Bu protokol, temel araştırma için prob lar veya potansiyel klinik bileşikler için ATPaz inhibitörleri geliştirmeyi amaçlayan çok çeşitli tarama projeleri için geçerlidir. Bu yöntem yarı-yüksek iş elde tarama uygulamaları için optimize edilmiştir. Ayrıca birkaç ortak eserler önlemek için tasarlanmıştır ve tehlikeli maddelerin işlenmesi gerektirmez.
Laboratuvarımızda metamfetamin kullanım bozukluğunun tedavisi için yeni ve spesifik kas dışı miyozin II inhibitörleri geliştirmek için bu tökezlemeyi kullanıyoruz. Teorik olarak, bu yöntem kolayca ATP üreten herhangi bir enzimler uygulanabilir. Görsel gösteri tüm önemli teknik ayrıntıları açıklığa kavuşturmak için yardımcı olur.
Başlamak için, her 384-iyi siyah polistiren mikroplaka için 20 mikromolar seyreltilmiş aktin çözeltisi 4, 500 mikrolitre actin tampon konsantre actin stok çözeltisi seyrelterek hazırlayın. Viskozite ve heterojenliği azaltmak için aktin filamentleri kırmak için 30 kez yukarı ve aşağı boru lar atarak çözeltiyi iyice karıştırın. Sonra herhangi bir çökelti protein mevcut kaldırmak için çözelti santrifüj.
Supernatant'ı temiz bir santrifüj tüpüne dikkatlice aktarın. İskelet kası miyozin II, 171,4 mikrolitre LDH çözeltisi ve 171,4 mikrolitre PK çözeltisini içeren bir deney için 3, 252,9 miyozin tamponunu birleştirerek her bir deney plakası için 15 mililitrelik konik santrifüj tüpünde ana enzim karışımını hazırlayın. 162,1 mikrolitre ATP, 162,1 mikrolitre PEP ve 324,1 mikrolitre NADH çözeltisini birleştirerek her plaka için 15 mililitrelik konik santrifüj tüpünde ana substrat karışımını hazırlayın.
Toplama ve yağış önlemek için bu noktada aktin eklemeyin. Kalibrasyon için NADH yedi adımseri bir-iki seyreltme oluşturmak için, sekiz 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpleri hazırlayın. 250 mikromolar çözelti yapmak için ilk tüpte 257,7 mikrolitre miyozin tampon ile NADH stok çözeltisinin 12,3 mikrolitresini karıştırın.
Sonra kalan yedi tüpün her birine 135 mikrolitre miyozin tamponu yerleştirin. Çözeltinin 135 mikrolitresini ilk tüpten ikinci tüpe aktarın ve pipetleme ile karıştırın. Yedinci tüpulaşana kadar tekrarlayın.
Son tüpü yalnızca arabellekle NADH denetimi olmayan olarak kullanın. Bileşik plakalar üzerinde her zaman pozitif ve negatif kontroller ve analiz plakalarında kalibrasyon için NADH seyreltmeleri ekleyin. Bu denetimler, veri analizi sırasında yapıları tanımlamak için son derece önemlidir.
Sekiz kanallı pipet kullanarak, NADH kalibrasyon çözümlerinin 20 mikrolitresini bir analiz plakasındaki üç eritmelerde ilk sıraya aktarın. Şimdi enzim karışımına 4.2 mikrolitre iskelet kası miyozin II ekleyin. Girdap kısaca.
Dağıtımdan hemen önce enzim karışımına miyozin ekleyin. Seyreltilmiş miyozin çözeltilerinin uzun kuluçka yada konnesyonu yağış nedeniyle aktivite kaybına ve plastik yüzeylere spesifik olmayan bağlanmaya neden olabilir. Hazırlanan miyozin enzim karışımını otomatik bir dağıtıcının numune kaplarından birine yükleyin.
Plaka, ilk satır dışında, istin plaka her kuyuiçine miyozin enzim karışımı 8.4 mikrolitre dağıtmak. Daha sonra, 100 nanolitrelik iğne takım kafası ile donatılmış otomatik sıvı işleme sisteminin laboratuvar tutucu larının üzerine hesap plakasını ve bileşik plakayı yerleştirin. Daha sonra hazırlanan bileşik plakadan 100 nanolitre çözeltiyi analiz plakasına aktarmak için yazılımda uygun yöntemi çalıştırın.
Daha sonra, 1, 200 rpm oda sıcaklığında bir dakika sallamak için bir mikroplaka shaker üzerinde yüzer plaka yerleştirin. Kısaca substrat karışımı ve girdap için santrifüj aktin çözeltisi 4, 052 mikrolitre ekleyin. Enzimatik reaksiyonu başlatmak için, ilk sıra hariç, otomatik bir dağıtıcı kullanarak test plakasının her kuyusuna 11,6 mikrolitre actin substrat karışımı dağıtın.
Bir mikroplaka shaker, 1, 200 rpm oda sıcaklığında bir dakika için sayma plaka sıkışın. 30 saniye boyunca 101 kez g olarak yüzer plakayı santrifüj edin. Tahliller için 425 nanometre kesme dikroik ayna ile birlikte 380 nanometre, 10 nanometre bant genişliği uyarma filtresi ve 470 nanometre, 24 nanometre bant genişliği emisyon filtresi kullanın.
Tahlilleri çalıştırmadan önce yanıp söner sayısını, dedektör kazancını, plaka boyutlarını ve ölçüm yüksekliğini optimize edin. Ölçümü yüksek konsantrasyon modunda çalıştırın. Plaka okuyucusunun iç sıcaklığının 25 santigrat derecede stabilize olduğundan emin olun.
Plakayı plaka okuyucusuna yükleyin ve sıvı yüzeyin şeklini her kuyuda benzer hale getirmek ve plakanın ölçüm sıcaklığına ulaşmasını sağlamak için 30 saniye daha sallayın. Plakayı 45 saniyearalıklarla tarayıp NADH floresanını 30 dakika boyunca kaydedin. İhraç edilen verilerle, gözlenen floresan yoğunluğuher kuyu için zamana göre çizin.
Her kuyu için floresan yanıtlarının eğimini ve yolunu kesmek için basit doğrusal regresyon gerçekleştirin. Eğim, ATP tüketim oranının çok iyi bir yaklaşım olarak kullanılabilecek NADH tüketim oranı ile orantılıdır. Kesişme, ölçümün başındaki NADH konsantrasyonu ile orantılıdır.
Daha sonra, PLAKANıN ilk satırı için elde edilen kesitleri NADH konsantrasyonuna karşı çizerek NADH için bir kalibrasyon eğrisi oluşturun. Keserler başlangıçta ki gerçek floresan yoğunluklarını, başlangıçta okunan ham floresan yoğunluğunun ortalamasından çok daha fazla güvenle tahmin eder. NADH kalibrasyon hattının eğimini ve yolunu kesmek için basit doğrusal regresyon gerçekleştirin.
Burada, kesişmeler nadh bulunmayan floresan arka plan sinyalini açıklarken, eğim tek bir molar NADH çözeltisinin ekstrapolated teorik floresan yoğunluğuna karşılık gelir. Floresan değişikliklerini ATP tüketim oranlarına dönüştürmek için, nadh kalibrasyon hattının eğimi ile kuyuların geri kalanı için elde edilen floresan tepkisinin eğimini bölün. Daha sonra, ATP tüketim oranlarını inhibitörün konsantrasyonuna göre çizin.
İnhibitör sabitlerini belirlemek için, Origin 2017 gibi doğrusal olmayan eğri montajı yeteneğine sahip uygun istatistiksel yazılımları kullanın. Doz-yanıt verilerini basit bire bir bağlama denge modeline karşılık gelen kuadratik bir denkleme sığdıracak doğrusal olmayan eğriyi seçin. Y, ATP tüketim oranıdır.
Y-minimum inhibitör yokluğunda ATP tüketim oranıdır. Y-maksimum% 100 inhibisyonu teorik ATP tüketim oranıdır. t ve t sırasıyla miyozin enzimve inhibitörütoplam konsantrasyonu vardır.
KI inhibitör sabittir. Bu çalışmada, iskelet ve kardiyak kas miyozin II ATPase reaksiyonları kullanılan miyozin veya inhibitörlerin varlığıne bakılmaksızın doğrusal floresan yoğunluğu izleri gösterdi. Bazal ve aktin aktive ATPaz oranları iskelet veya kardiyak kas miyozin II.A tarama pencere katsayısı veya Z faktörü konsantrasyonu doğrusal bağımlılık gösterdi 0.78 çok iyi ayrılmış pozitif ve negatif kontroller ile güvenilir bir tsay gösterdi.
Blebbistatin, para-Aminoblebbistatin ve para-Nitroblebbistatin bildirilen çözünürlük değerlerinin altında veya altında düzenli doz-yanıt eğrileri gösterdi. Hem kardiyak hem de iskelet kası miyozin II'si için inhibitör sabitler, verilere basit bir denge bağlama modelini temsil eden kuadratik bir denklem intiyaca katarak belirlendi. İskelet kası miyozin II kullanılarak ATPase testinde elde edilen blebbistatin için floresan yoğunluk izleri mevcut inhibitör miktarına bağlı olarak normal doğrusal azalan sinyal gösterdi.
Ancak blebbistatin çözünürlüğünün üzerinde parlak floresan blebbistatin kristallerinin oluşumuna bağlı olarak sinyalde beklenmedik bir artış gözlenmiştir. Normal ham floresan şiddeti izleriyle para-Nitroblebbistatin durumunda, çözünürlüğü yukarıda elde edilen reaksiyon oranları yağış nedeniyle belirlenen doz-tepki eğrisinden saptı. Bu yöntemi kullanarak, temel araştırmalarda bilimsel araç olarak veya gelecekte doğrudan aday olarak kullanılabilecek yeni, güçlü ve seçici miyozin inhibitörleri geliştirdik.
Her zaman gerçek ve yanlış pozitif isabet ayırt etmek için ilgi enzim özgü farklı bir ATPase veya diğer fonksiyonel bir tsay kullanılması tavsiye edilir. Tüm proteinler plastik yüzeyleri bağlar. Bu sorun sonuçları oldukça etkileyebilir, özellikle protein düşük konsantrasyonlarda mevcutsa.
Her zaman gereksiz sıvı işleme kaçının ve bağlayıcı olmayan tüpler kullanın. Alternatif ATPAz tahlilleri genellikle sülfürik asit, toksik maddeler veya radyoaktif maddelerin işlenmesini gerektirir. Buna karşılık, NADH'a bağlı ATPase tsay ı sadece toksisiteye sahip veya çok düşük olan reaktifler gerektirir.
