Burada ayrıntılı olarak yapılan yeniden yapılanma ve füzyon protokolü, bir model lipid çift katmanlı ve füzyon proteinleri tarafından lipid karıştırma membran bağlı proteinler çalışma için etkili bir yoldur. Burada rekombinant Drosophila atlastin bir deterjan destekli reconstitution tarif, bir ER füzyon proteini, önceden biçimlendirilmiş fosfatidilkolin lipozomlar içine. Atlastin proteolipozomlarının füzyonu fret tabanlı lipid karıştırma testi ile ölçülür.
Deterjan destekli reconstitution önemli avantajlarından biri deterjan protein kurutma veya çözücüler maruz kalmamış olmasıdır. Ayrıca burada atlastinin yeniden yapılanma yöneliminin çok etkili olduğunu gösteriyoruz. FRET tabanlı lipid karıştırma testinin bir diğer avantajı da lipozomların herhangi bir boya ile yüklenmesi gerekmemesi ve ekstra çevirmeli adımlara gerek olmamasıdır.
Bu prosedürü başlatmak için, metin protokolünde belirtildiği gibi, kloroform lipid karışımı stokları hazırlamak. Lipid karışımları DPPC mililitre başına bir mikrocurie ekleyin, Bu stok en az sekiz mikrolitre rezerv emin olun. İstenilen miktarda lipid karışımlarını çakmaktaşı cam tüplere aktarın.
Daha sonra daha fazla kloroform görünür olana kadar yaklaşık 10 dakika boyunca azot gazı nazik bir akışı altında lipid karışımları kuru. Elde edilen lipid filmini 30 dakika vakumlayarak kurutucu bir kurutucuda kurutun. Bundan sonra, yeterli A100 ekleyin 10%gliserol, iki milimolar 2-mercaptoetanol, ve bir milimolar EDTA lipid film geri konsantrasyon getirmek için 10 milimolar.
Oda sıcaklığında 15 dakika hafifçe girdap yaparak lipid filmini yeniden askıya alın. Sıvı nitrojen de sulu lipidler dondurun. Lipozomları eritmek için, çözeltinin oda sıcaklığında 30 saniye oturmasına izin verin, daha hızlı erimeiçin suya geri aktarın.
Bu donma-çözülme döngüsünü toplam 10 kez tekrarlayın. Bundan sonra, polikarbonat filtreler aracılığıyla lipidler geçmek için bir mini ekstrüzyon kullanın, bir gözenek boyutu ile 100 nanometre, 19 kez. Lipozomların toplam lipid konsantrasyonunu belirlemek için, üç mililitre sintilasyon kokteyline dört mikrolitre lipid stoğu ve lizozom ekleyin.
Stok ve lipozomlar için dakika başına ortalama sayıları ölçün ve metin protokolünde belirtildiği gibi lipozom konsantrasyonu hesaplayın. Lipozomları bir haftaya kadar dört santigrat derecede saklayın. İlk olarak, metin protokolünde belirtildiği gibi, 0,5 mililitrelik bir tüpiçinde uygun miktarda tampon, ekstra deterjan ve proteini karıştırın.
Hızla lipozomlar ekleyin ve karışımı homojenize etmek için beş saniye boyunca hemen girdap. Reaksiyonu bir saat boyunca dört santigrat derecede bir nutator'da kuluçkaya yatırın. Bu kuluçka sırasında, polistiren adsorbent boncuk 0,2 gram tartmak ve bir mikrosantrifüj tüp aktarın.
Tüpe bir mililitre metanol ekleyin ve boncukları gazdan arındırmak için bir dakika karıştırın. Sonra, 21-gauge veya daha yüksek bir iğne ile metanol aspire. Boncukları yıkamaya başlamak için, onlara su ekleyin.
Boncuklar beş dakika suyla karışSın, sonra suyu aspire edin. Bu su yıkama işlemini dört kez tekrarlayın. Bundan sonra, mililitre başına 0,2 gram son konsantrasyonile, bir mililitre hacmine polistiren adsorbent boncuk bulamaç getirmek için su ekleyin.
Metin protokolünde belirtildiği gibi, her örnekteki tüm deterjanı adsorb etmek için gereken polistiren adsorbent boncuk miktarını hesaplayın. Boncuk bulamacı toplamak için bir pipet ucu kesin. Hesaplanan boncuk bulamacı miktarını 0,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve suyu aspire edin.
Örnekleri boncukları içeren tüpe ekleyin ve bir saat boyunca dört santigrat derecede bir nutator da kuluçkaya yatırın. Örnekleri yeni boncuklar içeren yeni bir tüpe aktarın, eski boncukları geride bıraktığından emin olun. Aynı koşulları kullanarak tekrar kuluçkaya yatırın.
Boncukları iki kez transfer etme ve kuluçkaya yatırma işlemini tekrarlayın. Bundan sonra, taze boncuk içeren yeni bir tüp için örnek aktarın ve dört santigrat derece bir gecede nutating tarafından kuluçka. Ertesi gün, çözünmez protein agregaları pelet 10 dakika boyunca 16, 000 kez g ve dört derece santigrat de boncuk ve santrifüj gelen örnek kaldırın.
Supernatant kurtarmak ve metin protokolünde belirtildiği gibi, sıvı sintillation sayma ile son lipid konsantrasyonunu belirlemek. Başlamak için, gliserol içeren A100 her 0.15 milimolar konsantrasyona donör ve kabul proteolipozomları getirmek, beta-mercaptoetanol, EDTA, ve magnezyum klorür. Floresan okuma için uygun düz bir 96-iyi plaka bir kuyuya her reaksiyon transfer, bir triplicate ve no-GTP negatif kontrol de dahil olmak üzere en az dört reaksiyonlar hazırlamak için emin olun.
Plakayı 37 derecede önceden ısıtılmış bir plaka okuyucusuna yerleştirin. NBD floresanını her dakika beş dakika ölçün. Sonra, füzyon ikna etmek için beş milimolar GTP ekleyin.
NBD floresanını her dakika bir saat boyunca ölçün, öncekiyle aynı uyarma ve emisyonuyguluyor. Bundan sonra, proteolipozomları eritmek için kuyulara %2,5 n-Dodecyl beta-D-maltoside beş mikrolitre ekleyin ve aynı uyarma ve emisyon kullanarak 15 dakika boyunca her dakika maksimum NBD floresanını ölçün. Bu çalışmada rekombinant Drosophila atlastin saflaştırılır ve önceden oluşturulmuş lipozomlar haline getirilir.
Atlastin reconstitution verimliliği bir iohexol kesintili gradyan yüzen repozolipozomlar tarafından belirlenir. Üst, orta ve alt degrade tabakalarının örnekleri hasat edilir ve SDS-PAGE ve Coomassie boyama ile analiz edilir. Jelin densitometri ile ölçülmesi, ihmal edilebilir kaybedilmelerle yeniden yapılanmanın çok yüksek bir verimini gösterir ve toplam proteinin %96'sı üst tabakada yüzen proteolipozomlar olarak bulunur.
Proteinin %1'inden azı yeniden oluşturulmaz ve orta tabakada bulunur ve sadece %3'ü yeniden oluşturulmaz veya biraraya ve alt tabakaya tortulanır. Reconstitution sonrası atlastin in oryantasyonu trombin dekolte stoyonları ile ölçülür. Örnekler SDS-PAGE ve Coomassie boyama ile analiz edilir ve densitometri ile ölçülür.
Yeniden yapılanan proteinlerin çoğu, sadece% 7 proteaz korunmaktadır, cleaved olduğunu. Kinetik ve atlastin aracılı proteolipozom füzyon ölçüde lipid karıştırma tahlilleri ile analiz edilir. Sıfır zaman noktasında GTP ile füzyona neden olmadan önce beş dakikalık bir kuluçka işlemi gerçekleştirilir.
Bir saat sonra, n-Dodecyl beta-D-maltoside proteolipossomes solubilize ve maksimum floresan rezonans transferi sürümü almak eklendi. Koşuda füzyon maksimum maksimum maksimum floresan% 11 olarak görülmektedir. Lipidler kloroformda çözünür.
Lipid karışımları hazırlarken, herhangi bir buharlaşma önlemek için, bir kimyasal başlık üzerinde, ve buz üzerinde, hızlı bir şekilde bunu yapmak için emin olun. Bir membran çapasının lipozom şekil ve boyut üzerindeki etkilerini görselleştirmek için atlastin proteolipozomlarını mikroskopi ile analiz etmek mümkündür. Bu yöntem, diğer membran bağlantılı proteinleri ve bir model lipid çift katmanlı nasıl nasıl bir şekilde çalışmak için genişletilmiştir.
Bu protokol lipid karışımları ölçmek için titre lipidler kullanır. Radyoaktif maddelerle çalışırken gerekli önlemleri almayı unutmayın.
