הגישה המשולבת שלנו מסייעת לענות על האופן שבו פרמטרים אולטרה-מבניים של נוירופלסטיות משתנים לאחר התערבויות התפתחותיות מוקדמות למערכת העצבים המתהווה ברחם. היתרון העיקרי של השיטה שלנו הוא רכישת תמונות ברזולוציה גבוהה של מקרו-מזו-מיקרו וננו-מבנים במערכת הקואורדינטות המוגדרת מראש בתוך אטלס רקמה. המשמעות של השיטה שלנו היא הפוטנציאל הטיפולי התרגומי שלה למחלות ניווניות מולדות.
לדוגמה, טיפול והצלה בשלבים עובריים באמצעות זה בטכניקת השכפול ברחם. השיטה שלנו יכולה להיות מיושמת על כל מודל אחר. לדוגמה, ניתן לשנות את מיני העכברים, כמו גם את תחום העניין.
חוקרים המנסים את השיטה שלנו בפעם הראשונה זקוקים להכשרה כירורגית מעמיקה, כמו גם את הידע כיצד להכין את הרקמה להדמיה מיקרוסקופית אלקטרונים. התחל על ידי טעינת קצה נימי מותאם אישית המכיל ארבע פעמים 10 ל 11 חלקיקים ויראליים של ציפוי סוג וירוס הקשורים אדנו 1 עבור היעד הרצוי, ותיוג עם צבע ירוק מהיר על צינור שאפתן. הוסף 15 microliters של חלקיקי וירוס הקשורים אדנו שכותרתו לתוך נימי.
לאחר מכן, לאשר חוסר תגובה קמצוץ בוהן ביום עוברי הרדמה 14.5 עכבר בהריון, ולחטא את העור. השתמש מטלחי איריס משוננים מעוקל ומספריים קרביד טונגסטן ישר לעשות חתך בעור לאורך linea mediana. באמצעות פינצטה ישרה Dumont לאחוז בקיר peritoneal, להמשיך לאורך אלבה linea עם מספריים ואנה ישר ולה מניחים חתיכת סרט פרפין fenestrated מעל פתח הבטן ולהשתמש במכשיר דמוי כפית כדי לחשוף את קרני הרחם מבלי לפגוע בעוברים בתוך הקרניים.
לאחר החלת כמה טיפות של PBS 37 מעלות צלזיוס על קרני הרחם, לבדוק את העוברים לנזק או מומים בתוך הסק הרחם. להפוך את העוברים בזהירות בתוך השק שלהם עד המיקום הרצוי עבור כל זריקה מושגת. כאשר העוברים נמצאים במקום, להזריק אחד עד שני microliters של פתרון חלקיקי וירוס מסומן ירוק מהיר לתוך כל עובר.
לאחר שכל העוברים הוזרקו, מניחים את קרני הרחם בחזרה לחלל הבטן, ומוסיפים כמה טיפות של PBS 37 מעלות צלזיוס לתוך הבטן. לאחר מכן השתמשו בתפרים בגודל פוליאמיד 6-0 כדי לסגור את הקיר הצפק ותפרים בגודל פוליאמיד 3-0 ומטלות המוסטטיות יתושים של Halsted כדי לסגור את העור. כדי להטמיע רקמות מבודדות המעוגלות בצילום טל-מאקרו, מקם את דגימת הרקמה במסגרת מיוחדת עם זווית ההשתנה המתרבה ותעד את הקואורדינטות.
ממלאים את המסגרת במכסה פלסטיק ב-30 מעלות צלזיוס עד שהרקמות מכוסות, ומכסים את המסגרת במכסה פלסטיק עד שהתעוררותה מתקשה. בזמן שהתעוררות מתקשה, השתמש בהתקן הגרפי tele-macro כדי לדמיין את הרקמה המוטבעת ואת הקואורדינטות שלה בתוך המסגרת. כאשר התעוררות התגבשה, להעביר את הרקמה מוטבעת אגרוז לתוך המסגרת עם פערי חיתוך המתאימים הקואורדינטות של המסגרת הראשונה.
השתמש במכשיר עם סכין גילוח דק ורוטט כדי לחתוך את הרקמה המוטבעת לחלקים של עובי ניסיוני מתאים. לאחר מכן דמיין כל מקטע רקמה ב- PBS, ואסוף את התמונות לתיקיה. כדי להכין את דגימות הרקמה עבור מיקרוסקופ אלקטרונים שידור, בארון biosafety, לשטוף את חלקי הרקמה עם שתי שטיפות 30 דקות PBS, ואחריו דגירה של שעתיים בתסת פתרון 2% אוסמיניום tetroxide מים בטמפרטורת החדר.
בסוף הדגירה, לשטוף את החלקים osmicated פעמיים נוספות PBS במשך 30 דקות לכל לשטוף ולייבש את החלקים ברצף 10-15 דקות אתנול טבילה כאמור. לאחר טבילת האתנול בשיעור 70%, הנח כל דגימה בצלחת שחורה על רקע שחור עמום ודמיין את הדגימות ב-70%אתנול תחת אור LED RGB שהוחל על הדגימות מצד שמאל וימין בזוויות של 45 מעלות. צור אטלס של תמונות המקטע עם קואורדינטות על ידי איסוף תמונות של הדגימות בסדרה בתיקיה.
פנקו את הדגימות בשתי דגירה של 30 דקות של 100% אתנול, ואחריהן שתי דגירה של 30 דקות תחמוצת פרופילן 100%, שתיהן בטמפרטורת החדר. בזמן שהדגימות דגירה, מערבבים שרף טרי עם תחמוצת פרופילן ביחס של אחד לאחד ואחד לשני, ומוסיפים מאיץ של 3% לשני הפתרונות. לאחר הדגירה השנייה של תחמוצת פרופילן, מעבירים את הדגימות לתחמוצת פרופילן של שרף אחד לשניים המטביעה פתרון בינוני למשך שעתיים בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן דגירה של שעתיים בתחמוצת פרופילן שרף אחד לאחד המטביעה פתרון בינוני בטמפרטורת החדר.
בסוף הדגירה השנייה, מעבירים את הרקמות לצלחות פוליפרופילן שטוחות, ומרפאים את הרקמות המוטבעות בשרף טרי המכיל 3% מאיץ למשך 12 עד 24 שעות ב-65 עד 85 מעלות צלזיוס. לאחר מכן מקררים את הרקמה לטמפרטורת החדר, ומסירים את הדגימות המוטמעות בשרף ממנות הפוליפרופילן. למיפוי אזור מעניין, בחרו תמונה הכוללת את אזור העניין מאטלס התמונה שהוכן קודם לכן.
לשרטט את גבולות אזור העניין על התמונה חתוכים, אופטית superimpose גבולות אלה על הדגימה מוטבעת מתחת למיקרוסקופ, ולהשתמש מחט מד 26 אינץ ' כדי לגרד גבולות אזור אלה על דגימת השרף. לאחר מכן, מחממים את הדגימות ל 95 מעלות צלזיוס על מנת לרכך את הגוף. לאחר מכן, מוציאים את דגימות שרף חם מהתנור, ולהשתמש סכין גילוח כדי excise את אזורי העניין.
הדבק את הדגימות על מוטות החזקת זכוכית אקרילית ברמה המתאימה, וחתוך את הדגימות המותקנות עבור חתך דק למחצה ודק במיוחד. השתמש ultramicrotome לרכוש חצי דק 0.7 מיקרומטר וקטעים דקים במיוחד 70 ננומטר, איסוף החלקים הדקים למחצה על נושאות זכוכית, ואת החלקים הדקים במיוחד על רשתות ניקל. הכתם את החלקים הדקים למחצה בכחול 1% ב- PBS במשך ארבע דקות, ואחריו כמה שטיפות במים מיונים, לפני בחינת החלקים על ידי מיקרוסקופיה קלה.
לאחר מכן ניתן להעריך ישירות את החלקים הדקים במיוחד על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים של שידור ב-180 קילו-וולט ללא שינוי נוסף. לאחר ההקטעה, פרוסות הרקמה מדמיין על ידי צילום tele-macro כפי שהוכח רק. לאחר ההתנדפות וטבילת האתנול, החלקים נדמיונים שוב על ידי הפרעה קל טל מקרוגרפיה, חושף דפוס צבעוני במיוחד עבור כל משטח רקמה.
לאחר התייבשות נוספת והטבעת שף, אזורי העניין נבחרים ומעובדים עוד יותר עבור מיקרוסקופ אלקטרונים שידור. בהיפוקמפוס ובקטנום, סינפסות סיבים טחב ידועים להפגין מאפיינים אולטרה-מבניים ייחודיים בהשוואה הסינפסות אחרות, כולל boutons presynaptic גדול. בפרופילי חתך רוחב שלהם, boutons מכילים מספר עצום של וריצים ומיטוכונדריה, ולעתים קרובות מאוד להקיף כמה קוצים דנדריטיים.
בחוט השדרה, funiculus הגבי מכיל סיבים אקסונאליים רבים כי הם מיאלין על ידי אוליגודאנדרוגליה. על קטעים רוחביים, funiculus הגבי ניתן למצוא בין שתי הקרניים האחוריות של חוט השדרה. על תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור, אקסונים מירליים חתוכים מופיעים עגולים, ואת נדן המירלין המקיף את האקסונים מאורגנים lamellae.
האטלס המוכן ותמונות מיקרוסקופיית האלקטרונים המיקרוגרפיות של הפרמטרים האולטרה-מבניים מועילים לא רק להשוואת הנוירופלסטיות המורפולוגית של חלקים שונים בתנאי טיפול שונים, אלא גם להשוואות בין פרמטרים באותו אזור. זכור לתכנן ביסודיות ולהתכונן לפני תחילת ההעתקה ברחם, כדי להיות בטוח שיש גיבוי של חומרים ומכשירים במקרה של סיבוכים. בעקבות השיטה שלנו, ניתן להוסיף טכניקות אחרות כגון תיוג אימונוגולד לפני מיקרוסקופ אלקטרונים עבור מעקב אולטרה מבני של מולקולה מוגדרת של עניין.
החל מתצוגה הוליסטית של האורגניזם כולו והתקרבות לטופוגרפיה המולקולרית, אנו מסוגלים ללמוד ולתפעל את הקשר בין תפקוד הרקמה למורפולוגיה. אוסיום טטרוקסיד מסוכן. הקפד תמיד לעבוד מתחת למכסה המנוע, וללבוש משקפי מגן וכפפות יד בעת עבודה עם זה reagent.
