HC11 ve EpH4 hücreleri, kültürde ayırt edilebilen fare meme epitel hücre çizgileridir. Aynı zamanda, bu hücreler onkogenler bir dizi tarafından dönüştürülebilir. Bu hücreler farklılaşma ve neoplastik dönüşüm arasındaki ilişki çalışması için idealdir.
Bu teknikler sinyal iletim çalışmalarında kanser tedavisi için hedefleri keşfetmek için kullanılabilir. Örneğin, küçük GTPase Rac ve diğer moleküller yüksek seviyelere ifade edildiğinde meme epitel hücrelerinin dönüşümünü tetikleyebilir, ama şaşırtıcı düşük seviyelerde, onlar farklılaşma neden olabilir. Diğer sinyal dönüştürücüleri de benzer şekilde davranabilir.
Bu ilkeler, hücre birleşiminin önemli bir rol oynadığı diğer farklılaşma türlerine de uygulanabilir, örneğin adipositlerin veya miyotüplerin farklılaşması gibi. Bu tekniği ilk kez yapan biri, HC11 hücrelerinin kaplamasının önemli olduğunu unutmamalıdır. Bunun nedeni hücreden hücreye temas farklılaşma için önemlidir olmasıdır.
Dikkat edilmesi gereken bir diğer nokta da, eph4 hücrelerinin matristen doğru şekilde çıkarılmasının protein niceliği için kritik öneme sahip olmasıdır, çünkü herhangi bir kalıntı protein tayinini etkileyecektir. Protokolün bazı ayrıntılarını kağıt üzerinde açıklamak zor olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi yararlıdır. El yazması talimatlara göre 50 mililitre HC11 hücreli ortam bir şişe hazırlayarak başlayın.
Hücreleri kaplamak için, beş altı santimetre 50% confluent Petri yemekleri orta aspire ve steril dokuz inç pamuk bağlı Pasteur pipet kullanarak trypsin yaklaşık 1.8 mililitre ile hücreleri yıkayın. Sonra plaka başına trypsin 200 mikrolitre ekleyin ve bağlı hücreleri yerinden etmek için plaka girdap. Faz kontrast mikroskopisi altındaki hücreleri 4X hedefiyle gözlemleyin ve yerinden çıkmaya başladıklarından emin olun.
Daha sonra steril bir dokuz inç Pasteur pipet ile HC11 orta yaklaşık 1,5 mililitre aspire ve sıçramasını önlemek için emin yapmak çanak döndürerek hücrelere karşı dikey olarak fışkırtMak. HC11 orta ve girdap ile şişe ye tüm hücreleri aktarın şişe eşit dağıtmak için. Sonra 20 üç santimetre Petri yemekleri içine hücre süspansiyon aliquot her çan başına iki mililitre hücre pipetting tarafından.
Hücreleri yaymak ve bir gecede 37 santigrat derece ve % 5 karbondioksit onları kuluçka yayılımı için Petri yemekleri Rock. Ertesi gün hücreler %90-100 konfluent olduğunda, ortamı aspire edin ve egf olmadan orta ile değiştirin. 24 saat EGF olmadan orta hücreleri büyüttükten sonra, 10 yemekler için farklılaşma orta ekleyin ve kontrol olarak diğer 10 yemekleri tutarak 10 güne kadar hücreleri büyümek.
Hem KALÇA tedavi ve kontrol hücreleri ile her iki ila üç günde bir orta değiştirin. Farklılaşmayı izlemek için faz kontrastlı mikroskopile hücreleri gözlemleyin. Hücreler yeşil floresan protein ifade ediyorsanız floresan mikroskobu kullanın.
Ayrıca, kalça tedavi ve kontrol hücreleri günde bir kez proteinleri ayıklayarak ve Batı Blot analizi gerçekleştirerek farklılaşma derecesini ölçmek. EpH4 büyüme ortamını, EHS matrisini ve buz üzerinde iki konik 50 mililitrelik tüpü toplayın ve yerleştirin. Eksi 20 santigrat derece pipet uçları ile doku kültür plakaları prechill ve iki 50 mililitrekonik tüpler 10 veya% 20 matris ile takviye EpH4 büyüme ortamı hazırlamak ve kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde tutmak.
Eksi 20 santigrat derece önceden soğutulmuş doku kültür plakaları aldıktan sonra, bir pipet ile matris yayArak seyreltilmemiş matris 150 mikrolitre ile 24-iyi plaka 10 kuyu kat. Matris ilerlerken kabarcıklar oluşturmaktan kaçının. Daha sonra yavaşça plakanın kenarlarına dokunun ve matrisin katılaşabilmesi için plakayı 37 derecede bir saat kuluçkaya yatırın.
Bu arada, eph4 hücrelerini daha önce açıklanan ve trypsed hücrelerin intibakı sonrası tek hücre süspansiyonları sağlayarak farklılaşmaya hazırlanın. Sonra, bir hemositometre ile süspansiyon hücreleri saymak. Kuyu başına dört hücreye beş kez 10 tane aktarın ve beş dakika boyunca 250 kez g'de döndürün.
Dikkatle supernatant orta aspire ve buz üzerinde tüp yerleştirin. Bir mililitrelik pipet ucu kullanın eph4 büyüme ortamının 350 mikrolitre hücreleri yeniden askıya almak için kullanın 20% matris ile takviye ederken buz üzerinde tüpler kabarcıklar önlemek için emin tutmak. Alt tabaka katılaştırıldıktan sonra, her kaplanmış iyi kaplanmış hücre süspansiyon 350 mikrolitre ekleyin ve bir saat için 37 derece santigrat bir karbondioksit inkübatör yerleştirin% 20 matris tabakası katılaşmak için izin vermek.
Tek hücrelerin görünür olduğundan emin olmak için faz kontrast mikroskopisi ile hücreleri gözlemleyin. Daha sonra 200 mikrolitre EpH4 orta ve %10 matris ekleyin ve plakayı 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Matristeki hücreleri kaplamaktan bir gün sonra farklılaşma indüksiyonuna başlayın.
Dikkatle üst% 10 matris orta 150 mikrolitre çıkarın ve HIP ve% 10 matris içeren EpH4 orta 200 mikrolitre ekleyin ve kontroller için% 10 matris orta HIP olmadan ekleyin. Mamografi oluşumunu faz kontrastmikroskobu ile 10 güne kadar izleyerek ortamı iki günde bir değiştirin. Farklılaşmayı ölçmek için, %10 matris HIP ortamını kuyulardan dikkatlice inceleyin ve %20 matris katmanını 350 mikrolitre buz gibi pbs ile durulayın.
Daha sonra 70 ila 100 mikrolitre buz gibi soğuk PBS ekleyin ve bir milimolar EDTA ile doğrudan kuyulara ve %100 matrisin alt tabakasını pipet ucuyla hafifçe ayırın. Tabağı 30 dakika boyunca dört santigrat derecede hafifçe sallayın. Spheroid süspansiyonu konik bir tüpe dikkatlice aktarın ve kalan küresel leri kurtarmak için kuyuları 500 mikrolitre PBS EDTA ile durulayın.
Matrisin tamamen eridiğinden emin olmak için tüpü 30 dakika daha buz üzerinde sallayın. Görünür matris kümeleri görülürse, daha fazla PBS EDTA ekleyin veya daha uzun süre sallayın. Spheroidleri peletlemek için çözeltiyi 350 kez g'de santrifüj edin.
Daha sonra supernatant aspire, küresel lyse, ve beta-kazein için hücreleri araştırmak, siklin D1, ve p120RasGAP Batı blotting tarafından. HC11 hücrelerinde Rac sinyalinin gücü üzerine farklılaşma çarpıcı bir bağımlılık vardır. Endojen CRAC1 farklılaşma için gerekli iken ve mutasyona aktive RacV12 düşük seviyelerde farklılaşma kapasitesinde bir artışa neden, yüksek RacV12 düzeyleri farklılaşma bir blok tetikler ve neoplazi neden.
EpH4 hücrelerinin ayırım özellikleri 3Boyutlu matris kültüründe incelendiğinde, beta-kazein üretiminin 8-10 gün, siklin D1 ekspresyonunun ise HIP stimülasyonundan 4-6 gün sonra maksimum olduğu saptandı. Tek tek hücrelerin konumlandırılmasını belirlemek için DAPI ile boyanarak konfokal mikroskopi ile görüntülendiler. Memmosferlerde iç hücre ölümü ve içi boş lümen oluşumu gözlenirken, HGF eklenmesi tübüler yapıların oluşmasına neden oldu.
Bu tekniği ilk kez yapan biri, HC11 hücrelerinin kaplamasının önemli olduğunu unutmamalıdır. Ayrıca eph4 hücrelerinin matristen doğru çıkarılması protein niceliği için çok önemlidir, çünkü herhangi bir kalıntı protein tayinini etkileyecektir. Bu teknik, benzer şekilde davranabilecek diğer sinyal dönüştürücülerini araştırmak için kullanılabilir.
Bir kanser sürücü mutasyonları varsa, o zaman düşük seviyelerde kalan aslında farklılaşma neden olur bu yana onların tam inhibisyonu gerekli olmayacaktır.
