Biz yerelleştirme yazılım için ısmarlama mikroskop ve Seamus Holden inşaatı ile yardım için Justin Pinkney ve Johannes Hohlbein kabul. Rodrigo Reyes-Lamothe E. sağlamak için teşekkür etti coli suşu. Araştırma Avrupa Komisyonu Yedinci Çerçeve Programı Hibe FP7/2007-2013 SAĞLIK-F4-2008-201418, UK Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi Grant BB/H01795X/1 ve ANK Avrupa Araştırma Konseyi Grant 261227 tarafından finanse edildi. DJS bir Wellcome Trust Programı Hibe WT083469 tarafından finanse edildi. SU Bir MathWorks doktora bursu ile desteklenmiştir.

1.. Hücre Kültürü Steril kültür tüpleri ve pipet ipuçlarını kullanın. E. E. coli suşu AB1157 Pola-PAmCherry Pol1 bir C-terminal füzyon PAmCherry taşır. Füzyon et al Datsenko tarif edildiği gibi lambda-Red rekombinasyon kullanılarak yabani tip geni değiştirerek doğal kromozom sokulmuştur. Hücresel büyüme ve DNA hasar madde metil duyarlılık ile belirlendiği üzere, füzyon proteininin 8 İşlevsellik doğrulandı metansülfonat (MMS). Hücre soyunun yapımı hakkında daha fazla bilgi Uphoff et al. 7 bulunabilir, Datsenko et al. 8 ve Reyes-Lamothe et al. 9 hücre kültürleri otoflüoresanı azaltmak ve mikroskop lamı üzerine arka plan parçacıkların bulunduğu M9 minimal bir ortam içinde büyütülür. Alternatif olarak, besleyici açısından zengin tanımlanmış ortam 10 kullanılabilir. <ol><li> Çizgi E. coli suşu AB1157 seçici antibiyotik (burada, 25 ug / ml kanamisin) bir Luria Broth (LB) agaroz plaka üzerinde dondurulmuş gliserol stokundan Pola-PAmCherry ve gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Tek bir hücre koloniden bir 5 ml LB kültürü inoküle ve 3 saat boyunca 220 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de büyür. </li><li> 5 ml kültür 1:10,000 seyreltin minimal ortam (M9 aracı, MEM amino asit + prolin, MEM vitaminleri,% 0.2 gliserol) ve 37 ° C, gece boyunca 220 rpm &#39;de çalkalanarak inkübe edin. </li><li> Sonraki sabah, bir spektrofotometre kullanılarak optik yoğunluğun (OD) ölçmek ve OD 0.025, 5 ml taze minimal ortam kültür seyreltin. Erken üslü fazda (OD 0.1) 220 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de 2 saat boyunca büyütün. </li><li> 5 dakika boyunca 2300 x g&#39;de santrifüj ile bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde hücre 1 ml konsantre edin. Süpernatantı ve 20 ul artık orta ve vorteks hücre pelletini. </li></ol> 2. Mikroskop Slide preparatiyon <ol><li> DH 2 O.% 1,5 düşük floresan agaroz çözüm hazırlayın Çözelti berraklaşıncaya kadar agaroz eritmek için bir mikrodalga kullanarak. Hafifçe yukarı pipetleme ve aşağı birkaç kez 2x minimal ortamda 500 ul ile erimiş agaroz çözüm 500 ul karıştırın. </li><li> Bir mikroskop lamel (Hayır 1.5 kalınlık) merkezine eşit agaroz çözüm yaymak. Bu agaroz soğutur önce kabarcıklar kaçınarak, hızlı bir şekilde yapılmalıdır. </li><li> Ikinci bir lamel (Hayır 1.5 kalınlık) ile pad düzleştirmek. Arka plan flüoresan partikülleri çıkarmak için, lamelleri önce 1 saat boyunca 500 ° C&#39;de bir fırın içinde yakıldı. Yakılan lamelleri alüminyum folyo ile kaplanmış, oda sıcaklığında hafta boyunca depolanabilir. </li><li> DNA hasarı deneyler için, 100 mM MMS ihtiva eden bir agaroz ped hazırlar. Adımda 2,1-2,3 in prosedürü izleyin, ama 100 mM M bir son konsantrasyon için, eritilmiş% 1.5 agaroz 500 ul ile karıştırılmadan önce, M9 ortam 500 ul 8.3 ul ekle MMSMS. (Dikkat! MMS toksik ve mutajenik ve eldiven, maske, gözlük, ve laboratuvar önlüğü ile ele alınması gerekir). </li><li> Yastığın en üst slayt çıkarın ve ped üzerine konsantre edilmiş hücre süspansiyonu 1 ul ekle. Kullanılmayan bir yandı lamel (Hayır 1.5 kalınlık, mikroskop objektif özelliklerini eşleşen) ile pad kaplayarak ve slayt çok hafifçe basarak hücrelerin hareketsiz. Hücreler agaroz ped kurumadan immobilizasyonun 45 dakika içinde görüntülü olmalıdır. Daha deneyler sırasında kurumasını önlemek için, agaroz yastıkları silikon contalar kullanılarak kapatılabilir. </li><li> DNA-hasar deneyler için, görüntüleme önce oda sıcaklığında nemli bir kap içinde 20 dakika boyunca 100 mM MMS ihtiva eden agaroz ped üzerinde hareketsiz hücreler inkübe edilir. </li></ol> 3. Mikroskopi Veri Toplama hazırlanıyor PALM algılama ve tek floresan proteinleri kesin lokalizasyonu dayanır. Duyarlılığı ve optimal hizalamaMikroskop, veri kalitesi için kritik öneme sahiptir. Tek molekül floresan mikroskoplar genellikle lamel yüzeyinden ince bir bölümünde heyecanlı sadece floroforlar tarafından sinyal-gürültü oranını artırmak için Toplam İç Yansıma (TIR) ​​aydınlatma kullanır. E. içinde İşte, görüntüleme coli derece hafifçe uyarma ışık açısını azaltarak bir TIRF mikroskop elde edilebilir eğimli aydınlatma 11 gerektirir. PAmCherry görüntüleme bundan başka, bir foto-aktifleştirme 405 nm lazeri ve 561 nm bir uyarım lazer gerektirir. Floresans emisyon 114,5 nm / piksellik bir piksel uzunluğunda elde büyütülerek CCD (EMCCD) kamera çarparak bir elektron kaydedilir. Optimum yerelleştirme hassasiyet için, piksel boyutu yaklaşık çok sayıda piksel üzerinde sinyal yayma olmadan yeterli örnekleme sağlamak PSF standart sapma genişliği aynı olmalıdır. Şekil 3 minimal PALM kurulum şemasını göstermektedir. Movie 1ısmarlama mikroskop inşa sürecinin bir izlenim verir,. aletin ayrıntılı bilgi için Uphoff ark 7&#39;ye bakın. <ol><li> Rutin mikroskop hizalama yapılması. 405 nm ve objektif önünde 561 nm sürekli dalga lazer yoğunluklarını ölçün. 3,5 mW (~ 400 W / cm 2) ve 10 μW (~ 1 W / cm 2) 405 nm yoğunluğu için 561 nm yoğunluğunu ayarlayın. 0-10 μW 405 nm yoğunluğu kademeli olarak ayarlanmasını sağlayan bir sürekli değişken nötr yoğunluk filtresi tekerleğini kullanın. Deney başlangıcına kadar lazer aydınlatmasını kapatın. </li><li> Mikroskop sahnede örnek yerleştirin ve iletilen ışık mikroskobu modu (Şekil 4A) odağa hücreleri getirmek. EMCCD kamera kazanç aşırı maruz kalma tarafından kameraya zarar görmesini önlemek için kapalı olması gerekir. </li><li> Veri boyutunu azaltmak ve kamera Okuması hızını artırmak için bir kırpılmış FOV&#39;yi tanımlayın. </li><li> Ortam ışığına ve sviç, numuneyi KapakEMCCD kamera kazanç ch. </li><li> (0.26 msn kamera okuma süresi dahil) 15.26 msn / kareye kare hızını ayarlamak. Tartışma bölümünde &quot;Pozlama süresi ve uyarım yoğunluklarını&quot; Bkz. </li><li> Karanlık bir arka plan sinyali (Şekil 4B) kontrol etmek için kamera verilerini görüntüler. </li><li> 561 nm lazer açın ve uyarma arka plan sinyali (Şekil 4C) kontrol edin. </li><li> Pol1-PAmCherry füzyon proteinlerinin fotoaktivasyonu için 405 nm lazer açın ve floresan PSFs görünen kadar yoğunluğunu artırabilir. </li><li> Lamel yüzeyine yakın numunenin sadece ince bir bölümünü aydınlatmaya uyarma ışın açısını ayarlayın. <ol><li> Bu amaçla, lazer ışını bir 100X NA 1.4 amacın arka odak düzlemi (Şekil 3) içine odaklanmıştır. Kirişin dik bir odaklama lensi tercüme uzak bir açı altında amaç çıkmak için ışın neden olan amaç merkezinden odağı taşır. </li><li> Aifloresans yoğunluğunu en üst düzeye çıkarmak ve arka plan sinyalinin en aza indirmek için m. Katı TIR uyarma lamel yüzeyin 100 nm olan görüntü florofor için uygun olduğuna dikkat edin, ancak, görüntüleme DNA-bağlama proteinleri E ile ilişkili coli nucleoid 0.8 um derin aydınlatma kadar gerektirir. </li></ol></li></ol> 4. Veri Toplama Burada, bir PALM film edinimi için genel protokol açıklar. Aynı prosedür, hasar E&#39;de Pol1-PAmCherry füzyon proteinleri görüntüleme için de geçerlidir coli hücreleri ve MMS ile sürekli DNA hasarı tedavi altında. Hücre başına farklı molekül ağırlıklı ya da kopya sayısının füzyon proteinleri için olan yöntemin uygulanması (Tartışma bölümüne bakınız) elde etme, farklı ayarları gerektirir. <ol><li> Iletilen ışık mikroskobu modunda hücrelerin yeni bir görüş alanı (FOV) bulun ve görüntü odak. Hücre anahatları (Şekil 4A) kaydetmek için bir kamera görüntüsünü alın.</li><li> Ortam ışıktan örnek kapak ve EMCCD kamera kazanç açın. </li><li> 561 nm lazer açın ve veri toplama başlamadan önce birkaç saniye için lamel hücresel otoflüoresanı ve arka plan noktalar çamaşır suyu. Hücreler için yetiştirilen ve M9 ortam içinde görüntülenmiş ve çok az floresan arka plan genellikle yoktur lamelleri yanmış kullanarak, ancak prebleaching örneğin LB olarak zengin Hücreler büyüme ortamı içinde görüntülenmesi için yararlı olabilir. Yoğun bir aydınlatma kadar prebleaching minimumda tutulmalıdır hücreler için toksik olduğuna dikkat edin. </li><li> 15.26 msn / karede sürekli 561 nm uyarma altında bir PALM film satın alma başlayın. </li><li> 405 nm lazer açın ve yavaş yavaş / cm 2 1 W kadar ulaşan, film boyunca yoğunluğunu artırabilir. Hücresel otoflüoresanı neden yüksek 405 nm şiddetleri kaçının. Floresan moleküllerin yoğunluğu dikkat - bu düşük aktivasyon oranları tutmak için önemlidir PSFs açıkça böyleHer bir çerçeve (Şekil 4D-F) izole edilmiştir. </li><li> 10,000 kare / film (hücre başına yansıması için moleküllerinin sayısına bağlı olarak) kaydedin; bir film tipik olarak 2-3 dakika sürer ve FOV boyutuna bağlı olarak sabit disk alanı 0.5-1 GB gerektirir. </li><li> Birden FOV için satın alma işlemi tekrarlayın. Her FOV PAmCherry flüoroforlar fotoaktive olsun, çünkü sadece bir kez görüntülenmiş ve geri dönüşümsüz beyazlatılmış unutmayın. </li></ol> 5. Veri Analizi Bir otomatik ve sağlam veri analizi çerçeve yönteminin performansı ve verimliliği için gereklidir. Biz MATLAB yazılmış özel yazılımı kullanın. <ol><li> Crocker et al. 12 &#39;de tarif algoritmaları kullanarak lokalizasyonu analizi yapın, Holden ve ark. 13 HoldenI et al. 14 ve Wieser et al. 15 PSFs ilk 7 piksel ile bir Gauss çekirdek kullanarak bir bant geçiren filtre görüntüde tespit edilirs çapı (Şekil 5A). Aday pozisyonları arka plan sinyali (Şekil 5B) ve 4.5 kat, standart sapma üzerinde olan en yüksek piksel yoğunluğunun PSFs karşılık gelir. Aday PSF başına lokal parlak piksel eliptik bir Gauss fonksiyonu (Şekil 5C) takılması için ilk tahmin olarak hizmet vermektedir. Serbest formda parametreler şunlardır: x-konumunda, y-konumunda, x-genişliği, y-genişliği, dönme açısı, genlik ve arka plan ofset. Eliptik Gauss maskesi PSF bulanıklaştırır ve deforme pozlama süresi sırasında molekül oluşturmaktadır. </li><li> Aynı FOV iletilen ışık mikroskobu görüntü üzerine PALM filmin bütün çerçeveler de elde edilen (x, y) lokalizasyonu çizilir. Pol1-PAmCherry Yerleşimleri E. merkezi alanı içinde görünmelidir coli hücreleri (Şekil 6A). Birçok lokalizasyonu hücrelerin dışında görünüyorsa, yerelleştirme eşiği çok düşük ayarlanmış veya numune arka plan floresan parçacıklar içeriyordu. </li><li> Otomatik izleme analizi için, Crocker et açıklanan algoritması MATLAB uygulama ark. 12. (Tartışma bölümünde &quot;Difüzyon analizi&quot; bakınız) kullanılabilir. Bir kullanıcı-tanımlı izleme penceresi içinde sonraki karelerde görünen pozisyonları bir yörünge oluşturmak için bağlanır. Çok bölgedeki aynı pencerede meydana durumda, parça benzersiz adım uzunlukları toplamı minimize tarafından atanır. Tek parçacık izleme verilerinden difüzyon katsayıları hesaplanırken çeşitli hususlar ayrıntılı bir tartışma için, Wieser vd. 15 bkz <ol><li> Algoritması bir parça sırasında geçici yanıp sönen veya cevapsız lokalizasyonu için hesap için bir bellek parametresini kullanır. Burada, 1 kare bellek parametresi; yüksek değerler uzun ömürlü koyu devletleriyle florosforlar izleme için kullanılabilir. </li><li> Aşağıdaki kalibrasyon adımları dayanan uygun bir izleme penceresi seçin. Pol1 için, 0.57 mikron (5 piksel) kullanabilirsiniz.</li><li> Pencere parametrelerini izleme aralığı için izleme algoritması çalıştırın. Parça (Şekil 6B) bölünmüş değildir mümkün olan en küçük izleme penceresi belirlemek için izleme penceresinin bir fonksiyonu olarak ölçülen, hücre başına parça sayısını hesaplayın. </li><li> Hücre içindeki molekül hareketinin dağılımını görselleştirmek için aynı FOV iletilen ışık mikroskobu görüntü üzerinde elde edilen parça çizilir. Pol1 parça tek hücre (Şekil 6C-D) içinde sınırlı difüzyon göstermesi gerekir. </li><li> Parça bir kısmı hücreler arasında çapraz görünüyorsa bu izleme penceresi çok büyük ve / veya fotoaktivasyon oranı (Şekil 6E) çok yüksek olduğu seçildi çünkü ayrı moleküller yanlışlıkla bağlantılı olduğunu göstermektedir. </li><li> Ardışık lokalizasyonu (Şekil 6F) arasındaki adım uzunluklarının kümülatif dağılımını çiziniz. Eğrisi yükselir ve yeterince büyük izleme pencereler için sorunsuz doyururPencere çok küçük seçildi eğer bir kesme kenarı gösterir. </li></ol></li><li> Pol1 difüzyon özelliklerini analiz etmek, N adımların toplamda her parça için ardışık yerleşimli arasındaki ortalama karesel deplasman (MSD)) hesaplamak: MSD = 1 / (N-1), i = 1 Σ N-1 (X i +1 - x i) 2 + (y i +1 - y i) 2. Sadece MSD değerleri istatistiksel belirsizliği azaltmak için en az 4 adım (N ≥ 5 yerelleştirmeler) ile izler içerir. </li><li> Birden fazla kare (Şekil 6G) üzerinde deplasmanları hesaplayarak lag kez aralığında MSD değerleri eğrisi çizilir. MSD eğrisinin şekli gözlenen moleküler hareket (Şekil 6H) sınıflandırmak için yardımcı olabilir. </li><li> MSD parça başına görünür difüzyon katsayısı D * hesaplayın: D * = MSD / (4 Dt) - loc 2 / ¨ t σ. İkinci term (Wieser vd. 15 bakın, burada σ loc = 40 nm ve Dt = 15.26 msn) tahmin yerelleştirme hata düzeltir. </li><li> FOV (Şekil 7A) Tüm parçalar arasındaki ölçülen D * değerleri bir histogram çizilir. </li><li> Parça başına ölçülen D * değere dayalı kromozoma bağlı görünen bireysel Pol1 molekülleri tanımlamak. Bağın popülasyonları ayırmak (merkezli keskin dağıtım D * ~ 0 mikron 2 / sn) ve D * &lt;0,15 mikron 2 / sn bir eşik ayarlayarak serbestçe difüzyon moleküller (geniş dağıtım D merkezli * ~ 0.9 mikron 2 / sn) ( Şekil 7A ve 7D) kırmızı barlar. </li><li> Hasarsız hücrelerinin (Şekil 7A-C) ve MMS (Şekil 7D-E) ile DNA hasarı tedavi altında hücrelerde lokalizasyonu, izleme, ve Pol1 için difüzyon analizi yürütmek. Ciltli parça fraksiyonu DN doğrudan sayısal olarak ölçülmesini sağlarIn vivo Pol1 bir onarım aktivitesi. </li></ol>

<ol>
	<li>Friedberg, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA Repair and Mutagenesis. , (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+spatial+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer spatial resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+localization+analysis+for+single-molecule+tracking+and+super-resolution+microscopy.">Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy.</a> Nat. Methods. 7 (5), 377-381 (2010).</li><li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy.">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Methods. 5 (2), 155-157 (2008).</li><li>English, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+investigations+of+the+stringent+response+machinery+in+living+bacterial+cells.">Single-molecule investigations of the stringent response machinery in living bacterial cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (31), (2011).</li><li>Subach, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+mCherry+for+high-resolution+two-color+fluorescence+microscopy.">Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy.</a> Nat. Methods. 6 (2), 153-159 (2009).</li><li>Uphoff, S., Reyes-Lamothe, R., Garza de Leon, F., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+DNA+repair+in+live+bacteria.">Single-molecule DNA repair in live bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (20), 8063-8068 (2013).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (12), 6640-6645 (2000).</li><li>Reyes-Lamothe, R., Possoz, C., Danilova, O., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+positioning+and+action+of+Escherichia+coli+replisomes+in+live+cells.">Independent positioning and action of Escherichia coli replisomes in live cells.</a> Cell. 133 (1), 90-102 (2008).</li><li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+medium+for+enterobacteria.">Culture medium for enterobacteria.</a> J. Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).</li><li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells.">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nat. Methods. 5 (2), 159-161 (2008).</li><li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+digital+video+microscopy+for+colloidal+studies.">Methods of digital video microscopy for colloidal studies.</a> J. Colloid. Interface. Sci. 179 (1), 298-310 (1996).</li><li>Holden, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+limits+of+single+molecule+FRET+resolution+in+TIRF+microscopy.">Defining the limits of single molecule FRET resolution in TIRF microscopy.</a> Biophys. J. 99 (9), 3102-3111 (2010).</li><li>Holden, S. J., Uphoff, S., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAOSTORM:+an+algorithm+for+high-density+super-resolution+microscopy.">DAOSTORM: an algorithm for high-density super-resolution microscopy.</a> Nat. Methods. 8 (4), 279-280 (2011).</li><li>Wieser, S., Sch&#252;tz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+single+molecules+in+the+live+cell+plasma+membrane-Do's+and+Don't's.">Tracking single molecules in the live cell plasma membrane-Do's and Don't's.</a> Methods. 46 (2), 131-140 (2008).</li><li>Arnauld, S., Nicolas, B., Herv&#233;, R., Didier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-target+tracing+(MTT)+algorithm+probes+molecular+dynamics+at+cell+surface.">Multiple-target tracing (MTT) algorithm probes molecular dynamics at cell surface.</a> Protoc. Exch. , (2008).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+fluorescent+proteins+for+diffraction-limited+and+super-resolution+imaging.">Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging.</a> Trends Cell Biol. (11), 555-565 (2009).</li><li>Elmore, S., M&#252;ller, M., Vischer, N., Odijk, T., Woldringh, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking+of+oriC-GFP+fluorescent+spots+during+chromosome+segregation+in+Escherichia+coli.">Single-particle tracking of oriC-GFP fluorescent spots during chromosome segregation in Escherichia coli.</a> J. Struct. Biol. 151 (3), 275-287 (2005).</li><li>Badrinarayanan, A., Reyes-Lamothe, R., Uphoff, S., Leake, M. C., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+architecture+and+action+of+bacterial+Structural+Maintenance+of+Chromosome+proteins.">In vivo architecture and action of bacterial Structural Maintenance of Chromosome proteins.</a> Science. 338 (6106), 528-531 (2012).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarları var beyan.

Biz deney başarısı için birkaç önemli konuları tartışmak. Seçim ve floresan füzyon proteininin ifadesi: foto-aktifleştirilebilen ve photoswitchable floresan proteinleri 17 büyük bir palet bulunmaktadır. Özel seçim mikroskop özellikleri, mevcut özellikle lazerler ve filtreler bağlıdır. 405 nm ve 561 nm kombinasyonu yaygın ışıkla aktive floresan proteinleri için idealdir. Biz monomerik olduğu için PAmCherry 6 seçtik ve hücrelerde herhangi bir toplama gösterdi. Ayrıca, geri dönüşü olmayan bir foto-aktifleştirme hücre başına protein kopya sayısını ölçmek için aktif florofor sayısını sayma sağlar. Bunun yerine bir plazmidden füzyon proteini ifade nedeniyle, vahşi tip lokusta füzyon proteinini kodlayan genin kromozom ekleme tercih ederim. Bu floresan ettik ile ilgili proteinin tam yerine sağlarrsion ve vahşi tip ekspresyon seviyesini korur. Foto-aktifleştirme oranı: Bu ortalama hücre başına daha az bir molekül filmin herhangi bir çerçeve içinde floresan halde olduğu gibi foto-aktifleştirme hızını ayarlamak için önemlidir. Bu, 405 nm yoğunluğuna bağlıdır ve moleküllerin sayısı etkinleştirilmesini yaptı. Çok düşük görüntüleme yoğunluklarda, ancak, tüm moleküller filmin sonundan önce görüntülenmiş olacak ya da çok uzun bir film satın gerekir. Filmin kaydedilen çerçeve sayısı hücre başına füzyon proteinleri ve ikinci uyarma koşullarında PAmCherry ortalama ışıkla ağartma ömür boyu kopya sayısına bağlıdır. Pol1 ait kopya sayısı ~ 400 molekül / hücre 1 ile üstel ışıkla ağartma süresi dağılımının ortalama değeri ~ 4 kare olmuştur. Kademeli olarak 405 nm yoğunluğunu arttırarak, aktivasyon eşit filmin 10000 çerçeveler üzerinden dağıtılır. Bu nedenle, her bir hücre occupPSFs ve 10,000 kare bir film izleme komplikasyonların küçük üst üste sağlanması, ~ 1.600 kare bir toplam floresan moleküller ile ied. Pozlama süresi ve uyarım şiddetleri: En önemlisi, pozlama süreleri az hareket bulanıklığı ile keskin PSFs gözlemlemek için yeterince kısa olması gerekir. Ancak, kare hızı yerelleştirme belirsizlik ötesinde ardışık çerçeveler arasında gözlemlenebilir moleküler hareket verecek şekilde seçilmelidir, aksi takdirde önemli fotonlar takip oversampling tarafından israf edilmektedir. Bağlanmamış moleküllerinin hareketi lokalizasyonu belirsizlik nedeniyle bağlanan moleküllerin belirgin hareketi açıkça ayırt edilebilir olması için yeterince uzun bir zaman aralıklarında örneklenir gerekir. Maruz kalma süresi ayarlandığında, PSF şiddeti ayarlanabilir olmalıdır. PSF lokalizasyonu hassas bir çerçeve süresi boyunca algılanan fotonların sayısı ile artar. Yükseköğretim uyarma yoğunlukları foton emisyon oranı met artırmakt da photobleaching hızı ve arka plan sinyali. İstenilen yerelleştirme hassasiyet verir düşük uyarım yoğunluğunu kullanın. Pol1-PAmCherry için biz 15.26 msn / çerçeve ve 3,5 mW 561 nm uyarma (400 W / cm 2) seçti. Bu (Uphoff ve ark. 7 Tamamlayıcı bilgiler bakınız) veri toplama öncesi ve sonrası hücre büyümesini ve morfolojisi izleyerek belirli görüntüleme koşulları için hücre canlılığı teyit etmek önemlidir. Pol1 in vivo 7 aralıklı bir DNA alt tabakasına ~ 2 sn bağlayıcı bir zamanı sergiler; bu nedenle moleküllerin çoğunluğu bir parçanın tüm süre boyunca ilişkili veya ilişkisiz devlet ya olmasını bekliyoruz. Kromozom siteleri sitoplazmada Pol1 difüzyon (~ 1 mikron 2 daha difüzyon katsayı büyüklüğü alt birkaç siparişleri (~ 10 -5 mikron 2 / sn, Elmore ve diğ. 18) çünkü bağlı moleküller aslında hareketsiz görünür </skadar&gt; / sn). Difüzyon analizi: görünür difüzyon katsayısı D * tek tek parçaları MSD hesaplanır, istatistiksel hatayı azaltmak için 4 adımda (5 kare) az üzerinde ortalama. O ~ moleküllerinin% 75 tanımlanan görüntüleme koşulları için en az 5 kare içinde çamaşır suyu edin. Gibi kısa parçalar ilişkili ve ilişkisiz molekülleri ayırt etmek için yeterli istatistiksel kesinlik vermemektedir. Bununla birlikte, protein aktivitesi rapor bağlanmış ve bağlanmamış moleküllerinin nispi fraksiyonları analiz parçaların toplam sayısının bağımsızdır. Belirsizlik bir molekülün 15 her lokalizasyonu için belirgin bir rasgele adım ekler, çünkü D * hesaplanmasında PSF yerelleştirme hatası (σ loc) için hesap yararlıdır. Bağlı ve difüzyon moleküllerin sınıflandırılması artırmak için, D * bot hesaplanması tavsiyeİki çerçeve, zaman içinde tek aşamalı değiştirmeler ve yer değiştirmeler h. Bu iki ayrı D * eşikleri ayarlamak mümkün olur: D * (15 msn) &lt;0,15 mikron 2 / sn ve D * (30 msn) &lt;0.075 mikron 2 / sn. D * pozlama süresinde nedeniyle difüzyon bulanıklık parçaları ve hareket hücre hapsinde etkilenir belirgin difüzyon katsayısı olduğunu unutmayın. Doğru, tarafsız difüzyon katsayıları ayıklamak için, bir stokastik Brown hareketi modeli 5,7 dayalı simüle verilere gözlenen hareketini karşılaştırmak yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Simüle veriler de veri analizi prosedürlerini test etmek için kullanılır. Bu yöntemin olası uygulamalar: Bu kromozoma bağlanması üzerine bir proteinin hareketliliğinde değişiklik ile in vivo koşullarında protein-DNA etkileşim görselleştirme ve miktarının belirlenmesi için genel bir yaklaşım açıklanmıştır. DNA-ya da etkinlikleriOnarımında yer alan RNA bağlayıcı proteinler, replikasyon, transkripsiyon ve kromozom bakım böylece optik kırılma sınırın altında bir uzamsal çözünürlük ile tek-hücre seviyesinde gerçek zamanlı olarak takip edilebilir. Fotoaktive tek molekül izleme hücre başına birkaç işaretli moleküllerin kısıtlanır geleneksel izleme yöntemlerinin uzanır. In vivo moleküler difüzyon ölçen alternatif bir yöntem (sıkı bağlamak) Photobleaching sonra Floresan Kurtarma olduğunu. FRAP büyük hücreler küresel difüzyon özelliklerini ölçmek için çok yararlı olsa da, özellikle küçük bakteri hücreleri için, uzamsal olarak heterojen bir ortamda farklı hareketlilik ile çeşitli moleküler türlerin çözmek için yeteneği sınırlıdır. Bu DNA-bağlama aktiviteleri ve E içinde farklı protein bir dizi alt-hücresel lokalizasyon ölçmek için izleme ışıkla aktive edilen tek molekül uyguladık coli Pol1, DNA ligaz, FIS protein, DNA da dahil olmak üzerepolimeraz III 7, hem de kromozomlar protein MukB, E, ve F 19 yapısal bakımı. Bu yöntem aynı zamanda, diğer hücre tiplerine adapte edilebilir tahmin ediyoruz.

Bu protokol, Escherichia coli canlı hücreler protein-DNA etkileşimlerin doğrudan ölçülmesini anlatır. Bu kromozom (Şekil 1) bağlanan olarak teknik, tek bir floresan etiketli proteinin yayılma katsayısındaki bir değişiklik kullanır. Biz DNA polimeraz gecikmeli iplikçik çoğaltma ve eksizyon onarım yollar 1 DNA boşlukları doldurur I (Pol1), bir prototip DNA-bağlayıcı protein kullanmak yöntemini göstermek için. Süper çözünürlüklü floresan mikroskopi gelişi nanometre çözünürlükte hücrelerde moleküler yapıların görüntülenmesini sağlar. Fotoaktive Yerelleştirme Mikroskobu (PALM) bir floresan devlet (Şekil 2) için bir başlangıç ​​karanlık durumdan aktif edilebilir floresan proteinleri kullanır. Sadece, tüm işaretli moleküllerin bir alt kümesi, bağımsız bir şekilde t, sıralı bir şekilde konumlarını belirlemek için herhangi bir zamanda devreyeo örnek 2&#39;de işaretli moleküllerin konsantrasyonu toplam. Molekül başına lokalizasyonu hassas esas olarak floresan Point Spread Fonksiyonu (PSF) büyüklüğüne bağlıdır toplanmış, fotonların sayısı ve arka plan sinyali 3. Bu yöntemin bir çok uygulama hücresel yapıların görselleştirmenin geliştirilmesi üzerinde odaklanır. Izleme PALM tek molekül ile birleştirilebilir gerçekleştirilmesi 4, doğrudan canlı hücreler içinde etiketlenmiş proteinlerin rasgele sayı hareketini izlemek için yeni yollar açılmıştır. Artan duyarlılık ve floresan mikroskoplar zamansal çözünürlüğü şimdi bakteriyel sitoplazmada 5 tek difüzyon floresan proteinleri izlenmesine izin. Burada, PAmCherry, geri dönüşü olmayan 405 nm ışık 6 ile ışıma üzerine bir floresan duruma özelliğine sahip olmayan bir başlangıç ​​durumundan dönüştüren bir mühendislik floresan proteini kullanır. Aktive PAmCherry flüoroforlar görüntü olabilir561 nm uyarma ve photobleaching kadar birkaç kare için izlenen tarafından d. Biz Pol1 ve PAmCherry bir füzyon kullanan tek proteinlerin geçici DNA-bağlama olayları tanımlamak için yöntemin yeteneğini göstermektedir. Metil metansülfonat (MMS) ile hücrelerin tedavisi baz eksizyon onarım enzimleri ile aralıklı DNA alt tabakalar haline getirilmiştir DNA metilasyon hasara neden olur. Bizim yöntem MMS hasara 7 yanıt tek Pol1 moleküllerin bağlanma açıkça göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; strain carrying a chromosomal insertion for a PAmCherry DNA-binding fusion protein</td><td></td><td></td><td>created by Lambda-Red recombination</td></tr><tr><td>MEM amino acids</td><td>Invitrogen</td><td>11130-051</td><td>minimal medium supplement</td></tr><tr><td>MEM vitamins</td><td>Invitrogen</td><td>11120-052</td><td>minimal medium supplement</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BioRad</td><td>161-3100</td><td>certified molecular biology grade</td></tr><tr><td>Microscope coverslips No 1.5 thickness</td><td>Menzel</td><td>BB024060SC</td><td>remove background particles by heating slides in furnace at 500 &amp;deg;C for 1 hr</td></tr><tr><td>Methyl methanesulfonate (MMS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>129925</td><td>CAUTION: toxic</td></tr><tr><td>PALM setup</td><td>home-built</td><td></td><td>described in Uphoff &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td>for data analysis and visualization</td></tr><tr><td>Localization software</td><td>custom-written, available online</td><td>http://www.physics.ox.ac.uk/Users/kapanidis/Group/Main.Software.html</td><td>MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis. Cite Holden &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt; if used in publication.</td></tr><tr><td>Tracking software</td><td>available online</td><td>&lt;a href=&quot;http://physics.georgetown.edu/matlab/&quot;&gt;http://physics.georgetown.edu/matlab/&lt;/a&gt;</td><td>MATLAB implementation by Blair and Dufresne. Cite Crocker &amp;amp; Grier&lt;sup&gt;12&lt;/sup&gt; if used in publication.</td></tr></tbody></table>

visualizing protein-dna interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking

Protein-DNA etkileşimleri birçok temel hücresel süreçlerin merkezinde yer alıyor. Örneğin, DNA replikasyonu, transkripsiyon, onarım ve kromozom organizasyon In vitro deneyler, DNA-bağlayıcı proteinlerin birçok çeşit fonksiyonu için ayrıntılı modeller oluşturmak için yardımcı olmuştur. Spesifik DNA yapıları ya da dizileri tanıyan DNA bağlayıcı proteinler tarafından yönetilir, henüz edilir , canlı hücresinin karmaşık ortamda bu süreçlerin ve onların örgütün kesin mekanizmaları çok daha az anlaşılır kalır. Yakın zamanda Fotoaktive Localization Mikroskopisi tek molekül izleme ile birleştirilmiş (PALM) kullanılarak canlı Escherichia coli hücrelerinde DNA tamir faaliyetleri ölçülmesi için bir yöntem geliştirmiştir. Bizim genel yaklaşım kromozomu ile dernek üzerine tek bir proteinin hareketlilik değişiklikle bireysel DNA-bağlama olayları tanımlar. Bağlı moleküllerinin protein fraksiyonu hareket için bir doğrudan niceliksel ölçümünü sağlartek hücre düzeyinde ivity ve alt-tabakalar ya da bağlanma siteleri bolluk. Burada, biz yöntemi kavramını açıklamak ve örnek hazırlama, veri toplama ve veri analizi işlemlerini göstermektedir.

In vivo olarak, protein-DNA etkileşimlerini incelemek için izleme ışıkla aktive edilen tek bir molekül kavramı, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. PAmCherry füzyon proteinleri, canlı E&#39;de algılanır Bir seferde, hücre başına daha az bir molekül bir frekansta 405 nm ışık ile davranışsal tek moleküller, ışıkla aktive olan bir sıralı bir şekilde coli hücreleri. Aktive moleküller sürekli 561 nm uyarma altında görüntülenmiş. Hücrede moleküler hareketin geri dönülmez ağartmanın kadar bir dizi kare yakındaki bölgeselleştirmelerini bağlayarak izlenebilir. DNA bağlayıcı proteinlerin difüzyon kromozom bağlanması üzerine yavaşlatıldığı için, D * iz başına elde edilen, görünen yayılma katsayısının doğrudan bireysel protein-DNA etkileşim ve raporlar. Şekil 2, canlı E&#39;de Pol1-PAmCherry füzyon proteinlerinin foto-aktifleşmesini gösteriyor coli hücreleri. O 405 nm yoğunluğunun etkisin floresan moleküllerin yoğunluğu, Şekil 4&#39;te görülebilir. Yoğunluk sadece 405 nm yoğunluğu ile ancak ek aktivasyonu için kullanılabilir moleküllerin sayısına göre belirlenir değil unutmayın; kalan moleküllerin havuzu PALM film boyunca tüketilir. Lokalizasyon analizi Şekil 5&#39;te gösterildiği gibi bir PALM filmin her bir çerçevesi için gerçekleştirilir. Bu canlı hücrelerde, sabit hücrelerde veya bağlı moleküllerinde hareketsiz molekülleri kullanarak lokalizasyonu hassas ölçülür. Bizim satın alma ayarları teorik tahmini 3 ile anlaşarak, σ loc = 40 nm bir yerelleştirme kesinlik verdi. Elde edilen Pol1 lokalizasyonları genel olarak E uzaysal organizasyonu yansıtan, hücrenin merkezi alan (Şekil 6A) işgal coli 7 nucleoid. Pol1 çoğunluğu dif ekran hasar görmemiş hücrelerde izlerŞekil 6C&#39;de gösterildiği gibi füzyon. Tipik bir hücre E başına yaklaşık 400 Pol1 moleküllerinin kopya sayısı ile uyumlu birkaç yüz Pol1 parça (Şekil 6D) içerir . coli hücre 1. 6B ve Şekiller 6E-F, uygun bir izleme penceresi parametresini seçiminde rehberlik - izleme penceresi çok büyük ise, farklı moleküller yanlışlıkla bir parçaya bağlı olma olasılığı daha yüksektir; izleme penceresi çok küçük ise, parça uzun adımlarla bölünecektir. Pol1 için MSD eğrisi hücre hapsi (Şekil 6G) nedeniyle daha uzun gecikme süreleri kısa gecikme süreleri ve saturatları için doğrusal yükselir. Moleküler hareket farklı türleri MSD analizi ile tespit edilebilir. Directed hareket parabolik eğri verir, Brown hareketi düz bir çizgi ile karakterize edilir, kapalı difüzyon eğri bir düzlüğe ulaşır; hareketsiz parçacıklar için MSD eğrisinin bir kaydırmada l temsil ederocalization belirsizlik (Şekil 6H). Tek parçacık izleme ve sorun giderme ipuçları hakkında ek bilgi Arnauld vd. 16 bulunabilir Daha önce eksojen DNA alkilleme hasarı 7 yanıt olarak Pol1 DNA onarım aktivitesini ölçmek için yöntem uygulanır. Pol1 of D * histogram molekülleri (Şekil 7A-C) difüzyon baskın bir nüfus gösterir hasar görmemiş hücrelerde izler. % 2.7 bağlı Pol1 moleküllerinin küçük bir kısmı muhtemelen gecikmeli iplikçik çoğaltma ve endojen DNA hasarının onarımı yer almaktadır. Sürekli 100 mM MMS hasar altında,% 13.8 (Şekil 7D) D * ~ 0 mikron 2 / sn artış ile parça nüfusu. Bu izler baz eksizyon tamir yolunun bir parçası olarak tek nükleotid boşlukları doldurmak için DNA onarım sentezini gerçekleştirerek bireysel Pol1 moleküllerini temsil eder. Ciltli parça pozisyonları bireysel konumlarını göstermekDNA hasarı ve onarımı siteleri (Şekil 7E-F). <img alt="Şekil 1" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig1highres.jpg" width="300" /> Şekil 1. Yöntemin grafik gösterimi. (A) floresan protein PAmCherry 405 nm ışık ile ışıma üzerine özelliğine sahip olmayan bir başlangıç ​​durumundan ışıkla aktive edilebilir. Parlak devlet 561 nm heyecanlı ve geri dönüşümsüz flüoroforun ağartıcılarının kadar 600 nm civarında floresan yayar. (B) fotoaktivasyon oranını kontrol sağlar görüntüleme herhangi bir zamanda yalnızca hücre başına tek bir davranışsal aktive PAmCherry füzyon proteini karanlık durumunda kalır henüz aktif edilmemiş ya da zaten ağartılmış moleküllere keyfi büyük havuz ise. (C) floresan molekülünün pozisyon izole PSF ve tr merkezinden belirlenirPhotobleaching kadar birkaç kare için acked. Birçok moleküllerin (D) parçalar sıralı bir şekilde kaydedilir. (EF), bir kromozom hedef sekans veya yapı ile bir DNA bağlayıcı proteinin etkileşim rastgele dağılan hareketi durur. Bağlanmış ve bağlanmamış molekülleri D * bir parça elde görünen yayılma katsayısı ile ayırt edilir. Bağlı moleküllerinin elde edilen fraksiyon, in vivo olarak bir DNA bağlayıcı proteinin aktivitesi için bir nicel ölçü verir. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51177/51177fig1highres.jpg" target="_blank">büyük resim görüntülemek için.</a> <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig2highres.jpg" width="600" /> Şekil 2. Canlı E. Pol1-PAmCherry Foto-aktifleştirme bölgesinin coli hücreleri. Ölçek çubukları: 1 mikron. Şemalar her panelin altında gösterilmiştir. (<html> A) agaroz pad üzerinde hareketsiz hücrelerin ışık mikroskobu görüntüsü Bulaşan. (B) bir hücre içinde, tek bir PAmCherry flüorofor Phototactivating. (C) daha yüksek bir kuru foto-aktifleştirme flüoresan moleküllerinin sayısını artırır. (D) Bir PALM film Entegre PAmCherry floresan. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51177/51177fig2highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 3," fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig3highres.jpg" width="400" /> Şekil 3,. Işıkla aktive olan ve görüntüleme PAmCherry füzyon proteinleri için bir asgari PALM kurulum şematik D1:. Dikroyik ayna (örneğin 550 nm uzun geçiş). D2: Dichroic ayna (örneğin 570 nm uzun geçiş). L1: Ayarlama merceği. L2: TIR lens. L3: Tüp lens.1177/51177fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig4highres.jpg" width="500" /> Şekil 4. . 15.26 msn / çerçeve Ölçek çubukları ile bir PALM film Temsilcisi görüntüler: 1 mikron. (A) agaroz pad üzerinde hareketsiz hücrelerin ışık görüntüsünü Bulaşan. (B) lazerler ile EMCCD kamera ölçülen karanlık arka plan görüntüsü kapatılır. Fotoaktivasyonu önce sürekli 561 nm uyarma altında (C) Uyarma arka plan görüntüsü. (DF) Artmış 405 nm yoğunluğu sürekli 561 nm uyarma altında görüntülü PAmCherry yüksek fotoaktivasyon oranlarına yol açar. Kutulu alanlar aşağıda büyütülmüş gösterilmiştir. (D) Düşük 405 nm yoğunluğu (&lt;1 μW) aktif FOV başına çok az floresan moleküller. (E) Orta 405yerelleştirme ve izleme analizleri için iyi bir PSF yoğunluğu nm yoğunluğu (~ 2 μW) fotoaktivasyon sonuçları. (F) Yükseköğretim 405 nm yoğunluğu (~ 10 μW) yerelleştirme ve izleme analizleri karartan bazı hücrelerde birden fazla floresan molekülü harekete geçirir. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51177/51177fig4highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig5highres.jpg" width="500" /> Şekil 5,. Yerelleştirme analizi İllüstrasyon. Ölçek çubukları: 1 mikron (A) Band-pass filtreleme sahte piksel gürültü kaldırır ve FOV genelinde yoğunluk Degradeleri düzleşir.. (B) Aday PSFs yanlış pozitif ve yanlış negatif algılamaları en aza indirmek için seçilmiş olan bir kullanıcı-tanımlı eşik dayalı filtrelenmiş görüntü tespit edilmiştir. Threshold arka standart sapma (sinyal-gürültü oranı, SNR) bölünmesiyle elde edilen bir aday pikselin en az yoğunluğuna karşılık gelir. (C) eşik iki boyutlu eliptik Gauss oturması için ilk yerelleştirme tahmin (turuncu çapraz) olarak hizmet geçer yerel parlak piksel. Ölçek çubukları: 0,5 mikron. Oluşan süper çözünürlük yerelleştirme (mavi çapraz) σ loc ortalama hassasiyete sahiptir = 40 nm. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51177/51177fig5highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 6," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig6highres.jpg" width="500" /> .. Izleme analizi Şekil 6 İllüstrasyon Ölçek çubukları: 1 mikron. (A) bir örnek hücre içinde Pol1-PAmCherry her tespit lokalizasyonu. (B) iz sayısı tespitİzleme penceresinin bir fonksiyonu olarak, örneğin hücrede ed. Küçük izleme pencereleri parça yüksek sayıda artifaktüel yol açar molekül yörüngeleri, bölünmüş. Kesikli çizgi izleme penceresi parametresi (0.57 mikron, 5 piksel) bizim seçim gösterir - bu adımları tam dağılımını tespit ve sağlam farklı moleküllerin yörüngeleri tutmak arasında iyi bir uzlaşma sağlar. Tek Pol1-PAmCherry molekülünün (C) Örnek parça. (D) rastgele renklerle gösterilen tüm ölçülen izler. Izleme penceresi seçilmiş ise (E) İzleme eserler (burada 0.8 um, 7 piksel) veya kare başına PSFs yoğunluğu çok yüksek, çok büyük. Izleme pencereler için adım uzunlukları (F) kümülatif dağılımları: 0.34 mikron (3 piksel, kırmızı çizgi), 0.57 mikron (5 piksel, mavi çizgi), ve 0.80 mikron (7 piksel, yeşil hat). 0.34 mikron izleme penceresi 0,34 mikron daha uzun adımlar keser unutmayın ki açıkçaadımların tam dağılımını keser. 0.80 mikron izleme penceresi olduğu gibi 0.57 mikron izleme penceresi adımlar hemen hemen aynı dağılımı algılar. (G) MSD eğri Pol1 sınırlıydı difüzyon gösterir. Yönlü hareketi, Brown hareketi, sınırlı difüzyon ve hareketsiz partiküller için (H) şematik MSD eğrileri. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51177/51177fig6highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig7highres.jpg" width="500" /> Şekil 7. Canlı E. Pol1 DNA tamir aktivitesinin doğrudan ölçümü . coli hücreleri Ölçek çubukları: 1 mm. (A) bir hasar görmemiş hücrelerin FOV (N = 4162 parça) 4 veya daha fazla adım tüm parçalar için görünür difüzyon katsayısı D * Histogram. B olarak sınıflandırılan moleküllerinin popülasyonunun<html> ound kırmızı vurgulanır. Pol1-PAmCherry (BC), parçalar iletilen ışık mikroskobu görüntü üzerinde gösterilmiştir. Kendi difüzyon katsayısı göre bağlı olarak sınıflandırılan parçalar kırmızı ile gösterilmiştir. (D) D * (N = 2128 parça) görüntüleme önce 100 mM MMS ile bir agaroz ped üzerinde immobilize edilir ve 20 dakika inkübe edilen hücrelerde ölçülen Pol1 parçaları için histogram. DNA tamir yapan bağlı moleküllerin nüfusu kırmızı gösterilir. (EF) Pol1-PAmCherry kırmızı tek Pol1 DNA onarım olayların izlerini gösteren iletilen ışık mikroskobu görüntüde izler. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51177/51177fig7highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Video 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51177/video.jpg" width="400" /> Film 1. Bir ısmarlama PALM kurulum bina.JoVE_Uphoff_Movie1.avi &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Videoyu izlemek için buraya tıklayın.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking at JoVE.com

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Tek molekül izleme ile kombine Fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) verir canlı Escherichia coli hücrelerinde protein-DNA etkileşimleri doğrudan gözlem ve ölçümü.

Fotoaktive Tek molekül Takip Kullanma Canlı Bakteriyel Hücrelerde Protein-DNA Etkileşimleri görselleştirme

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

visualizing-protein-dna-interactions-live-bacterial-cells-using

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.7K Görüntüleme.  University of Oxford.  Tek molekül izleme ile kombine Fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) verir canlı Escherichia coli hücrelerinde protein-DNA etkileşimleri doğrudan gözlem ve ölçümü. 

Video: Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and millisecond temporal resolution. These capabilities make single-molecule localization microscopy ideally suited to study molecular level biological functions in physiologically relevant environments. Here, we demonstrate an integrated protocol for both acquisition and processing/analysis of single-molecule tracking data to extract the different diffusive states a protein of interest may exhibit. This information can be used to quantify molecular complex formation in living cells. We provide a detailed description of a camera-based 3D single-molecule localization experiment, as well as the subsequent data processing steps that yield the trajectories of individual molecules. These trajectories are then analyzed using a numerical analysis framework to extract the prevalent diffusive states of the fluorescently labeled molecules and the relative abundance of these states. The analysis framework is based on stochastic simulations of intracellular Brownian diffusion trajectories that are spatially confined by an arbitrary cell geometry. Based on the simulated trajectories, raw single-molecule images are generated and analyzed in the same way as experimental images. In this way, experimental precision and accuracy limitations, which are difficult to calibrate experimentally, are explicitly incorporated into the analysis workflow. The diffusion coefficient and relative population fractions of the prevalent diffusive states are determined by fitting the distributions of experimental values using linear combinations of simulated distributions. We demonstrate the utility of our protocol by resolving the diffusive states of a protein that exhibits different diffusive states upon forming homo- and hetero-oligomeric complexes in the cytosol of a bacterial pathogen.

3D single-molecule localization microscopy is utilized to probe the spatial positions and motion trajectories of fluorescently labeled proteins in living bacterial cells. The experimental and data analysis protocol described herein determines the prevalent diffusive behaviors of cytosolic proteins based on pooled single-molecule trajectories.

Tek Moleküllü İzleme Mikroskobu - Sitosolik Moleküllerin Diffüz Durumlarını Belirlemede Bir Araç

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Biyokimya

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

Tek Moleküler Kompleksleri görselleştirme In Vivo Gelişmiş Floresan Mikroskopi

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Biyoloji

Kinetic Visualization of Single-Cell Interspecies Bacterial Interactions

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method has been developed for observing interspecies interactions between two bacterial pathogens. The use of this method to interrogate interactions between a motile Gram-negative pathogen, Pseudomonas aeruginosa and a non-motile Gram-positive pathogen, Staphylococcus aureus is demonstrated here. This protocol consists of co-inoculating each species between a coverslip and an agarose pad, which maintains the cells in a single plane and allows for visualization of bacterial behaviors in both space and time.
Furthermore, the time-lapse microscopy demonstrated here is ideal for visualizing the early interactions that take place between two or more bacterial species, including changes in bacterial species motility in monoculture and in coculture with other species. Due to the nature of the limited sample space in the microscopy setup, this protocol is less applicable for studying later interactions between bacterial species once cell populations are too high. However, there are several different applications of the protocol which include the use of staining for imaging live and dead bacterial cells, quantification of gene or protein expression through fluorescent reporters, and tracking bacterial cell movement in both single species and multispecies experiments.

This live-bacterial cell imaging protocol allows for visualization of interactions between multiple bacterial species at the single-cell level over time. Time-lapse imaging allows for observation of each bacterial species in monoculture or coculture to interrogate interspecies interactions in multispecies bacterial communities, including individual cell motility and viability.

Tek Hücreli Türler Arası Bakteri Etkileşimlerinin Kinetik Görselleştirilmesi

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

Protein-DNA Etkileşiminin Çalışmaları Tek molekül Manipülasyon ve Görüntüleme birleştiren

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing molecules of interest to fluorescent proteins such as GFP to study their expression, localization and function. However, GFP and its derivatives are significantly larger and less photostable than organic fluorophores generally used for in vitro experiments, and this can limit the scope of investigation. 
We recently introduced a straightforward, versatile and high-throughput method based on electroporation, allowing the internalization of biomolecules labeled with organic fluorophores into living microorganisms. Here we describe how to use electroporation to internalize labeled DNA fragments or proteins into Escherichia coli and Saccharomyces cerevisi&#230;, how to quantify the number of internalized molecules using fluorescence microscopy, and how to quantify the viability of electroporated cells. Data can be acquired at the single-cell or single-molecule level using fluorescence or FRET. The possibility of internalizing non-labeled molecules that trigger a physiological observable response in vivo is also presented. Finally, strategies of optimization of the protocol for specific biological systems are discussed.

Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.

Elektroporasyon yoluyla Yaşam Mikroorganizmalar içinde içselleştirilmesi ve Floresan biyomoleküllerin Gözlem

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

Peptit bağlanma floresan protein DNA ile yüzey-gergin büyük DNA moleküllerinin Görselleştirme

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &#955; DNA at the Single Molecule Level

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. In single molecule assays for studying DNA-protein interactions, there are two important factors for consideration: the DNA substrate with enough length for easy observation and labeling a protein with a suitable fluorescent probe. 48.5 kb &#955; DNA is a good candidate for the DNA substrate. Quantum dots (Qdots), as a class of fluorescent probes, allow long-time observation (minutes to hours) and high-quality image acquisition. In this paper, we present a protocol to study DNA-protein interactions at the single-molecule level, which includes preparing a site-specifically modified &#955; DNA and labeling a target protein with streptavidin-coated Qdots. For a proof of concept, we choose ORC (origin recognition complex) in budding yeast as a protein of interest and visualize its interaction with an ARS (autonomously replicating sequence) using TIRFM. Compared with other fluorescent probes, Qdots have obvious advantages in single molecule studies due to its high stability against photobleaching, but it should be noted that this property limits its application in quantitative assays.

Here, we present a protocol to study DNA-protein interactions by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) using a site-specifically modified &#955; DNA substrate and a Quantum-dot labeled protein.

Qdot etiketli Protein ve Site-specifically tarihinde λ DNA molekülünü düzeyinde arasındaki etkileşimi görüntülenmesi

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. ...

FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) provide accurate information about PPIs in live cells. FLIM-FRET relies on measuring the fluorescence lifetime decay of a FRET donor at each pixel of the FLIM image, providing quantitative and accurate information about PPIs and their spatial cellular organizations. We propose here a detailed protocol for FLIM-FRET measurements that we applied to monitor PPIs in live Pseudomonas aeruginosa in the particular case of two interacting proteins expressed with highly different copy numbers to demonstrate the quality and robustness of the technique at revealing critical features of PPIs. This protocol describes in detail all the necessary steps for PPI characterization - starting from bacterial mutant constructions up to the final analysis using recently developed tools providing advanced visualization possibilities for a straightforward interpretation of complex FLIM-FRET data.

We describe here a protocol to characterize protein-protein interactions between two highly-differently expressed proteins in live Pseudomonas aeruginosa using FLIM-FRET measurements. The protocol includes bacteria strain constructions, bacteria immobilization, imaging and post-imaging data analysis routines.

Canlı Bakterilerde Protein-Protein Etkileşimlerinin FLIM-FRET Ölçümleri.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster ...

Protein Etkileşimlerinin Canlı Hücre Tek Moleküllü Görüntüleme Tabanlı Miktar Tayini

Single-Molecule Measurement of Protein Interaction Dynamics Within Biomolecular Condensates

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number of cellular functions. Characterizing LLPS in live cells is also important because aberrant condensation has been linked to numerous diseases, including cancers and neurodegenerative disorders. LLPS is often driven by selective, transient, and multivalent interactions between intrinsically disordered proteins. Of great interest are the interaction dynamics of proteins participating in LLPS, which are well-summarized by measurements of their binding residence time (RT), that is, the amount of time they spend bound within condensates. Here, we present a method based on live-cell single-molecule imaging that allows us to measure the mean RT of a specific protein within condensates. We simultaneously visualize individual protein molecules and the condensates with which they associate, use single-particle tracking (SPT) to plot single-molecule trajectories, and then fit the trajectories to a model of protein-droplet binding to extract the mean RT of the protein. Finally, we show representative results where this single-molecule imaging method was applied to compare the mean RTs of a protein at its LLPS condensates when fused and unfused to an oligomerizing domain. This protocol is broadly applicable to measuring the interaction dynamics of any protein that participates in LLPS.

Yazar Spotlight: Canlı İnsan Hücrelerinde Protein-Kondensat Dinamiklerinin Değerlendirilmesi

Many intrinsically disordered proteins have been shown to participate in the formation of highly dynamic biomolecular condensates, a behavior important for numerous cellular processes. Here, we present a single-molecule imaging-based method for quantifying the dynamics by which proteins interact with each other in biomolecular condensates in live cells.

Biyomoleküler Kondensatlarda Protein Etkileşim Dinamiğinin Tek Moleküllü Ölçümü

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number ...

Fotoaktive Tek molekül Takip Kullanma Canlı Bakteriyel Hücrelerde Protein-DNA Etkileşimleri görselleştirme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Tek Moleküllü İzleme Mikroskobu - Sitosolik Moleküllerin Diffüz Durumlarını Belirlemede Bir Araç

Tek Moleküler Kompleksleri görselleştirme In Vivo Gelişmiş Floresan Mikroskopi

Tek Hücreli Türler Arası Bakteri Etkileşimlerinin Kinetik Görselleştirilmesi

Protein-DNA Etkileşiminin Çalışmaları Tek molekül Manipülasyon ve Görüntüleme birleştiren

Elektroporasyon yoluyla Yaşam Mikroorganizmalar içinde içselleştirilmesi ve Floresan biyomoleküllerin Gözlem

Peptit bağlanma floresan protein DNA ile yüzey-gergin büyük DNA moleküllerinin Görselleştirme

Qdot etiketli Protein ve Site-specifically tarihinde λ DNA molekülünü düzeyinde arasındaki etkileşimi görüntülenmesi

Canlı Bakterilerde Protein-Protein Etkileşimlerinin FLIM-FRET Ölçümleri.

Biyomoleküler Kondensatlarda Protein Etkileşim Dinamiğinin Tek Moleküllü Ölçümü

Biyomoleküler Kondensatlarda Protein Etkileşim Dinamiğinin Tek Moleküllü Ölçümü