Bu yöntem, bir ilgi geninin koşullu ve geçici olarak inaktivasyonunu gerektiren çok çeşitli alanlardaki anahtar sorularının yanıtlanmasına yardımcı olarak, bunun baskın negatif bir sürümünü tersine çevirerek yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı protein aktivitesinde sadece kısmi ablasyon sağlar, böylece, bir kalıntı endojen ifade koruyarak. Burada multimerik bir montajda işlev gören RB proteininin inaktivasyonunu tanımlasak da, bu metodoloji monomerik proteinlere de uygulanabilir.
Umesh Pyakurel, bizim laboratuvar teknikeri ve el yazması bir coauthor prosedürleri gösterecektir. Başlamak için,% 10 fetal sığır serumiçeren önerilen hücre kültürü ortamı kullanarak, 5% 5 CO2 ile 37 santigrat derece, satıcının özelliklerine göre NIH3T3 hücreleri büyümek. PTet-Splice ve pCMV-Tet3G vektörlerini kullanarak hücreleri cotransfect için, ilk iyi başına lipid bazlı transfeksiyon reagent iki ila dört mikrolitre karıştırın, ve bir mililitre eksik DMEM iyi başına 15 mililitrelik bir tüp, ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçka.
Bu transfeksiyon reaktifinin DMEM karışımına her kuyuda 2-3 mikrogram plazma DNA'sı ekleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika karıştırın ve kuluçkaya yatırın. NIH3T3 hücreleri ile altı iyi plaka her kuyuya DNA ve DMEM transfeksiyon reaktifiçeren karışımın bir mililitre ekleyin.
%5 CO2 ile 37 santigrat derecede 3-4 saatlik kuluçkadan sonra, bir mililitre tam orta madde ekleyin. Sonra, her iyi doksisiklin stok 2 mikrolitre ekleyin ve artı-doksisiklin olarak plaka işaretleyin. Hücreleri %5 CO2 ile 37 derecede kuluçkaya yatırın.
TetO-DN-CB-myc6-Rb1 yapısının işlevselliğini değerlendirmek için planlanmamış hücre çoğalmasını teşvik etmek için, DMEM'de %10 FBS içeren hei-OC1 hücrelerinin kültürü, izin verilen koşullar altında. Hücre çoğalması çalışmaları için, bir hücre sayacı kullanarak HEI-OC1 hücreleri saymak. Plaka 10, 000 HEI-OC1 hücreleri her biri hacmi 200 mikrolitre 96-iyi plaka üzerinde iyi başına.
Hücreleri gece boyunca %5 CO2 ile 33 derecede kuluçkaya yatırın. Transgen ekspresyonunu indüklemek için, transfected HEI-OC1 hücrelerinin bir alt kümesine doksisiklin mililitre başına bir mikrogram ekleyin. Eksi-doksisiklin olarak etiketlenmiş diğer alt kümeyi ve transfected olmayan HEI-OC1 hücrelerini kontrol olarak kullanın ve hücreleri %10 CO2 ile 33 santigrat derece olarak kuluçkaya yatırın.
Hücre çoğalmasını değerlendirmek için, transfeksiyondan 48 saat sonra, hücre kültürü ortamını çıkarın ve bir hücre çoğalma kitinden 100 mikrolitre boya bağlayıcı çözeltiyi mikro plakanın her kuyuya ekleyin. Üreticinin protokolünü uygulayın ve 37 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yat. Her numunenin floresan yoğunluğunu ölçmek için floresan mikroplaka okuyucukullanın.
İmmünositokimya kullanarak hücre çoğalmasını daha fazla değerlendirmek için, HeI-OC1 hücrelerini DMEM'deki 12 kuyuluk plakanın her kuyunun her kuyununa yerleştirilen bir kapak camı üzerine yerleştirin. Hücreleri bir gecede 33 derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, pTet-Splice ve pCMV-Tet3G vektörleri ile iki kuyuda hücrelere cotransfect, ve sonra bir de doksisiklin tedavisi gerçekleştirmek ve NIH3T3 hücreleri ile yapılır.
Bir untransfected iyi bir kontrol kullanın. Ki-67 etiketleme için hücreleri işlemek için, oda sıcaklığında 10 dakika pbs% 4 paraformaldehit ile düzeltin. Bundan sonra, beş er dakika buz gibi PBS ile üç kez yıkayın.
PBS'ye %0.25 noniyonik deterjan ekleyin ve 10 dakika kuluçkaya yatırın. PBS'de üç kez beşer dakika yıkayın. Hücreleri engellemek için %10 serum kullanın.
Oda sıcaklığında bir saat nemlendirilmiş bir odada. Ki-67 birincil antikor 500 mikrolitre ekleyin ve dört santigrat derece gecede kuluçka. Hücreleri pbs'de üçer kez beşer dakika yıkayın.
İkincil antikor bir mililitre ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında bir saat boyunca hücreleri kuluçkaya yatırın. Sekonder antikor solüsyonu çıkardıktan sonra, karanlıkta PBS beş dakika boyunca hücreleri tekrar üç kez yıkayın. HEI-OC1 hücrelerini phalloidin ile etiketlemek için, 1:200 phalloidin ile oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın.
Hücre çekirdeklerini etiketlemek için, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca dapi mililitre başına beş mikrogram ile hücreleri kuluçkaya yatırın. Transjen farelerin tesliminden sonra, el yazmasında açıklandığı gibi CBRb1 füzyon bölgesine özgü bir astar seti kullanarak yavruları genotip. Rosa-CAG-rtTA ve tetresikin indükleyici hattına yetişkin TetO-DN-CB-myc6-Rb1 fareleri üretin ve makalede açıklandığı gibi yavrularını genotipleyin.
NIH3T3 endojen RB1 proteinini ifade etmez, bu nedenle burada görülen sağlam RB1 ekspresyonu Dox varlığında transjen indüksiyonundan kaynaklanır, ancak yokluğunda, TetO-DN-CB-myc6-Rb1 karışımı RB1 yapısının etkin aktivasyonunu onaylar. Buna karşılık, HEK293 hücreleri endojen RB1 ifadesine sahiptir. Doksisiklin eklenmesi TetO-DN-CB-myc6-Rb1 aktivasyonu ve RB1 aşağı regülasyon yol açtı.
Doksisiklin medyadan çıkarıldıktan 21 saat sonra RB1 ekspresyonuna devam edildi. Hei-OC1 hücreleri aynı vektörler ile cotransfected, hücre sayısında mütevazı ama önemli bir artış doksisiklin ile tedavi edilmeyen transfected hücrelere göre doksisiklin tedavisi takip gösterdi, ve transfekssiz hücreler. Floresan in situ hibridizasyon farelerde TetO-DN-CB-myc6-RB1 transgeninin genomik yerleştirisini doğruladı.
Kontrol grubuna göre üç gün boyunca doksisiklin ile tedavi edilen transgenik farelerin kokleasında toplam RB1 protein ekspresyonunda ilk artış saptandı. Ancak yedi ve 10 gün boyunca doksorusin ile tedavi edilen gruplarda RB1 ekspresyonunda anlamlı bir azalma gözlendi. Analiz edilen dokune bakılmaksızın, doksosikline ile tedavi edilen transgenik farelerde RB1 proteininde önemli bir azalma gözlendi, ancak kontrol grubunda değil, TetO-DN-CB-myc6-RB1 yapısının verimliliğini doğruladı.
Bu yordamı denerken, transgenin kodlama öğelerinin her birinin birbiriyle aynı çerçevede olduğunu doğrulamak önemlidir. Bu raporda tanımlanan Cathepsin B ve retinoblastomun kodlama bölgeleri tesadüfen çerçeveden bağlı olsaydı, istenilen füzyon proteinini vermezdi. Bu nedenle transgeni tek hücreli fare embriyolarına enjekte etmeden önce DNA dizisi doğrulaması yapılmalıdır.
Bu prosedürü takiben, her yerde CAG organizatörü bir hücrenin özel bir şekilde gen fonksiyonu çalışma için belirli organizatörler ile değiştirilebilir.
