ここで詳述する再構成および融合プロトコルは、モデル脂質二重層および融合タンパク質による脂質混合における膜結合タンパク質を研究する効率的な方法である。ここでは、ER融合タンパク質である糖質ショウジョウバエ・アトラスチンを、前形ホスファチジルコリンリポソームに組み換えする洗剤支援再構成について説明する。次いで、アプラスチンプロテオリポソームの融合をFRET系脂質混合アッセイにより測定する。
洗剤支援再構成の主な利点の1つは、洗剤中のタンパク質が乾燥や溶剤にさらされないことです。また、ここで、アトラスチンの再構成の向きが非常に効率的であることを示す。FRETベースの脂質混合アッセイのもう一つの利点は、リポソームに染料をロードする必要がなく、余分な透析ステップを必要としないことです。
この手順を開始するには、テキストプロトコルで概説されているように、クロロホルムで脂質混合ストックを準備します。DPPCのミリリットル当たり1マイクロキュリーを脂質ミックスに加え、このストックの少なくとも8マイクロリットルを予約してください。必要な量の脂質をフリントガラスチューブに移します。
その後、クロロホルムが見えなくなるまで、窒素ガスの穏やかな流れの下で約10分間脂質混合物を乾燥させます。得られた脂質フィルムをさらにデシケータで30分間真空にして乾燥させます。この後、10%グリセロール、2ミリモル2-メルカプトエタノール、および1ミリモルEDTAを用いて十分なA100を脂質フィルムに加え、濃度を10ミリモルに戻します。
室温で15分間軽く渦を出して脂質膜を再懸濁する。水和した脂質を液体窒素中で凍結します。リポソームを解凍するには、溶液を室温で30秒間座らせ、水に戻してより速い解凍を行います。
この凍結融解サイクルを合計 10 回繰り返します。この後、100ナノメートル、19倍の細孔サイズで、ポリカーボネートフィルターを介して脂質を渡すためにミニ押出機を使用してください。リポソームの総脂質濃度を決定するには、4マイクロリットルの脂質ストックとリソソームを3ミリリットルのシンチレーションカクテルに加えます。
テキストプロトコルで概説されているように、ストックとリポソームの1分あたりの平均カウントを測定し、リポソーム濃度を計算します。リポソームは摂氏4度で1週間保存します。まず、テキストプロトコルで概説されているように、適切な量のバッファー、余分洗剤、およびタンパク質を0.5ミリリットルのチューブに混ぜます。
迅速にリポソームを添加し、すぐに5秒間渦を加えて混合物を均質化する。反応を摂氏4度で1時間インキュベートします。このインキュベーション中に、0.2グラムのポリスチレン吸着剤ビーズを計量し、マイクロ遠心チューブに移します。
チューブに1ミリリットルのメタノールを加え、1分間混ぜてビーズを脱気します。次いで、21ゲージ以上の針でメタノールを吸引する。ビーズの洗浄を開始するには、それらに水を追加します。
ビーズを水と5分間混ぜ、水を吸い込みます。この水洗プロセスを4回繰り返します。この後、水を加えて、ポリスチレン吸着ビーズスラリーを1ミリリットルの体積に持ち込み、最終濃度は1ミリリットルあたり0.2グラムです。
テキストプロトコルで概説されているように、各サンプルのすべての洗剤を吸着するために必要なポリスチレン吸着剤ビーズの量を計算します。ピペットチップを切ってビーズスラリーを回収します。計算されたビーズスラリーの量を0.5ミリリットルチューブに移し、水を吸引します。
ビーズを含むチューブにサンプルを加え、1時間摂氏4度でヌテーターでインキュベートします。新しいビーズを含む新鮮なチューブにサンプルを転送し、古いビーズを残すことを確認します。同じ条件を使用して再度インキュベートする。
このビーズの移入とインキュベートを2回繰り返します。この後、新鮮なビーズを含む新しいチューブにサンプルを移し、摂氏4度で一晩をヌートしてインキュベートします。翌日、ビーズと遠心分離機から16,000回gと摂氏4度で10分間サンプルを取り出し、不溶性タンパク質凝集体をペレット化します。
上清を回収し、テキストプロトコルに概説されているように、液体シンチレーション計数によって最終的な脂質濃度を決定する。まず、ドナーとアクセプタープロテオリポソームをグリセロール、β-メルカプトエタノール、EDTA、塩化マグネシウムを含むA100のそれぞれ0.15ミリモルの濃度に持って来てください。蛍光読み取りに適した平らな96ウェルプレート内のウェルに各反応を移し、三重およびノーGTP陰性対照を含む少なくとも4つの反応を準備することを確認する。
プレートを摂氏37度の予熱プレートリーダーに入れなさい。NBD蛍光を毎分5分間測定します。次いで、5ミリモルGTPを加え、融合を誘導する。
以前と同じ励起と放出を使用して、1時間毎分NBD蛍光を測定します。その後、2.5%の5マイクロリットルを添加し、2.5%-ドデシルβ-D-マルトシドをウェルに加えてプロテオリポソームを溶解し、同じ励起と発光を使用して1分毎に最大蛍光を測定します。本研究では、組換えショウジョウバエアトラスチンを精製し、予め形成されたリポソームに再構成する。
アブラスチン再構成の効率は、イオヘキソール不連続勾配における浮遊再構成されたプロテオリポソームによって決定される。上、中央、下の勾配レイヤーのサンプルは、SDS-PAGEとクマシー染色によって収穫され、分析されます。デンシトメトリーによるゲルの定量化は、極めて小さな損失で再構成の非常に高い効率を示し、全タンパク質の96%が最上層に浮遊するプロテオリポソームとして見つかっています。
タンパク質の1%未満は再構成されず、中間層に見られ、3%だけが再構成されていないか、または凝集し、底層に沈沈入されます。再構成後のアプラスチンの向きはトロンビン切断アッセイにより定量される。サンプルはSDS-PAGEとクマシー染色で分析され、デンシトメトリーで定量されます。
再構成されたタンパク質のほとんどは切断され、プロテアーゼから保護されているのはわずか7%です。キネティクスとアプラスチン媒介プロテオリポソーム融合の程度は、脂質混合アッセイによって分析される。ゼロタイムポイントでGTPとの融合を誘発する前に5分間のインキュベーションが行われます。
1時間後、n-ドデシルβ-D-マルトシドを添加してプロテオリポソームを可溶化し、最大蛍光共鳴伝達放出を得た。ランにおける融合の最大値は、最大蛍光の11%であることが分かる。脂質はクロロホルムに溶解する。
脂質混合を準備するときは、蒸発を避けるために、化学フードと氷の上で、迅速にこれを行うことを確認してください。顕微鏡法によりアプラスチンプロテオリポソームを解析し、膜アンカーがリポソームの形状や大きさに及ぼす影響を可視化することが可能です。この方法は、他の膜固定タンパク質とモデル脂質二重層でどのように振る舞うかを研究するために拡張されました。
このプロトコルは、脂質の混合物を定量化するために滴定脂質を使用します。放射性物質を扱う際には、必ず必要な予防措置を講じてください。
