بروتوكول إعادة تشكيل والانصهار مفصلة هنا هو وسيلة فعالة لدراسة البروتينات المرتبطة بالغشاء في ثنائي الدهون نموذج وخلط الدهون عن طريق البروتينات الانصهار. هنا نصف إعادة تشكيل بمساعدة المنظفات من الدوزوفيليا أطلستين المؤتلف، وهو بروتين الانصهار ER، في ليبوسومات فوسفاتيديل كولين سابقة. ثم يتم قياس الانصهار من البروتيوليبوسات أطلستين من قبل مقايسة خلط الدهون القائم على فريت.
واحدة من المزايا الرئيسية لإعادة تشكيل بمساعدة المنظفات هو أن البروتين في المنظفات لا يتعرض للتجفيف أو المذيبات. كما نظهر هنا أن إعادة تشكيل اتجاه أطلستين فعال للغاية. ميزة أخرى من المقايسة الدهون الاختلاط فريت القائم هو أن liposomes لا تحتاج إلى أن تكون محملة بأي صبغة، وليس هناك حاجة لأي خطوات dialyses إضافية.
لبدء هذا الإجراء، وإعداد الأسهم مزيج الدهون في الكلوروفورم، كما هو مبين في بروتوكول النص. إضافة ميكروكوري واحد لكل ملليلتر من DPPC إلى يمزج الدهون، مع التأكد من حجز ما لا يقل عن ثمانية ميكرولترات من هذا المخزون. نقل المبلغ المطلوب من الدهون يمزج في أنابيب الزجاج الصوان.
ثم يجف الدهون يمزج تحت تيار لطيف من غاز النيتروجين لمدة 10 دقائق تقريبا حتى لا يكون أكثر من الكلوروفورم مرئية. تجفيف الفيلم الدهون الناتجة كذلك في desiccator عن طريق كنس لمدة 30 دقيقة. بعد هذا، إضافة ما يكفي A100 مع 10٪ الجلسرين، 2-mercaptoethanol 2-ميليمولار، وEDTA واحد ميليمولار إلى فيلم الدهون لإعادة التركيز إلى 10 ملليمولار.
Resuspend فيلم الدهون من خلال دوامة طفيفة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تجميد الدهون رطب في النيتروجين السائل. لإذابة الدهون، والسماح للمحلول الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية، ثم نقلها مرة أخرى إلى الماء لذوبان أسرع.
كرر هذه الدورة تجميد ذوبان ما مجموعه 10 مرات. بعد هذا، استخدم طارد صغير لتمرير الدهون من خلال مرشحات البولي، مع حجم المسام من 100 نانومتر، 19 مرة. لتحديد تركيز الدهون الكلي للليبوسومات، إضافة أربعة ميكرولترات من الأسهم الدهون وlysosomes إلى ثلاثة ملليلتر من كوكتيل التلألؤ.
قياس متوسط عدد في الدقيقة للمخزون والليبوسومات، وحساب تركيز الليبوزومات، كما هو مبين في بروتوكول النص. تخزين الليبوزومات في أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. أولاً، اخلط الكمية المناسبة من العازلة، والمنظفات الإضافية، والبروتين في أنبوب 0.5 ملليلتر، كما هو موضح في بروتوكول النص.
إضافة بسرعة liposomes، ودوامة فورا لمدة خمس ثوان لتجانس الخليط. احتضان رد الفعل في nutator في أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة. خلال هذا الحضانة، تزن بها 0.2 غرام من حبات الممتزات البوليسترين ونقلها إلى أنبوب microcentrifuge.
إضافة ملليلتر واحد من الميثانول إلى الأنبوب، ويخلط لمدة دقيقة واحدة لفك حبات. ثم، pirate الميثانول مع إبرة قياس 21 أو أعلى. للبدء في غسل الخرز، إضافة الماء لهم.
دع الخرز يخلط بالماء لمدة خمس دقائق، ثم استلهم الماء. كرر عملية غسل المياه هذه أربع مرات. بعد ذلك، إضافة الماء لجلب الطين حبة الممتز البوليسترين إلى حجم ملليلتر واحد، مع تركيز النهائي من 0.2 غرام لكل ملليلتر.
حساب كمية من حبات الممتزة البوليسترين اللازمة لامتزاز جميع المنظفات في كل عينة، كما هو مبين في بروتوكول النص. قطع تلميح ماصة لجمع الطين حبة. نقل كمية محسوبة من الطين حبة إلى أنبوب 0.5 ملليلتر، وpireate الماء.
إضافة العينات إلى أنبوب يحتوي على الخرز، واحتضان في nutator في أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة. نقل العينات إلى أنبوب جديد يحتوي على حبات جديدة، والتأكد من ترك الخرز القديم وراء. احتضان مرة أخرى باستخدام نفس الشروط.
كرر هذه العملية لنقل واحتضان الخرز مرتين. بعد ذلك، نقل العينة إلى أنبوب جديد يحتوي على الخرز الطازجة واحتضان عن طريق اللحوم بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. في اليوم التالي، وإزالة العينة من الخرز والطرد المركزي في 16،000 مرات ز وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق ل بيليه مجاميع البروتين غير قابلة للذوبان.
استرداد افرانت، وتحديد تركيز الدهون النهائي عن طريق عد التلألؤ السائل، كما هو مبين في بروتوكول النص. للبدء، وجلب المتبرع والمتقبل بروتيوليبوسسومات إلى تركيز 0.15 ملليمولار كل في A100 التي تحتوي على الجلسرين، بيتا ميركاتوباتينول، EDTA، وكلوريد المغنيسيوم. نقل كل رد فعل إلى بئر في لوحة مسطحة 96-well مناسبة لقراءة الفلوريسنس، مع التأكد من إعداد ما لا يقل عن أربعة ردود فعل، بما في ذلك ثلاثية الاحتياز وعدم السيطرة السلبية GTP.
ضع اللوحة في قارئ لوحة محمّى مسبقًا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. قياس الفلورية NBD كل دقيقة لمدة خمس دقائق. ثم، إضافة جي تي بي خمسة ملليمتر للحث على الانصهار.
قياس الفلورية NBD كل دقيقة لمدة ساعة واحدة باستخدام نفس الإثارة والانبعاثات كما كان من قبل. بعد ذلك، إضافة خمسة ميكروليتر من 2.5٪ ن-Ddecyl بيتا-D-مالتوسايد إلى الآبار إلى حل proteoliposomes، وقياس أقصى الفلوري NBD كل دقيقة لمدة 15 دقيقة باستخدام نفس الإثارة والانبعاثات. في هذه الدراسة، يتم تنقية الدوزوفيليا أطلستين المؤتلف وإعادة تشكيلها في ليبوسومات مسبقة.
يتم تحديد كفاءة إعادة تشكيل أطلستين بواسطة proteoliposomes العائمة المعاد تشكيلها في التدرج iohexol discontinuous. يتم حصاد عينات من طبقات التدرج العلوي والمتوسط والسفلي وتحليلها بواسطة SDS-PAGE وCoomassie تلطيخ. يظهر القياس الكمي للجل حسب قياس الكثافة كفاءة عالية جدًا في إعادة التشكيل مع فقدان لا يذكر ، مع وجود 96٪ من إجمالي البروتين كبروتوليوبوسومات التي تطفو على الطبقة العليا.
أقل من 1٪ من البروتين غير مستردة وجدت في الطبقة الوسطى، وفقط 3٪ غير مستردة أو تجميعها وترسبات إلى الطبقة السفلية. يتم تحديد كمية اتجاه أطلستين بعد إعادة تشكيلها عن طريق مقايسات الانقسام ثرومبين. يتم تحليل العينات مع SDS-PAGE وCoomassie تلطيخ وكميا حسب قياس الكثافة.
يتم شق معظم البروتين المعاد تشكيله، مع 7٪ فقط محمية من البروتياز. يتم تحليل الحركية ومدى الانصهار البروتوليوبوسوم بوساطة أطلستين عن طريق مقايسات خلط الدهون. يتم تنفيذ حضانة لمدة خمس دقائق قبل تحفيز الانصهار مع GTP عند نقطة الصفر.
بعد ساعة واحدة، تمت إضافة n-Dodecyl beta-D-maltoside إلى solubilize proteoliposomes والحصول على الحد الأقصى لإصدار نقل الرنين الفلوري. ويعتبر الحد الأقصى للاندماج في المدى أن يكون 11٪ من الفلورس القصوى. يتم حل الدهون في الكلوروفورم.
عند إعداد خلطات الدهون، تأكد من القيام بذلك بسرعة، على غطاء محرك السيارة الكيميائية، وعلى الجليد لتجنب أي تبخر. فمن الممكن لتحليل proteoliposomes أطلستين عن طريق المجهر لتصور آثار مرساة غشاء على شكل liposome وحجم. وقد تم توسيع نطاق هذه الطريقة لدراسة البروتينات الأخرى الراسية الغشاء وكيف تتصرف في ثنائي الدهون نموذج.
يستخدم هذا البروتوكول الدهون المُقَدّمة لقياس خلطات الدهون. تأكد من اتخاذ الاحتياطات اللازمة عند العمل مع المواد المشعة.
