Cómo cuantificar la fracción de proteínas fluorescentes fotoactivado a granel y en células vivas

Aquí presentamos un protocolo que involucra proteínas foto-activables y fluorescentes espectralmente distintas genéticamente. Estas reglas internas permiten cuantificar la fracción PAFP que se activa la foto para ser fluorescente. Hasta ahora, no se ha disponible ningún método para cuantificar a granel en las células de vida cuántas de las PAFP expresadas se activan foto a la fluorescencia. La cuantificación presentada de la eficiencia de la foto-activación se ejemplifica para PA-GFP y PA Cherry en células vivas, pero en principio es ampliamente aplicable y se puede utilizar para cualquier proteína fluorescente foto-activable bajo cualquier condición experimental. Siempre que se trabaja con proteínas fluorescentes codificadas genéticamente, la cantidad absoluta de proteínas expresadas varía de una célula a una célula y se desconoce. Para estandarizar la expresión entre las células, introducimos reglas internas de proteínas fluorescentes espectralmente distintas genéticamente. Al acoplar la información genética de una proteína florescente fotoactivable a una proteína espectralmente distinta siempre en las reglas internas de proteínas fluorescentes se crean que todavía se expresarán a una cantidad total desconocida, pero en una cantidad relativa conocida fija de uno a uno. Comenzar a construir los plásmidos como se describe en el protocolo de texto adjunto. Además, el cultivo en la línea celular estándar en su medio de perspectiva utilizando la versión libre de rojo fenol. Cuando esté listo para comenzar el experimento, cosecha las células usando tripina sin fenol rojo para reducir la florescencia de fondo. Después de la cosecha, llenar una pipeta de 2 ml con la suspensión celular de un cultivo celular confluente cultivado en un matraz de cultivo celular T 12.5. Agregue una gota en cada cámara de un portaobjetos de vidrio de ocho cámaras. Incubar el portaobjetos en condiciones de cultivo celular estándar durante 24 horas. A continuación transfectar las células utilizando reactivos comerciales siguiendo el protocolo de distribuidores. Transfectar las células con las quimeras GFP Cherry, PA-GFP Cherry y GFPPA Cherry. Luego devuelva las células a la incubadora para permitir la expresión de proteínas, el plegado y la maduración. Después de un total de 20 horas después de la transfección, transfiera las células a la etapa de un microscopio florescente confocal equipado con la cámara ambiental humidificada y calentada precalentada a 37