Nasıl Photoactivated floresan proteinler toplu olarak ve canlı hücrelerdeki kısmını ölçmek için

Burada genetik olarak birleştirilmiş farklı foto-aktivatör ve floresan proteinleriçeren bir protokol sıyoruz. Bu iç cetveller floresan olarak aktive fotoğraf PAFP fraksiyonu nicelik izin verir. Şimdiye kadar, hiçbir yöntem yaşam hücrelerinde toplu olarak ölçmek için kullanılabilir olmuştur kaç PAFP ifade edilen fotoğraf floresan aktive edilir. Foto-aktivasyon verimliliği sunulan nicelik pa-GFP ve PA Kiraz canlı hücrelerde örneklenir ama prensipte geniş uygulanabilir ve herhangi bir deneysel koşul altında herhangi bir foto-aktivatör floresan protein için kullanılabilir. Genetik olarak kodlanmış floresan proteinler ile çalışıldığında, ifade edilen proteinlerin mutlak miktarı hücreden hücreye değişir ve bilinmemektedir. Hücreler arasındaki ifadeyi standartlaştırmak için, genetik olarak birleşen farklı floresan proteinlerin iç cetvellerini sıyoruz. Bir foto-aktive edilebilir floresan proteinin genetik bilgilerini floresan protein iç cetvellerinde her zaman farklı bir spektruma bağlayarak, hala bilinmeyen bir toplam miktarla ama bilinen bire bir göreceli olarak ifade edilecek bir oluşturulur. Eşlik eden metin protokolünde açıklandığı gibi plazmidleri oluşturmaya başlamak için. Ayrıca, fenol kırmızı ücretsiz versiyonu kullanarak kendi perspektif orta standart hücre hattında kültür. Denemeye başlamaya hazır olduğunuzda, arka plan floresansını azaltmak için fenol kırmızısı olmadan tripsin kullanarak hücreleri hasat edin. Hasattan sonra, 2 ml'lik bir pipeti, T 12.5 hücre kültürü şişesinde yetişen bir hücre kültüründen hücre süspansiyonu ile doldurun. Sekiz odacam slayt her odasına bir damla ekleyin. 24 saat boyunca standart hücre kültürü koşulları altında slayt kuluçka. Sonraki transfect distribütörler protokolü aşağıdaki ticari reaktifler kullanarak hücreleri. GFP Kiraz, PA-GFP Kiraz ve GFPPA Kiraz kimeraları ile hücreleri transfect. Daha sonra protein ekspresyonu, katlama ve olgunlaşma sağlamak için hücreleri kuvöze geri verin. Transfeksiyon sonrası toplam 20 saat sonra, hücreleri önceden ısıtılmış, nemlendirilmiş ve ısıtılmış çevre odası ile donatılmış konfokal floresan mikroskobun aşamasına aktarın.