小鼠乳腺皮下HC11和EpH4细胞的分化

HC11和Eep4细胞是小鼠乳房上皮细胞系，可以在培养中分化。同时，这些细胞可以通过许多肿瘤基因进行转化。这些细胞是研究分化与肿瘤转化之间相互关系的理想之选。

这些技术可用于信号转导研究，以发现癌症治疗的目标。例如，小GTPase Rac和其他分子可能会触发乳房上皮细胞的转化，当表达到高水平，但令人惊讶的是，在低水平，他们可能会导致分化。其他信号传感器的行为方式可能相似。

这些原则可能适用于其他类型的分化以及细胞汇合发挥重要作用，例如脂肪细胞或 myotube 的分化。首次执行此技术的人应记住，电镀 HC11 细胞非常重要。这是因为细胞到细胞的接触对于分化很重要。

另一个需要注意的是，从基质中适当提取EepH4细胞对蛋白质定量至关重要，因为任何残留物都会影响蛋白质的测定。此方法的可视化演示很有用，因为协议的一些细节很难在纸上描述。首先根据手稿说明制备一瓶50毫升的HC11细胞培养。

要盘板细胞，从五个六厘米50%汇合培养皿中吸出介质，并使用无菌的九英寸棉塞巴氏移液器用约1.8毫升的尝试素清洗细胞。然后每盘添加200微升的三辛，然后旋转板，以分离附着的细胞。观察相位对比显微镜下的细胞与4倍的目标，以确保它们已经开始驱逐。

然后用无菌的九英寸巴斯德移液器吸吸约1.5毫升HC11培养基，并在旋转盘中垂直喷对细胞，确保避免溅水。用HC11介质将所有细胞转移到瓶子中，在瓶子中均匀地分散。然后将细胞悬浮液分成20个三厘米的培养皿，每盘移液两毫升细胞。

摇动培养皿，将细胞传播开来，并在37摄氏度和5%的二氧化碳中孵育。第二天，当细胞是90-100%的汇合，吸气的介质，并替换为介质与FBS，但没有EGF。在没有ECG的介质中生长细胞24小时后，将分化介质添加到10个菜中，将细胞生长长达10天，保持其他10个菜的对数。

每两到三天更换一次，同时使用HIP治疗和控制细胞。要监测分化，请观察具有相位对比度显微镜的细胞。如果细胞表达绿色荧光蛋白，请使用荧光显微镜。

此外，通过每天从HIP处理和控制细胞中提取一次蛋白质并进行西式Blot分析，量化分化程度。收集并放置 EpH4 生长介质、EHS 基质和两个锥形 50 毫升管在冰上。在零下20摄氏度下用移液器尖端预培养组织板，并准备EepH4生长介质，在两个50毫升锥形管中补充10或20%基质，并把它们放在冰上，直到准备好使用。

在零下20摄氏度下取回预冷组织培养板后，通过用移液器将基质摊开基质，用150微升未稀释的基质覆盖24孔板的10孔。在传播矩阵时避免产生气泡。然后轻轻敲击板的两侧，在37摄氏度下孵育板一小时，使基质凝固。

同时，通过尝试性EpH4细胞和前面描述的，确保单细胞悬浮后，再悬浮在三位一体细胞，为分化做好准备。接下来，用血细胞计计算悬浮细胞。将每孔5次10次转移到四个细胞，将1.5毫升无菌锥形离心管转移到1.5千伏无菌圆锥形离心管中，并在250倍g下旋转5分钟。

小心吸上一根的介质，将管子放在冰上。使用一毫升移液器尖端重新暂停在350微升的EepH4生长介质的细胞，辅以20%基质，同时保持管子在冰上，确保避免气泡。底层凝固后，将350微升的细胞悬浮液添加到每一个涂层井中，并将其放在37摄氏度的二氧化碳培养箱中一小时，使20%基质层凝固。

观察具有相位对比度显微镜的细胞，以确保单个细胞可见。然后加入200微升的EepH4介质，顶部有10%的基质，并在37摄氏度下孵育板。在电镀基质中的细胞一天后开始分化诱导。

小心地去除前 10%矩阵介质的 150 微升，添加 200 微升的 EpH4 介质，其中含有 HIP 和 10% 矩阵，对于控件，添加一个 10% 矩阵介质，而不添加 HIP。每两天更换一次介质，用相位对比显微镜监测乳腺层形成，最多10天。为了量化分化，请小心地从井中移掉 10%基体 HIP 介质，然后用 350 微升的冰冷 PBS 冲洗 20%基质层。

然后将 70 到 100 微升的冰冷 PBS 与一毫摩尔 EDTA 直接添加到井中，然后用移液器尖端轻轻分离 100% 基质的底部层。在4摄氏度下轻轻摇动盘子30分钟。小心地将球形悬浮液转移到锥形管中，然后用 500 微升 PBS EDTA 冲洗孔，以回收任何剩余的球形。

在冰上摇动管子30分钟，确保基质完全溶解。如果看到可见的矩阵团块，添加更多 PBS EDTA 或摇动更长时间。将溶液以 350 倍 g 离心，以对球体进行颗粒状。

然后通过西印探吸上一级，对球体进行回旋，探寻细胞中β-卡辛、环素D1和p120RasGAP。在HC11细胞中，对Rac信号的强度存在显著差异依赖性。虽然分化需要内源性 CRAC1，但突变激活 RacV12 的低水平会导致分化能力增加，但高 RacV12 水平会触发分化块并诱发肿瘤。

在3D基质培养中探讨EepH4细胞的分化特性时，发现β-casein生产在8至10天达到顶峰，在HIP刺激后4至6天，环素D1表达最大。为了确定单个细胞的定位，它们被染色为DAPI，并用共和显微镜成像。在乳腺层中观察到内细胞死亡和空心流明的形成，而HGF的加入导致管状结构的形成。

首次执行此技术的人应记住，HC11 细胞的电镀非常重要。此外，从基质中适当提取 EpH4 细胞对蛋白质定量至关重要，因为任何残留物都会影响蛋白质的测定。此技术可用于研究可能以类似方式运行的其他信号传感器。

如果癌症有驱动突变，那么它们完全抑制将没有必要，因为低水平的剩余实际上将诱导分化。