Kombine yaklaşımımız, rahimde yeni doğan sinir sistemine yapılan erken gelişimsel müdahaleler den sonra ultrastrüktost nöroplastisite parametrelerinin nasıl değiştiğini yanıtlamaya yardımcı olur. Yöntemimizin en büyük avantajı, makro-meso-mikro-ve nanoyapıların yüksek çözünürlüklü görüntülerinin doku atlası içinde önceden tanımlanmış koordinat sisteminde elde edilmesidir. Yöntemimizin anlamı konjenital nörodejeneratif hastalıklar için çevirisel tedavi potansiyelidir.
Örneğin, tedavi ve embriyonik aşamalarında kurtarma rahim transdüksiyon tekniği nde bu kullanarak. Yöntemimiz başka bir modele uygulanabilir. Örneğin, fare türleri ve ilgi alanı değiştirilebilir.
Metodumuzu ilk kez deneyen araştırmacılar, derin cerrahi eğitime ve elektron mikroskobik görüntülemeye nasıl hazırlanacağı konusunda bilgiye ihtiyaç duyarlar. İstenilen hedef için adeno ile ilişkili virüs tip 1 kaplamanın 11 viral partikülsi için dört kez 10 içeren özelleştirilmiş bir kılcal uç yükleyerek başlayın ve bir aspiratör tüpü üzerine Hızlı Yeşil boya ile etiketlendi. Kılcal damar içine etiketli adeno ilişkili virüs parçacıkları 15 mikrolitre ekleyin.
Daha sonra, anestezi embriyonik gün 14,5 hamile fare de parmak sıkışma yanıt eksikliği onaylamak ve cildi dezenfekte. Linea mediana boyunca bir deri kesi yapmak için kavisli tırtıklı iris forceps ve düz tungsten karbür makas kullanın. Periton duvar kavrama düz Dumont cımbız kullanarak, düz Vannas makas ile linea alba boyunca devam ve karın açıklığı üzerinde fenestrated parafin film bir parça yerleştirin ve boynuzları içinde embriyolar zarar vermeden rahim boynuzları ortaya çıkarmak için bir kaşık gibi cihaz kullanın.
Rahim boynuzları üzerine 37 derecelik Santigrat PBS birkaç damla uyguladıktan sonra, rahim kesesi içinde hasar veya malformasyonlar için embriyolar kontrol edin. Her enjeksiyon için istenilen pozisyon elde edilene kadar embriyoları keselerinin içine dikkatlice çevirin. Embriyolar yerleştirildiğinde, her embriyoya Fast Green etiketli virüs parçacık çözeltisinin bir ila iki mikrolitresini enjekte edin.
Tüm embriyolar enjekte edildikten sonra, karın boşluğuna rahim boynuzları geri yerleştirin ve karın içine 37 derece-Celsius PBS birkaç damla ekleyin. Daha sonra periton duvarını ve poliamidi 3-0 boyutlu sütürleri ve Halsted'in Sivrisinek hemostatik forceps'larını kapatmak için poliamid 6-0 boyutlu dikişler kullanın. Tele-makro fotoğrafçılık için ilgi izole dokular gömmek için, tekrarlanabilir kesit açısı ile özel bir çerçeve içine doku örneği yerleştirin ve koordinatları belgeleyin.
Çerçeveyi doku kapalana kadar %3 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 Agarose sertleşirken, çerçeve içinde gömülü dokuyu ve koordinatlarını görüntülemek için tele-makro grafik cihazını kullanın. Agarose katılaşmış olduğunda, agarose gömülü doku ilk çerçevenin koordinatlarına karşılık gelen kesme boşlukları ile çerçeve içine aktarın.
Uygun bir deneysel kalınlıkta bölümler halinde gömülü doku kesmek için ince ve titreşimli jilet ile bir cihaz kullanın. Ardından PBS'deki her doku bölümünü görüntüleyin ve görüntüleri bir klasöre toplayın. Iletim elektron mikroskobu için doku örneklerini hazırlamak için, biyogüvenlik dolabında, pbs iki 30 dakikalık yıkar ile doku bölümleri yıkayın, oda sıcaklığında% 2 sulu osmiyum tetroksit çözeltisi iki saatlik kuluçka takip.
Kuluçka sonunda, salınımlı bölümleri PBS'de yıkama başına 30 dakika daha iki kez yıkayın ve belirtildiği gibi sıralı 10 ila 15 dakikalık etanol daldırmadaki bölümleri susuz bırakın. %70 etanol daldırma sonra, mat siyah bir arka plan üzerinde siyah bir çanak içine her örnek yerleştirin ve 45 derecelik açılarda sol ve sağ taraftan örneklere uygulanan LED RGB ışığı altında% 70 etanol örnekleri görüntü. Bir klasörde seri örneklerin görüntülerini toplayarak koordinatları ile bölüm görüntülerinin bir atlasoluşturun.
Numuneleri iki adet 30 dakikalık 100%etanol kuluçkasıyla tedavi edin, ardından oda sıcaklığında iki adet 30 dakikalık %100 propilen oksit kuluçkaları. Numuneler kuluçkaya yatarken, taze hazırlanmış reçine ile propilen oksitile bire bir ve bire iki oranlarda karıştırın ve her iki çözüme de %3 hızlandırıcı ekleyin. İkinci propilen oksit kuluçkasonra, oda sıcaklığında iki saat boyunca bir-iki reçine propilen oksit gömme orta çözelti içine örnekleri aktarın, oda sıcaklığında bir-bir reçine propilen oksit gömme orta çözelti iki saatlik kuluçka izledi.
İkinci kuluçka sonunda, düz polipropilen yemekler içine dokuların transferi ve 65 ila 85 santigrat derece 12 ila 24 saat boyunca% 3 hızlandırıcı içeren taze reçine ile gömülü dokuları tedavi. Daha sonra dokuyu oda sıcaklığında soğutun ve polipropilen tabaklardan reçine gömülü numuneleri çıkarın. İlgi alanının haritasını çıkarmak için, önceden hazırlanmış görüntü atlasından ilgi alanını içeren bir resim seçin.
İlgi alanının sınırlarını kesitli görüntüye çizin, bu sınırları mikroskop altındaki gömülü numuneye optik olarak üst üste bindirin ve bu bölge sınırlarını reçine numunesine kazımak için 1inç 26 gauge iğne kullanın. Daha sonra, resin yumuşatmak için numuneleri 95 dereceye ısıtın. Daha sonra, sıcak resenin örneklerini fırından çıkarın ve ilgi alanlarını çıkarmak için jilet kullanın.
Numuneleri uygun kalibredeki akrilik cam tutma çubuklarına yapıştırın ve yarı ve ultra ince kesitler için monte edilmiş numuneleri kesin. Yarı ince 0,7 mikrometre ve ultra ince 70 nanometre bölümleri elde etmek için ultramikrotom kullanın, cam taşıyıcılar üzerinde yarı ince bölümleri ve nikel ızgaraları üzerinde ultra ince bölümleri toplama. Işık mikroskobu ile bölümleri incelemeden önce, pbs%1 Toluidin mavisi ile yarı ince kesitleri dört dakika boyunca lekeleyin, ardından deiyonize suda birkaç yıkıntı lar.
Ultra ince kesitler daha sonra daha fazla değişiklik yapılmadan 180 kilovolt cinsinden iletim elektron mikroskobu ile doğrudan değerlendirilebilir. Kesitten sonra doku dilimleri tele-makro fotoğrafçılık la görüntülenir. Osmication ve etanol daldırma sonra, kesitler girişim ışık tele-macrography ile tekrar görüntülenir, her doku yüzeyi için özel renkli bir desen ortaya.
Ek dehidratasyon ve reçin katıştırma sonra, ilgi alanları seçilir ve iletim elektron mikroskobu için daha fazla işlenir. Hipokampus ve serebellum, yosunlu lif sinapsları diğer sinapslar ile karşılaştırıldığında benzersiz ultrayapısal özellikleri sergilemek için bilinen, büyük presinaptik boutons dahil. Onların kesit profillerinde, boutons veziküller ve mitokondri çok sayıda içeren, ve çok sık birkaç dendritik dikenler içine.
Omurilik, dorsal funiculus oligodendroglia tarafından miyelinated birçok aksonal lifler içerir. Transversal kesitlerde, dorsal funiculus omuriliğin her iki arka boynuzu arasında bulunabilir. İletim elektron mikroskobu görüntülerinde kesitli miyelinatlı aksonlar yuvarlak görünür ve aksonlari çevreleyen miyelin kılıfları lamellae'de düzenlenir.
Ultrastrüktürel parametrelerin hazırlanan atlası ve mikrografik iletim elektron mikroskobu görüntüleri sadece farklı tedavi koşullarında farklı bölümlerin morfolojik nöroplastiplastisinin karşılaştırılmasında değil, aynı alan daki parametreler arasındaki karşılaştırmalarda da yararlıdır. Rahim transdüksiyonuna başlamadan önce iyice planlamayı ve hazırlamayı ve komplikasyon durumunda malzeme ve aletlerin yedekine sahip olduğundan emin olmayı unutmayın. Metodumuzu takiben, tanımlanmış bir ilgi molekülünün ultrastrüktürsel takibi için elektron mikroskobundan önce immünoaltın etiketleme gibi başka teknikler de eklenebilir.
Tüm organizmanın bütünsel bir görünümü ile başlayarak ve moleküler topografya doğru yakınlaştırma, biz çalışma ve doku fonksiyonu ve morfoloji arasındaki ilişkiyi manipüle edebiliyoruz. Osmiyum tetroksit tehlikelidir. Her zaman kaputun altında çalıştığından emin olun ve bu reaktifle çalışırken koruyucu gözlük ve el eldiveni takın.
