我们的联合方法有助于回答超结构神经可塑性参数在子宫内新生神经系统的早期发育干预后如何变化。我们方法的主要优点是获取组织图集中预定义坐标系中宏-中微和纳米结构的高分辨率图像。我们的方法的含义是它对先天性神经退行性疾病的转化治疗潜力。
例如，在胚胎阶段的治疗和抢救，在子宫转导技术中使用这种治疗和抢救。我们的方法可以应用于任何其他模型。例如，可以更改小鼠物种以及感兴趣的区域。
首次尝试我们方法的研究人员需要深入的手术训练，以及如何为电子显微成像组织做准备的知识。首先，将含有四倍10的定制毛细管尖端装到11种与腺相关的病毒1型涂层的病毒颗粒，用于所需目标，并贴上快速绿色染料的标签到吸气管上。在毛细管中加入15微升标记的腺相关病毒颗粒。
接下来，确认在麻醉胚胎14.5怀孕小鼠中对头趾捏没有反应，并对皮肤进行消毒。使用弯曲锯齿状虹膜钳和直钨硬质合金剪刀，使皮肤切口沿线膜介质。使用直杜蒙钳子抓住腹膜壁，继续沿着线阿尔巴与直Vannas剪刀，并放置一块芬斯特石蜡膜在腹部开口，并使用勺子状装置暴露子宫角，而不会损害角内的胚胎。
在子宫角上涂抹几滴37摄氏度的PBS后，检查胚胎的子宫囊内有无损伤或畸形。将胚胎小心地在囊内转动，直到达到每次注射所需的位置。当胚胎就位时，将一到两个微升的快速绿色标记病毒颗粒溶液注入每个胚胎。
所有胚胎注射后，将子宫角放回腹腔，并在腹部加入几滴37摄氏度的PBS。然后使用聚酰胺 6-0 大小的缝合线关闭内面壁和聚酰胺 3-0 大小的缝合线和 Halsted 的蚊子止血钳关闭皮肤。要嵌入远程微距摄影感兴趣的孤立组织，请将组织样本放入具有可重现剖面角度的特殊框架中，并记录坐标。
用30摄氏度3%的加糖填充框架，直到组织被覆盖，用塑料盖盖住框架，直到加糖硬化。当红糖变硬时，使用远程宏图形设备对框架内的嵌入式组织及其坐标进行成像。当阿加罗斯凝固后，将加糖嵌入的组织转移到框架中，并具有与第一帧坐标对应的切削间隙。
使用具有薄振动剃须刀刀片的设备，将嵌入的组织切割成适当实验厚度的部分。然后在 PBS 中对每个组织部分进行图像图像，然后将图像收集到文件夹中。为了准备传输电子显微镜的组织样本，在生物安全柜中，用两次30分钟的PBS洗涤组织部分，随后在室温下用2%水性三氧化二氮溶液进行两小时的孵育。
在孵育结束时，每次洗涤在PBS中清洗两次，洗涤30分钟，然后按指示连续10至15分钟乙醇浸入液脱水。70%乙醇浸入后，将每个样品放入一个黑色的盘中，在LED RGB灯下以70%乙醇成像样品，以45度角从左右两侧对样品进行应用。通过收集文件夹中的序列样本图像，创建具有坐标的剖面图像图集。
用两个30分钟100%乙醇孵化来处理标本，然后两个30分钟100%丙烯氧化物孵育，均在室温下。当样品孵育时，以一对一和一对二的比例将新鲜准备好的树脂与氧化丙烯混合，并在两种溶液中加入3%的加速器。第二次丙烯氧化物孵育后，将样品转移到一至二树脂丙烯氧化物嵌入介质溶液中，在室温下两小时，随后在室温下将一对一树脂丙烯氧化物嵌入介质溶液中孵育两小时。
在第二次孵育结束时，将组织转移到扁平聚丙烯培养皿中，并在65至85摄氏度下用含有3%加速器的新鲜树脂固化嵌入组织，12至24小时。然后将组织冷却至室温，然后从聚丙烯盘上去除树脂嵌入的试样。要映射感兴趣区域，请从以前准备的图像图集中选择包含感兴趣区域的图像。
将感兴趣区域的边界绘制到剖面图像上，光学地将这些边界叠加到显微镜下的嵌入式试样上，并使用一英寸 26 量表针将这些区域边界划到树脂试样上。然后，将样品加热到 95 摄氏度，以软化树脂。接下来，从烤箱中取出温暖的树脂样品，并使用剃刀刀片来切除感兴趣的区域。
将试样粘附在适当口径的丙烯酸玻璃固定杆上，并修剪安装的试样，进行半薄和超薄的分切。使用超微子获取半薄 0.7 微米和超薄 70 纳米部分，收集玻璃载体上的半薄部分和镍栅格上的超薄部分。在 PBS 中用 1% 的托卢伊丁蓝色染色半薄部分 4 分钟，随后在去维化水中多次洗涤，然后通过光显微镜检查部分。
然后，通过180千伏的透射电子显微镜直接评估超薄部分，无需进一步修改。切片后，组织切片通过远程微距摄影进行成像，正如刚刚演示的。在渗透和乙醇浸入后，通过干扰光远程扫描再次对各部分进行成像，为每种组织表面显示一种特定颜色的图案。
在额外的脱水和树脂嵌入后，选择感兴趣的区域，并进一步处理传输电子显微镜。在海马和小脑中，与其他突触相比，青苔纤维突触表现出独特的超结构特性，包括大型前突触。在他们的横截面剖面剖面图中，这些牙带含有大量的囊泡和线粒体，并且经常包围几个树突状的脊椎。
在脊髓中，后脑膜含有许多由寡头纤维制成的斧质纤维。在横向部分，可以在脊髓的两个后角之间找到背角。在传输电子显微镜图像上，横截面髓轴子出现圆形，轴子周围的骨髓护套被组织在拉梅莱。
编制的图集和超结构参数的微图传输电子显微镜图像，不仅有助于比较不同处理条件下不同部分的形态神经可塑性，而且有助于同一区域内参数的比较。请记住，在开始子宫转导之前，要进行彻底的计划和准备，并确保在出现并发症时有材料和仪器的备份。按照我们的方法，可以添加其他技术，如电子显微镜前的免疫金标签，用于对感兴趣的特定分子进行超结构跟踪。
从整个生物体的整体视图开始，并放大分子地形，我们能够研究和操纵组织功能和形态之间的关系。三氧化二氮是危险的。使用这种试剂时，请务必在发动机罩下工作，并戴上防护眼镜和手手套。
