要的是要记住，因为细胞在前位同步，微管的密度非常高。因此，必须非常小心地设置分析参数，不要误认不同的微管。

用这种方法对微管动力学的测量可以与其他生物靶点直接、间接地进行调节微管的研究进行比较。