Name: conditional knockdown of gene expression in cancer cell lines to study the recruitment of monocytes/macrophages to the tumor microenvironment
Uploaded: 2017-11-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment at JoVE.com

Yazarlar Jacqueline Rosenberg el yazması proofreading için kabul etmek istiyorum. Bu eser bize Bölümü Sağlık ve insan Hizmetleri/Ulusal Sağlık Enstitüleri YA DeClerck için hibe ile tarafından desteklenmiştir (5R01 CA 129377 vermek) ve TJ Martell Vakfı. MH Kubala Saban Araştırma Enstitüsü Çocuk Hastanesi Los Angeles adlı bir araştırma kariyer geliştirme Fellowship Ödülü alıcı olduğunu.

İnsan monosit sağlıklı gönüllülerden elde kullandığı protokolü bölümünde çocukların hastane Los Angeles insan araştırma Etik Komitesi kuralları izler ve insan malzeme altında Kurumsal değerlendirme Komitesi tarafından onaylandı Protokol numarası: CCI 08-00208.
1. kanser hücre hatları ile tetrasiklin düzenlenir shRNA ifade hazırlanması
<ol><li>ShRNA PAI-1 Tet-pLKO-puro vektör içine klonlama 8 , 9<ol>
<li>Ben ve EkoRI bölünme 5' ucuna, anlamda dizisi, 6 nükleotit döngü ve antianlamlı sıra site yaşiçeren shRNA reaksiyonlar tasarlayın. Not: Aşağıdaki gibi tipik oligonucleotides tasarlanmıştır: ileri oligo: 5' CCGG - 19-21 bp, 19-21 bp Antisens - TTTTT, ters oligo - CTCGAG - hissediyorum: 5' AATTAAAAA-19-21 bp - CTCGAG - 19-21 bp Antisens 3' hissediyorum. Detaylı iletişim kuralı oligomer tasarım için 8' de bulunabilir. Bu çalışmada 3 shRNA dizileri PAI-1 karşı en güçlü silencing etkisi için test edilmiştir: shRNA 132, shRNA 2, shRNA 333ve şifreli33 Tablo 1' de dahil edilir.</li>
		<li>ShRNA reaksiyonlar tavlama ve şifreli shRNA reaksiyonlar.<ol>
<li>Oligonucleotides su 100 µM için sulandırmak ve mix 1 µL ileri Oligonükleotid, 1 µL ters Oligonükleotid ve 8 µL H2O.</li>
			<li>Oligonucleotides tavlamak için aşağıdaki mix: 1 µL Oligonükleotid karışımı, 5 µL arabellek 10 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) pH 7.5, 50 mM Sodyum Klorür (NaCl), 10 mM magnezyum klorür (MgCl2), 1 mM dithioerythritol (DTE) ve 44 µL H 2 O</li>
			<li>Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) termal cycler 95 ° c 5 min için karışımı kuluçkaya, enstrüman geçiş ve oda sıcaklığında (RT) ulaşılana kadar bekleyin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Tavlanmış oligonucleotides oligonucleotides 5 µL 3 M sodyum asetat pH 5.2-50 µL komplementer ekleyerek çökelti.<ol>
<li>100 µL soğuk % 100 etanol (alkol) ekleyin ve-80 ° C'de 30 dk için kuluçkaya Maksimum hızda benchtop santrifüj 4 ° C'de 30 dk santrifüj kapasitesi</li>
			<li>Süpernatant kaldırmak, soğuk %70 500 µL eklemek alkol, 30 dk, santrifüj süpernatant kaldırmak ve Pelet 20 µL H2o çözülür</li>
			<li>Spectrophotometry, 260 Absorbans ölçme tarafından tavlanmış oligonucleotides konsantrasyonu değerlendirmek nm. Oligonucleotides 1 ng/µL son konsantrasyonu sulandırmak.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Luria Bertani (LB) orta ve LB Ağar kaplamalar hazırlamak.<ol>
<li>İçin LB orta, erime 10 g tryptone, 5 gr Maya ekstresi, 10 g NaCl 1 litre su içinde. Ortamın pH 1 kullanarak 7.0 için pH ayarlama N NaOH ve basınçlı kap.</li>
			<li>LB Ağar kaplamalar için 15 g/L agar LB orta ekleyin. Basınçlı kap ve serin aşağı yaklaşık 50 ° c Antibiyotik ekleyin ve tabakları dökün.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Çizgi ile Tet-pLKO-puro vektör transduced bakteri ( Tablo reçetesigörmek) LB agar plaka 100 µg/mL Ampisilin ile desteklenmiş ve gecede kuluçkaya 37 ° C'de (O/N)</li>
		<li>100 mL LB orta plaka 1 koloni ile 100 µg/mL Ampisilin (LB/Ampisilin) ile takıma aşılamak ve O/N 37 ° C'de sallayarak ile büyümek</li>
		<li>IsolateTet-pLKO-puro 100 mL bakteriyel kültüründen bir plasmid izolasyon kit kullanarak.</li>
		<li>EcoRI ve AgeI enzimleri ile Tet-pLKO-puro vektör kısıtlama reaksiyon aşağıdaki gibi hazırlamak: 1 µL EcoRI, 1 µL AgeI, 5 µL 10 x arabellek, 1 µL plazmid DNA (1 µg), 42 µL H2O. kuluçkaya 1 37 ° C'de s Yeterince i ciddi vektör elde etmek için 5 x 50 µL reaksiyonlar hazırlayın.</li>
		<li>% 1'özel jel i ciddi vektöründen bir DNA arıtma kit kullanarak özel jel arındırmak için kullanın. DNA verimini artırmak için özel jel DNA oranı büyük kuyu için bir özel jel tarak kullanarak ve çoğu özel bir neşter kullanarak grubun dikkatlice kaldırarak en aza indirmek.</li>
		<li>Tüp ligasyonu tepki mix aşağıdaki gibi hazırlamak: 1 komplementer ng oligonucleotides, 50 ng i ciddi vektör, 2 µL 10 x ligaz arabellek, 1 µL ligaz ve su kadar 20 µL. Ligate vektör ile tavlanmış shRNA oligonucleotides 16 ° C O/n<ol>
<li>Buna ek olarak, bir negatif kontrol tepki oligonucleotides yanlış pozitif kolonilerde neden olur uncleaved, kısmen i ciddi ve kendini ve birleştirilmiş vektör hesabı olmadan hazır olun.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Standart dönüştürme teknikleri kullanarak, dönüşüm ligasyonu karışımları kimyasal olarak yetkili bakteri hücreleri doğrudan içeren lentiviral vektörlerin homolog rekombinasyon önlemek için tasarlanmış içine tekrar eder.</li>
		<li>Bakteri plakaları Ampisilin O/N 37 ° C'de ile büyümek Not: büyüme uydu kolonilerden ortaya çıkarsa, dönüşümün tekrarlayın ve bakteri 30 ° C'de büyüme yavaş ve böylece uydu kolonileri önlemek için büyümek.</li>
		<li>Başarılı tüp ligasyonu doğrulamak için 10-20 tek koloniler, aşı 2 mL LB/Ampisilin kültürler arasında ve Ampisilin plaka hisse senedi bir tabak (pozitif bir klon daha sonra kullanılmak üzere) seç. O/N 37 ° C'de sallayarak ile sıvı kültürleri büyümek Plaka O/N 37 ° C'de kuluçkaya</li>
		<li>Parafilm ve 6 ° C'de mağaza ile plaka mühür</li>
		<li>Sıvı kültürlerden plasmid izolasyon kit kullanarak plazmid DNA izole et.</li>
		<li>Plazmid DNA XhoI enzim kullanarak Ampisilin dayanıklı kolonileri izole kısıtlama çözümlemesi gerçekleştirin. Her klon için aşağıdaki reaksiyon karışımı hazırlayın: 0.5 µL XhoI, 2.5 µL 10 x arabellek, 1 µL plazmid DNA (0,5 µg) ve 21 µL H2O. Incubate 37 ° C'de 1 h için Kısıtlama reaksiyon sonucu üzerinde % 1'özel jel tepki çalıştırarak analiz. Not: XhoI tarafından i ciddi WT vektör analizini kısıtlama 3 parçaları oluşturur: 8,447, 1800 ve 200 bp. Tet-pLKO-puro vektör 1.800 satıcısı sırayla bp olumlu klonlar shRNA-PAI-1 içeren mevcut değildir ve XhoI Özet içinde DNA parçalarının boyutu neden olur: 8,447, 190 ve 130 bp. Şekil 1' de gösterildiği gibi 2.000 bp parçası Ampisilin dayanıklı kolonileri numaradan izole DNA'bulunamadı: 3, 8 ve 11. Oligonucleotides tasarımına bağlı olarak, uzunluk ve olumlu kolonilerden DNA elde edilen parça sayısı değişebilir.</li>
		<li>Tet-pLKO-puro vektör içine shRNA sıralarının uygun ekleme sıralama8,9tarafından doğrulayın.</li>
		<li>Doğru klon içeren koloni ile 100 mL LB/Ampisilin kültürü aşılamak ve O/N 37 ° C'de büyümek</li>
		<li>Plasmid izolasyon kit kullanarak plazmid DNA izole et.</li>
	</ol></li>
	<li>Lentivirus parçacıklar nesil.
	<ol>
<li>15 cm doku kültürü çanak kat ile %0,01 steril su solüsyonu ile yemeğin yüzeyini örten tarafından Poly-L-lizin Poly-L-lizin ve RT 15 dk. için kuluçka çözüm aspirasyon tarafından kaldırmak ve bulaşıkları kuruması.</li>
		<li>Tohum 5 x 106 insan embriyonik böbrek 293 hücreler Poly-L-lizin-ceket 15 cm çanak hücrelerde (HEK293) ve Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) orta kültüründe takıma %10 FBS ve % 1 ile penisilin/streptomisin mix (kalem/Strep) 37 ° c, % 5 CO Onlar % 70 confluency ulaşana kadar 2 .</li>
		<li>Viral parçacıkların üretmek için HEK293 hücreleri 25 µg pLKO-Tet-Tarih-shRNA, 25 µg psPAX, (plazmid paketleme) ve 5 µg pMD2.G plazmid (zarf ifade plazmid) transfection reaktif kullanarak transfect. Not: psPAX ve pMD2.G plazmidleri Didier Trono laboratuarından (Ecole Polytechnique Federale de Lozan, İsviçre) bir hediyedir.</li>
		<li>HEK293 hücreleri ile 10 mM sodyum bütrat ve 20 mM HEPES pH 7.2 ve kodlamayla 8 h için takıma DMEM için orta değiştirerek ertesi gün ikna etmek.</li>
		<li>Fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) hücrelerle yıkama ve taze DMEM orta içeren 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic asit (HEPES) pH 7.2 25 mL ekleyin. 48 h 37 ° C'de kuluçka sonra dikkatli bir şekilde pipetting tarafından virüs içeren orta toplamak; sızıntıları önlemek.</li>
		<li>Toplanan orta HEK293 hücreleri kaldırmak için 0,45 µM şırınga filtre ile filtre. Viral parçacıkların içeren orta hemen veya daha sonra kullanmak üzere-80 ° C'de depolanan.</li>
	</ol></li>
	<li>Stabil transfected hücre hatları nesil
	<ol>
<li>Tohum HCT116 kolon kanser hücreleri ve MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerinin 50,000 hücreler/iyi DMEM orta % 10 fetal sığır serum (FBS) ve % 1 ile desteklenmiş kalem/Strep bir 12-şey plaka. Hücreleri % 60-70 birleşmesi kadar % 5 CO2 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>PBS hücrelerle yıkama ve virüs içeren 1 mL ekleyin orta ve kanser hücreleri ve O/N % 5 CO237 ° C'de kuluçkaya. Bir denetim olarak taze DMEM orta %10 FBS ve % 1 ile 1 mL ekleyin kalem/Strep 2 wells kanser hücreleri ile için.</li>
		<li>Virüs içeren orta aspirasyon tarafından dikkatli bir şekilde çıkarın. PBS hücrelerle yıkama ve orta DMEM için (v/v) % 10 ile tetrasiklin ücretsiz değiştirin (Tet-free) FBS ve % 1 kalem/Strep.</li>
		<li>72 h sonra yıkayın PBS hücrelerle ve orta DMEM için % 10 değiştirmek Tet-Alerjik FBS % 1 kalem/Strep, virüs transfected hücrelerin seçimini için 1 µg/mL puromisindir.<ol>
<li>Kullanılan hücre kültürünü bağlı olarak en iyi seçim için puromisindir konsantrasyon puromisindir konsantrasyonları (0.1, 0.5, 1, 2 ve 5 µg/mL) dizi sigara transduced hücrelerde test ve nerede hiçbir kontrol hücreleri hayatta en düşük konsantrasyon seçme ayarlamak Kültür 3 gün sonra.</li>
		</ol>
</li>
		<li>3-14 gün boyunca puromisindir huzurunda hücreler kültür tarafından virüs transduced hücreleri seçin. Denetimleri, iki ek wells hücreleri, bir puromisindir ve bir puromisindir olmadan içeren orta ile sigara transduced ile hazırlayın. Denetim wells için karşılaştırıldığında virüs transduced hücreleri ile puromisindir iyi tarafından kısmi öldürülmesi hücreleri gözlemlemek. Not: Sigara transduced hücreler puromisindir huzurunda genişleyemez.</li>
		<li>Puromisindir dayanıklı HCT116 kolon kanseri ve MDA-MB-231 meme kanseri hücreleri koşullu KD verimliliğini doğrulayın. Not: Doksisiklin etkin yoğunluğuna kullanılan hücre hattı ile değişir ve (arası 100 ng/mL 2 µg/ml) titre gerekir.<ol>
<li>Zehirli hücrelerin ama etkili bir downregulating protein ilgi ifade değil Doksisiklin konsantrasyonu belirlemek. Bu protokol için 1 µg/mL başarıyla kullanılan vitroyapıldı.</li>
			<li>72 h için hücreleri 0.1, 1 ve 2 µg/mL Doksisiklin de kültür. İfade downregulated protein düzeyini doğrulayın (burada, PAI-1) Batı tarafından lysate hücredeki analiz leke. ShRNA şifreli denetim hücrelere koşullu ifade HCT116 ve MDA-MB-231 hücre karşılaştırın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Klimalı orta hazırlanması
	<ol>
<li>Tohum 1 x 106 hücre stabil Doksisiklin ile transfected pLKO-shRNA içeren lentiviruses 10 cm yemeklerinde düzenlenir.</li>
		<li>Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) orta %10 Tet-Alerjik FBS ve % 1 ile hücre hatlarında büyümek kalem/Strep devamsızlık ve 72 h % 5 CO2, 37 ° C'de 1 µg/mL Doksisiklin varlığı her gün taze Doksisiklin ekleme. Not: RPMI orta monosit kültür koşulları ile uyumludur. Doksisiklin ışık duyarlı bileşiktir. Alüminyum folyo ile kaplayan tarafından gelen ışık hücre kültürleri korumak ve çalışma altında doğrudan ışığa maruz kaçının.</li>
		<li>Pipetting tarafından orta toplamak, 0,45 µm filtre ile filtre ve aliquots içinde-80 ° C'de dondurmak.</li>
	</ol></li>
</ol>2. izolasyon monosit insan kanı üzerinden
<ol><li>Monosit insan periferik kandan yalıtmak. Not: İnsan birincil monosit 7 mL beyaz kan hücrelerinin sağlıklı trombosit bağış elde bir lökosit filtresi konsantre etkilenmezsiniz. Donör bağlı olarak 1 x 109 ve 2 x 109 periferik kan mononükleer hücre (PBMCs), hangi monosit teşkil yaklaşık % 10 arasında bir lökosit filtresi üretir.<ol>
<li>İş istasyonu kabine laminar akışı hazırlayın.</li>
		<li>Makas ve laminar akış kabine 30 dk için ultraviyole ışık (UV) ile sterilize.</li>
		<li>Lökosit filtresi sprey %70 alkol ve air-dry iç kabin laminar akış.</li>
		<li>Her iki ucunda da lökosit filtresi makasla kesmek ve filtrenin içeriği 50 mL tüp içine boşaltın.</li>
		<li>%1 (v/v) FBS (PBS/FBS) içeren PBS ekleyerek 90 mL seyreltik.</li>
		<li>3 x 50 mL tüpler 15 mL yoğunluk gradient çözüm ile hazırlayın. PBS/FBS seyreltilmiş kan yavaş yavaş 30 mL katmanları karıştırma önlemek için çekim akışı degrade çözüm bir pipet denetleyicisi kullanarak ayarlayın yoğunluğu üzerinde katman.</li>
		<li>RT, 400 x g 25 min için fren olmadan, bir salıncak Open End santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Üst katmanı atmayın ve PBMCs bir taze 50 mL tüp içeren orta katman aktarın.</li>
		<li>PBS/FBS ilâ 50 mL ve 10 dakika süreyle RT de 120 x g, santrifüj trombosit içeren süpernatant kaldırmak ekleyin. Bu işlemi iki kez daha tekrarlayın.</li>
		<li>Pelet PBS/FBS 50 mL resuspend ve bir hemasitometre kullanarak PBMCs saymak. RT de 120 x g, santrifüj kapasitesi ve PBS/FBS 1 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) (PBS/FBS/EDTA) 5 x 107 hücre/mL nihai bir konsantrasyon içeren Pelet resuspend.</li>
		<li>Monosit Monositik olmayan hücreleri tükenmesi tarafından zenginleştirmek için negatif seçim setini kullanın. Not: Negatif seçim kiti bir kokteyl T hücreler, NK hücreleri, nötrofiller, B hücreleri, granülosit ve eritrositler karşı antikor (CD2 CD3, CD16, CD19, CD20, CD56, CD66b, CD123 ve glycophorin A) kullanır. Antikor kompleksleri bind Monositik olmayan bu hücrelerin yüzeyine ve dextran manyetik parçacıklar. Tüp bir mıknatıs yerleştirildiğinde, boncuk tüp duvarlar için uygun ve Monositik olmayan hücreleri çözümden kaldırmak.<ol>
<li>5 x 107 PBMCs/mL için 1 mL 50 µL antikor kokteyl ekleyin, bir pipet ile karıştırmak ve RT. ekle 50 µL manyetik boncuklar antikor kokteyl ile PBMCs için 10 min için kuluçkaya, bir pipet ile karıştırın ve RT. adlı başka bir 10 min için kuluçkaya</li>
			<li>PBS/FBS/EDTA 25 mL ve 50 mL tüp kapasiteli bir mıknatıs PBMC karışımı bir yer kadar ekleyin. 10 dk RT. boncuk tüp duvarlar için uygun ve çözüm Monositik olmayan hücrelerden çekilmek manyetik az için kuluçkaya.</li>
		</ol>
</li>
		<li>25 mL pipet kullanarak, monosit tüp içinde mıknatıs içeren çözüm kaldırın. Pipet ile tüp tarafına dokunmamaya dikkat et.</li>
		<li>Belgili tanımlık eriyik vasıl 250 x g RT, santrifüj kapasitesi, süpernatant kaldırmak ve monosit %10 Tet-Alerjik FBS ve % 1'i içeren RPMI ortamda içeren Pelet resuspend kalem/Strep.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Boyden odası geçiş tahlil
<ol><li>%1 (w/v) sığır serum albumin (BSA) çözüm BSA 1 g ultrasaf su 100 ml çözülerek hazırlamak ve sterilize etmek için 0.2 µm gözenek boyutu filtre.</li>
	<li>%1 steril BSA çözüm O/N için geliştirilmiş makrofajlar bağlılığı membran geçirgen membran ekler kuluçkaya. Monosit/makrofajlar, 5-8 µm gözenek boyutu ekler kullanın.<ol>
<li>Steril doku kültürü çanak % 1 BSA çözüm ile doldurun ve ekler çanak yerleştirin. 200 µL % 1 BSA çözüm ekler içinde geçerli.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ekler iki kez onları steril PBS ve filtre içinde uygulanan PBS dolu bir tabak koyarak yıkayın.</li>
	<li>40.000 HCT116 ya da MDA-MB-231 0.5 mL RPMI orta %10 Tet-Alerjik FBS ve % 1'i içeren hücrelerde tohum kalem/Strep başı kuyuda bir 24-şey plaka nüsha. Alternatif olarak, önceden oluşturulan şartına Orta 0.5 mL kuyuda chemoattractant kaynağı olarak yerleştirin.</li>
	<li>Ertesi gün, plaka 8.000 monosit olarak hazırlanan eklemek %10 Tet-Alerjik FBS ve % 1'i içeren RPMI Orta 0.3 mL hacminde kalem/Strep, nüsha ve % 5 CO237 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Ekler sonra 48 h toplamak. Not: Bir deneme uzunluğu bağlı olarak kullanılan, bir zaman ders deneme nerede ekler farklı kuluçka zamanlarda toplanır gerçekleştirerek hücre ve belirli koşulları optimize edilmiş olması gerekir.<ol>
<li>Fazla orta sallamak ve tam olarak değil göç hücreleri kaldırmak için bir pamuk uçlu aplikatör ile iç yüzeyi çalmak.</li>
		<li>Wright-Giemsa yöntemini kullanarak ekler dış tarafında leke.</li>
		<li>Dikkatle geçirilen makrofajlar filtresiyle yan yüzleri emin bir yüksek viskozite mikroskop daldırma yağ içinde 3 ekler/cam slayt bağlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>20 X amacı ile hafif bir mikroskop kullanarak slaytları görüntü. 9 alanlar/filtresi fotoğraf çekmek. 9 alanlar/filtresi geçirilen makrofajlar saymak.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ryding, A. D., Sharp, M. G., Mullins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+transgenic+technologies.">Conditional transgenic technologies.</a> J Endocrinol. 171 (1), 1-14 (2001).</li><li>Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-associated+macrophages+as+treatment+targets+in+oncology.">Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology.</a> Nat Rev Clin Oncol. , (2017).</li><li>Franklin, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+and+molecular+origin+of+tumor-associated+macrophages.">The cellular and molecular origin of tumor-associated macrophages.</a> Science. 344 (6186), 921-925 (2014).</li><li>Ruffell, B., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+and+therapeutic+resistance+in+cancer.">Macrophages and therapeutic resistance in cancer.</a> Cancer Cell. 27 (4), 462-472 (2015).</li><li>Sharma, P., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+immune+checkpoint+therapy.">The future of immune checkpoint therapy.</a> Science. 348 (6230), 56-61 (2015).</li><li>Mizuguchi, H., Hayakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+adenovirus-mediated+tetracycline-controllable+expression+system.">Characteristics of adenovirus-mediated tetracycline-controllable expression system.</a> Biochim Biophys Acta. 1568 (1), 21-29 (2001).</li><li>Meyer-Ficca, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+inducible+expression+systems+in+transient+transfection+studies.">Comparative analysis of inducible expression systems in transient transfection studies.</a> Anal Biochem. 334 (1), 9-19 (2004).</li><li>Wiederschain, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-vector+inducible+lentiviral+RNAi+system+for+oncology+target+validation.">Single-vector inducible lentiviral RNAi system for oncology target validation.</a> Cell Cycle. 8 (3), 498-504 (2009).</li><li>Wee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEN-deficient+cancers+depend+on+PIK3CB.">PTEN-deficient cancers depend on PIK3CB.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (35), 13057-13062 (2008).</li><li>Chen, Y., Stamatoyannopoulos, G., Song, C. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+CXCR4+by+inducible+small+interfering+RNA+inhibits+breast+cancer+cell+invasion+in+vitro.">Down-regulation of CXCR4 by inducible small interfering RNA inhibits breast cancer cell invasion in vitro.</a> Cancer Res. 63 (16), 4801-4804 (2003).</li><li>Wiznerowicz, M., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+suppression+of+cellular+genes:+lentivirus+vector-mediated+drug-inducible+RNA+interference.">Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference.</a> J Virol. 77 (16), 8957-8961 (2003).</li><li>Solari, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MYCN-dependent+expression+of+sulfatase-2+regulates+neuroblastoma+cell+survival.">MYCN-dependent expression of sulfatase-2 regulates neuroblastoma cell survival.</a> Cancer Res. 74 (21), 5999-6009 (2014).</li><li>Liao, Y., Tang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+RNAi+system+and+its+application+in+novel+therapeutics.">Inducible RNAi system and its application in novel therapeutics.</a> Crit Rev Biotechnol. 36 (4), 630-638 (2016).</li><li>Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boyden+chamber+assay.">Boyden chamber assay.</a> Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).</li><li>Jungi, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+chemotaxis+by+a+reversible+Boyden+chamber+eliminating+cell+detachment.">Assay of chemotaxis by a reversible Boyden chamber eliminating cell detachment.</a> Int Arch Allergy Appl Immunol. 48 (3), 341-352 (1975).</li><li>Jung, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+against+autocrine+motility+factor+suppress+gastric+cancer.">Monoclonal antibodies against autocrine motility factor suppress gastric cancer.</a> Oncol Lett. 13 (6), 4925-4932 (2017).</li><li>Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Sorbus+commixta+on+the+invasion+and+migration+of+human+hepatocellular+carcinoma+Hep3B+cells.">Effect of Sorbus commixta on the invasion and migration of human hepatocellular carcinoma Hep3B cells.</a> Int J Mol Med. , (2017).</li><li>Schildberger, A., Rossmanith, E., Eichhorn, T., Strassl, K., Weber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes,+peripheral+blood+mononuclear+cells,+and+THP-1+cells+exhibit+different+cytokine+expression+patterns+following+stimulation+with+lipopolysaccharide.">Monocytes, peripheral blood mononuclear cells, and THP-1 cells exhibit different cytokine expression patterns following stimulation with lipopolysaccharide.</a> Mediators Inflamm. 2013, 697972 (2013).</li><li>Heil, T. L., Volkmann, K. R., Wataha, J. C., Lockwood, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+peripheral+blood+monocytes+versus+THP-1+monocytes+for+in+vitro+biocompatibility+testing+of+dental+material+components.">Human peripheral blood monocytes versus THP-1 monocytes for in vitro biocompatibility testing of dental material components.</a> J Oral Rehabil. 29 (5), 401-407 (2002).</li><li>Tsuchiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+(THP-1).">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li><li>de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+human+peripheral+blood+monocyte+isolation.">A simple method for human peripheral blood monocyte isolation.</a> Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).</li><li>Flo, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+selection+of+human+monocytes+using+magnetic+particles+covered+by+anti-lymphocyte+antibodies.">Negative selection of human monocytes using magnetic particles covered by anti-lymphocyte antibodies.</a> J Immunol Methods. 137 (1), 89-94 (1991).</li><li>Grondahl-Hansen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasminogen+activator+inhibitor+type+1+in+cytosolic+tumor+extracts+predicts+prognosis+in+low-risk+breast+cancer+patients.">Plasminogen activator inhibitor type 1 in cytosolic tumor extracts predicts prognosis in low-risk breast cancer patients.</a> Clin Cancer Res. 3 (2), 233-239 (1997).</li><li>Borgfeldt, C., Hansson, S. R., Gustavsson, B., Masback, A., Casslen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiation+of+serous+ovarian+cancer+from+cystic+to+solid+tumors+is+associated+with+increased+expression+of+mRNA+for+urokinase+plasminogen+activator+(uPA),+its+receptor+(uPAR)+and+its+inhibitor+(PAI-1).">Dedifferentiation of serous ovarian cancer from cystic to solid tumors is associated with increased expression of mRNA for urokinase plasminogen activator (uPA), its receptor (uPAR) and its inhibitor (PAI-1).</a> Int J Cancer. 92 (4), 497-502 (2001).</li><li>Devy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pro-+or+antiangiogenic+effect+of+plasminogen+activator+inhibitor+1+is+dose+dependent.">The pro- or antiangiogenic effect of plasminogen activator inhibitor 1 is dose dependent.</a> FASEB J. 16 (2), 147-154 (2002).</li><li>Bajou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasminogen+activator+inhibitor-1+protects+endothelial+cells+from+FasL-mediated+apoptosis.">Plasminogen activator inhibitor-1 protects endothelial cells from FasL-mediated apoptosis.</a> Cancer Cell. 14 (4), 324-334 (2008).</li><li>Xu, X., Wang, H., Wang, Z., Xiao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasminogen+activator+inhibitor-1+promotes+inflammatory+process+induced+by+cigarette+smoke+extraction+or+lipopolysaccharides+in+alveolar+epithelial+cells.">Plasminogen activator inhibitor-1 promotes inflammatory process induced by cigarette smoke extraction or lipopolysaccharides in alveolar epithelial cells.</a> Exp Lung Res. 35 (9), 795-805 (2009).</li><li>Ji, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+Targeting+of+Plasminogen+Activator+Inhibitor-1+Decreases+Vascular+Smooth+Muscle+Cell+Migration+and+Neointima+Formation.">Pharmacological Targeting of Plasminogen Activator Inhibitor-1 Decreases Vascular Smooth Muscle Cell Migration and Neointima Formation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (11), 2167-2175 (2016).</li><li>Carmeliet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+role+of+plasminogen+activator+inhibitor-1+in+arterial+wound+healing+and+neointima+formation:+a+gene+targeting+and+gene+transfer+study+in+mice.">Inhibitory role of plasminogen activator inhibitor-1 in arterial wound healing and neointima formation: a gene targeting and gene transfer study in mice.</a> Circulation. 96 (9), 3180-3191 (1997).</li><li>Cao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+receptor+LRP+together+with+tPA+and+PAI-1+coordinates+Mac-1-dependent+macrophage+migration.">Endocytic receptor LRP together with tPA and PAI-1 coordinates Mac-1-dependent macrophage migration.</a> EMBO J. 25 (9), 1860-1870 (2006).</li><li>Thapa, B., Koo, B. H., Kim, Y. H., Kwon, H. J., Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasminogen+activator+inhibitor-1+regulates+infiltration+of+macrophages+into+melanoma+via+phosphorylation+of+FAK-Tyr(9)(2)(5).">Plasminogen activator inhibitor-1 regulates infiltration of macrophages into melanoma via phosphorylation of FAK-Tyr(9)(2)(5).</a> Biochem Biophys Res Commun. 450 (4), 1696-1701 (2014).</li><li>Kortlever, R. M., Higgins, P. J., Bernards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasminogen+activator+inhibitor-1+is+a+critical+downstream+target+of+p53+in+the+induction+of+replicative+senescence.">Plasminogen activator inhibitor-1 is a critical downstream target of p53 in the induction of replicative senescence.</a> Nat Cell Biol. 8 (8), 877-884 (2006).</li><li>Fang, H., Placencio, V. R., DeClerck, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protumorigenic+activity+of+plasminogen+activator+inhibitor-1+through+an+antiapoptotic+function.">Protumorigenic activity of plasminogen activator inhibitor-1 through an antiapoptotic function.</a> J Natl Cancer Inst. 104 (19), 1470-1484 (2012).</li><li>Bennett, S., Breit, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variables+in+the+isolation+and+culture+of+human+monocytes+that+are+of+particular+relevance+to+studies+of+HIV.">Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV.</a> J Leukoc Biol. 56 (3), 236-240 (1994).</li><li>Geissmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+monocytes,+macrophages,+and+dendritic+cells.">Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells.</a> Science. 327 (5966), 656-661 (2010).</li><li>Bauer, M., Goldstein, M., Heylmann, D., Kaina, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+monocytes+undergo+excessive+apoptosis+following+temozolomide+activating+the+ATM/ATR+pathway+while+dendritic+cells+and+macrophages+are+resistant.">Human monocytes undergo excessive apoptosis following temozolomide activating the ATM/ATR pathway while dendritic cells and macrophages are resistant.</a> PLoS One. 7 (6), e39956 (2012).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Hücre tiplerinin çeşitli oluşur, TME kanseri gelişimi için çok önemlidir. Optimal büyüme koşullarını tespit etmek için kanser hücrelerinin monosit kemotaktik faktör salgılanmasını aracılığıyla çekmek. Burada monosit işe alım mekanizması tümör hücreleri vitrotarafından eğitim için bir iletişim kuralı mevcut. Bu amaçla, bir indüklenebilir gen ifade sistem, arıtma birincil insan monosit ve bir geçiş yöntemi, Boyden odası tahlil bir örnek olarak kullanılır.
<p class="...

İlişkili tümör makrofajlar (TAMs) teşvik ederek tümör gelişmeye katkıda tümör büyüme, metastaz ve bağışıklık yanıtı2düzenleyen. Kanser tümör sızmak ve pro-tumorigenic TAMs3ayırt askere inflamatuar monosit hücreleri. TAMs ile tümör infiltrasyonu zavallı klinik sonuçlar ile karşılıklı olarak ilişkilendirir ve makrofajlar4,5immünsüpresif rolüne bağlı. Ancak, makrofajlar tümöre alımı mekanizmaları değil de incelenmiştir ve ilgili yollar daha iyi bir anlayış daha fazla alan ve umut verici tedavilerin ilerlemesi için çok önemlidir. Bir tümör hücreleri ve tümör microenvironment (TME) normal hücreleri arasındaki etkileşimler eğitim sorunları karmaşıklığına mekanizmaları ve hücreleri crosstalk diseksiyon izin vitro yaklaşımlar gerektiren yer var. Burada bir kanser hücre kaynaklı etkisini parakrin, salgılanan protein geçiş makrofajlar, vitrogibi diğer hücre türleri üzerinde çalışmaya uygulanan çok yönlü bir metodoloji mevcut. ShRNA karşı bir kanser hücre kaynaklı protein monosit işe dahil ifade tetrasiklin indüklenebilir düzenleyicinin kontrolü altında nerede bir sistemi kullanarak, monosit salgılanan protein parakrin etkisi quantitated. Bu protokol için düzenlenmiş vektör sunulan tetrasiklin içine shRNA dizileri klonlama istikrarlı kanser hücre hatları nesil tarafından takip. Ayrıca, birincil insan monosit ve Boyden odası tahlil arıtma monosit geçirilmesi üzerinde bir kanser hücresi elde edilen protein parakrin etkisini analiz için kullanılır.
Genlerin kodlama protein downregülasyon sınırlamalar rağmen kullanımı olmadan siRNA ve shRNA teknikleri ile yaygın olarak uygulanır. Uzun süreli knock-down (KD) genlerin deneysel sonuçlarla müdahale hücre ikincil adaptif yanıt temin. Gen ifadesinin üzerinde geçici kontrol eksikliği zamana veya rol bir proteinin hücre hayatta kalmak için çok önemli bir protein dinamik rolü çalışmaya zor yapar. Bu sorun, sadece tümör kurulduktan sonra bir protein tümör gelişimi ve ilerlemesi rolü downregülasyon ifade ilgi proteinin nerede gerektirebilir vivo içinde ayarları'nda, özellikle önemlidir. Koşullu KD çok erken bir öldürücü etkisi KD, hücrelerde ve koşulsuz KD içinde tümör geliştirme eksikliği neden olabilir ederken rol protein analizi farklı aşamalarında tümör büyüme, içinde etkinleştirmek için önleme avantajına sahiptir.
Koşullu KD sistemleri bir dizi istikrarlı KD sınırlamaları gidermek üzere geliştirilmiştir. Koşullu gen ifade sistemleri Ecdysone indüklenebilir overexpression sistemleri, sitokrom P-450 indüksiyon sistemi1, ve tetrasiklin gen ifade sistemleri düzenlenir. Tetrasiklin düzenlenir gen ifade sistemleri shRNA antibiyotik tetrasiklin (veya onun daha istikrarlı analog - Doksisiklin) eklenmesi üzerine ifade üzerinde denetim sağlar. Tet-ON sistemlerinde shRNA ifade tetrasiklin/Doksisiklin bir gen ekspresyonu KD, sonuçlanan huzurunda indüklenen Tet-OFF sistemlerinde iken, shRNA ifade gen ifadesinde kaynaklanan tetrasiklin huzurunda bastırılır. Tetrasiklin-indüklenebilir sistem yokluğunda Doksisiklin - sözde leakiness6,7, shRNA ifade daha önce bildirilen düşük seviyelerde dezavantajıdır. Tet-ON sistem burada, yapısal ifade tetrasiklin önleyici (tetra) protein Tet-yanıt veren öğe (TRE) sıra faiz shRNA organizatörü bölgedir H1 içinde bağlama tetrasiklin, yönetim anlatılan bastırılmış. ShRNA ifadesi ve çeviri tetrasiklin bağlı şekilde8,9ilgi protein inhibisyonu sonuçlanır.
Eşzamanlı knock-in sırası TATA kutusu ve proksimal sıra öğesi (PSE) arasında arasında TATA kutusu ve transkripsiyon başlamadan Chan ve arktarafından geliştirilen site TetO, diğer kullanılabilir Tet-ON sistemleri içerir. 10 bu toksik doz tetrasiklin shRNA ifade, ancak, Sigara kaynaklı bir devlet altında düzenleyen shRNA seviyeleri düşük daha az ifade gereklidir. Temel Krüppel ilişkili kutusu (KRAB) Tet-ON sistem11 KRAB, konular genlerin transkripsiyon bastırma KRAB bağlama siteye 3 kb aralığı içinde yer alan bir çinko parmak protein içerir. Chimeric protein tTRKRAB TetO için bağlayabilirsiniz, ve büyük-yelpazesine nedeniyle DNA kontrol edilebilir, TetO değil transkripsiyon arasında sınırlı olmak site ve düzenleyici başlangıç ve düzenleyici faaliyete düşük etkisi. Sigara kaynaklı durumu altında bu kontrol edilebilir RNA müdahale sistemi shRNA11,12Sızan ifade alt düzey göster rapor edilmiştir; Ancak, bir sıralı, iki-vektör klonlama yaklaşım gerektirir. İle karşılaştırıldığında daha önce geliştirilen koşullu KD sistemleri Ecdysone indüklenebilir overexpression sistemi veya sitokrom P-450 indüksiyon sistemi gibi tetrasiklin düzenlenir sistem sağlamlık ve reversibility bir avantaja sahiptir ve bu nedenle En iyi sistem13rutin olarak kullanılan. Bu protokol için kullanılan sistem gibi yalındır, tek vektör klonlama, birden fazla klon, hızlı üretimi izin gerektirir ve leakiness içinde çok az düzeyde sergileyen çift TetO çakma sistemi ve KRAB Tet-ON sistem üzerinden avantajı vardır Doksisiklin yokluğu.
TME kanseri gelişimi için önemlidir. Tümör büyümesini kolaylaştırmak için kanser hücrelerinin inflamatuar monosit kemotaktik protein salgılayan tarafından işe almak. İşe monosit tümör sızmak ve tümör büyümesini ve metastaz katkıda pro tumorigenic TAMs içine ayırt etmek. Vitro çalışmalar bağışıklık hücre alımı geçiş deneyleri kullanmak, Boyden ile14,15,16,17odası tahlil yaygın olarak kullanılır. Bu tahlil, chemoattractant protein kaynağı, örneğin, kanser hücrelerini veya saf protein alt Kamara içinde yer alıyor. Bağışıklık hücreleri geçirgen membran üzerinden alt bölme ile ayrılmış üst odası yer alır. Doğru chemoattractant, ve bu membran alt tarafında bulunan artan Degrade geçiş hücreleri lekeli ve mikroskop altında sayılır. Burada plazminojen aktivatör inhibitörü 1 (PAI-1) chemoattractant fonksiyonu monosit üzerinde nerede ifade PAI-1 Doksisiklin ek tarafından düzenlenmiştir istikrarlı, indüklenebilir kanser hücre hatları oluşturarak test ediyoruz. İnsan birincil monosit Boyden odası geçiş assay olarak PAI-1 rolde monosit geçiş değerlendirmek için kullanıyoruz. İnsan birincil monosit ve THP1 gibi yaygın olarak kullanılan Monositik hücre hatları arasındaki farklılıkları bildirilmiştir ve farklı sitokin ifade desenleri18içerir; Örneğin, 5-10 kat artış TNF-α ifade düzeylerinde THP1 hücreleri tarafından insan monosit19' a karşılaştırılır. THP1 hücreleri insan lösemi Monositik hücrelerden türetilir, kolay korumak ve 19-50 h20saat iki katına ortalama ile çoğalırlar. Tam tersine, insan monosit yokluğunda büyüme faktörleri, kısa bir ömrü ile karakterizedir. Monosit bireyler arasında ve arıtma yöntemine bağlı olarak değişkenlik adil bir miktar oluşur bağış, kandan arındırılmış bu yana diğer hücre tipleri ile kontaminasyon oluşabilir. Bununla birlikte, birincil monosit ilgilidir ve kullanın veya birincil monosit Biyolojik araştırma19' kullanarak Monositik hücre hatları ile elde edilen sonuçları onaylamak için tavsiye edilir. Burada insan birincil monosit periferik kandan arınma için bir protokol açıklayın. Monosit arınma alternatif yöntemleri yoğunluk gradient ve yapışma protokolleri ve iki adım prosedürü Ficoll-Hypaque bir Percoll degrade21tarafından takip tek degradelerle içerir. Bu yöntemleri aralıkların % 70-90 arasında elde edilen monosit nüfus saflığı. Burada açıklanan yöntemi ile negatif bağışıklık seçimi22 takip yoğunluğu degradesi kullanan ve antikorlar ile doğrudan temas olmadan insan monosit arıtma böylece yanlışlıkla onların harekete geçirmek kaçınarak ve sonuçlanan sağlar bir > % 95 monosit saf nüfusu.
Burada sunulan Protokolü gen ekspresyonu KD insan kanser hücre hatlarında için işlevsel bir Tet-ON sistemi oluşturmak için kanser kaynaklı salgılanan protein PAI-1 monosit chemoattractant etkisini incelemek için kullanılır. PAI-1 tümörler çeşitli tarafından overexpressed ve onun ifade paradoksal zavallı klinik sonuç23,24ile karşılıklı olarak ilişkilendirir. PAI-1 pro-tumorigenic rolü, pro-anjiogenik bir sonucudur ve anti-apoptotik25,26çalışır. PAI-1 makrofajlar iltihap27sitesine istihdamı teşvik ederek iltihap için katkıda bulunmak için gösterilmiştir. PAI-1 düz kas cellmigration28,29 teşvik etmelerini ve Mac-1 bağımlı makrofaj geçiş30' gösterildi. PAI-1 overexpression zamanda ham 264.7 makrofajlar işe alım B16F10 Melanom tümörler31içine önemli ölçüde artırmak için gösterilmiştir. Ancak, PAI-1 rolde TAM geçiş ayrıntılı olarak araştırmış değil. Olup PAI-1 monosit kanser hücrelerine çeken soruyu cevaplamak için açıklanan protokolünü kullanır. Bu metodoloji diseksiyon tümör ve TME arasında çapraz karışma kanser hücrelerinde salgılanan protein susturmak ve TME bileşenlerini analiz sağlar.

<table><tbody><tr><td>Tet-pLKO-puro lentiviral vector</td><td>Addgene</td><td>21915</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Tetracycline-free)</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-15</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>10771-500ML</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Human Monocyte Enrichment Kit</td><td>StemCell</td><td>19059</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Magnet</td><td>StemCell</td><td>18002</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI HF</td><td>NEB</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>AgeI HF</td><td>NEB</td><td>R3552S</td><td></td></tr><tr><td>Cut Smart buffer</td><td>NEB</td><td>B7200S</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>PROMEGA Wizard SV Gel and PCR Cleanup System</td><td>PROMEGA</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>psPAX vector</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G vector</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Stbl3 Chemically Competent&amp;nbsp;E. coli</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C737303</td><td></td></tr><tr><td>Hema 3 stain set for Wright-Giemsa stain</td><td>Protocol</td><td>123-869</td><td></td></tr><tr><td>HEK293 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>XhoI restriction enzyme</td><td>NEB</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Ligase buffer</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R1021</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>The Big Easy&quot; EasySep Magnet</td><td>Stem Cell</td><td>18001</td><td></td></tr><tr><td>0.1% Poly-L-Lysine solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7670</td><td></td></tr><tr><td>Sodium butyrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;mu;M syringe filters</td><td>VWR International</td><td>28145-479</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500g</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td><td>Invitrogen</td><td>15504-020</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride(NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-5 kg</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100g</td><td></td></tr><tr><td>dithioerythritol (DTE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8255-5g</td><td></td></tr><tr><td>ethanol (EtOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792780</td><td></td></tr><tr><td>tryptone</td><td>Amresco</td><td>J859-500g</td><td></td></tr><tr><td>yeast extract</td><td>Fluka</td><td>70161-500g</td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9393-5g</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>puromycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9620</td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline hyclate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-25g</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA pH 8.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R1021</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Permeable Support for 24 Well Plate with 8.0&amp;mu;m Transparent PET Membrane</td><td>Becton Dickinson</td><td>353097</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Cotton-Tipped Applicator&amp;nbsp;</td><td>Medline</td><td>MDS202000</td><td></td></tr><tr><td>Protocol Hema 3 STAT pack&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>123-869</td><td></td></tr><tr><td>Resolve Immersion Oil, High Viscosity</td><td>Richard Allan Scientific</td><td>M4004</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr></tbody></table>

conditional knockdown of gene expression in cancer cell lines to study the recruitment of monocytes/macrophages to the tumor microenvironment

siRNA ve gen ifadesinin düzenlenmesine (KD) yöntemleri yıkmak shRNA-aracılı protein ve gen işlevini anlamak için çok değerli araçlardır. Ancak, KD ilgi proteinin hücre öldürücü etkisi veya KD beklenen etkisini durumda Saat-bağımlı, koşulsuz KD yöntemleri uygun değildir. Koşullu sistemleri bu gibi durumlarda en uygun ve çok ilgi konusu olmuştur. Bunlar Ecdysone-indüklenebilir overexpression sistemleri, sitokrom P-450 indüksiyon sistemi1, ve tetrasiklin gen ifade sistemleri düzenlenir.
Düzenlenmiş tetrasiklin gen ifade sistem indüksiyon shRNA ifade tetrasiklin huzurunda tarafından protein ifade üzerinde ters çevrilebilir kontrol sağlar. Bu protokol için biz gen ekspresyonu koşullu düzenlenmesi için insan kanser hücre hatlarında fonksiyonel Tet-ON sistemiyle bir deneysel tasarım mevcut. Sonra tümör hücre-monosit etkileşim çalışma programında küçük bir sistem kullanımını göstermektedir.

Üç shRNA dizileri en verimli KD, PAI-1 için test edildi. Bunun için yukarıda açıklanan protokol sonrası Tet-pLKO-puro ifade vektör içine shRNA dizileri PAI-1 ve şifreli (Tablo 1) karşı klonlanmış. HT-1080 Fibrosarkom hücre kültürünü stabil oluşturulan yapıları ile transfected ve hücreleri 3 gün boyunca Doksisiklin ile tedavi edildi. PAI-1 ifade tarafından Western Blot ()şekil 2Adoğrulandı) ve PAI-...

Watch this Scientific Journal Video about Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment at JoVE.com

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Bu iletişim kuralı olarak bir düzeni kanser hücre satırları ve sonraki kullanımı, işlevsel bir Tet-ON sistemi kurmak için özellikle monosit/makrofajlar tümör microenvironment için işe alım içinde tümör hücre kaynaklı proteinlerin rolü eğitimi için hizmet vermektedir.

Monosit/makrofajlar tümör Microenvironment için işe alım çalışmaya kanser hücre hatlarında gen ifadesinin koşullu nakavt

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

conditional-knockdown-gene-expression-cancer-cell-lines-to-study

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Cancer Research

12.3K Görüntüleme.  University of Southern California. Bu iletişim kuralı olarak bir düzeni kanser hücre satırları ve sonraki kullanımı, işlevsel bir Tet-ON sistemi kurmak için özellikle monosit/makrofajlar tümör microenvironment için işe alım içinde tümör hücre kaynaklı proteinlerin rolü eğitimi için hizmet vermektedir.

Video: Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful immunotherapies. Several studies have indicated that tumor infiltrating myeloid cells (e.g., myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) and tumor-associated macrophages (TAMs)) suppress cytotoxicity of CD8+ T cells in the tumor microenvironment, and that targeting these regulatory myeloid cells can improve immunotherapies. Here, we present an in vitro assay system to evaluate immune suppressive effects of monocytic-MDSCs and TAMs on the tumor-killing ability of CD8+ T cells. To this end, we first cultured na&#239;ve splenic CD8+ T cells with anti-CD3/CD28 activating antibodies in the presence or absence of suppressor cells, and then co-cultured the pre-activated T cells with target cancer cells in the presence of a fluorogenic caspase-3 substrate. Fluorescence from the substrate in cancer cells was detected by real-time fluorescence microscopy as an indicator of T-cell induced tumor cell apoptosis. In this assay, we can successfully detect the increase of tumor cell apoptosis by CD8+ T cells and its suppression by pre-culture with TAMs or MDSCs. This functional assay is useful for investigating CD8+ T cell suppression mechanisms by regulatory myeloid cells and identifying druggable targets to overcome it via high throughput screening.

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

We describe here a protocol to investigate cytotoxicity of pre-activated CD8+ T cells against cancer cells by detecting apoptotic cancer cells via real-time microscopy. This protocol can investigate mechanisms behind myeloid cell-induced T cell suppression and evaluate compounds aimed at replenishing T cells via blockade of immune suppressive myeloid cells.

Gerçek zamanlı hafiye-in Vitro tümör hücre Apoptosis içinde CD8 tarafından indüklenen+ T hücreleri Myeloid hücrelerin tümör infiltre bağışıklık baskılayıcı işlevlerini çalışmaya

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Kanser Araştırmaları

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a malignant brain tumor with no cure, has up to a half the tumor mass TAMs. TAMs can be pro-tumoral or anti-tumoral, depending on the activation of specific genes in the cells. Genetic mutations in the tumors, through regulating cytokine expression, can affect recruitment of TAMs to the tumor microenvironment. Here, we describe a quantitative cell-based assay to assess macrophage recruitment by the conditioned medium from the tumor cells. This assay uses the human macrophage cell line MV-4-11 to study macrophage attraction by the conditioned medium from glioblastoma, allowing for high reproducibility and low variability. Data generated with this assay can contribute to a better understanding of the interaction between the tumor and the tumor microenvironment. Similar assay can be used to assess interaction between the tumor cells and other immune cells, including T cells and natural killer (NK) cells.

This article represents a useful in vitro assay to evaluate the capability of conditioned medium from tumor cells to attract macrophages.

In vitro assay tümör çalışma-macrophage etkileşim

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer growth and metastasis. Paracrine signals can involve cell-cell contact between different cell types, such as PD-L1 expressed on the surface of tumors interacting directly with PD-1 on the surface of T cells, or the secretion of ligands by a tumor cell to affect an immune cell. Here we describe a co-culture method to interrogate the effects of tumor-secreted ligands on immune cell (macrophage) activation. This straightforward procedure utilizes commercially available 0.4 &#181;m polycarbonate membrane permeable supports and standard tissue culture plates. In the process described, macrophages are cultured in the upper chamber and tumor cells in the lower chamber. The presence of the 0.4 &#181;m barrier allows for the study of intercellular signaling without the confounding variable of physical contact, because the two cell types share the same medium and exposure to paracrine ligands. This approach can be combined with others, such as genetic alterations of the macrophage (e.g., isolation from genetic knock-out mice) or tumor (e.g., CRISPR-mediated alterations) to study the role of specific secreted factors and receptors. The approach also lends itself to standard molecular biological analyses such as quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) or Western blot analysis, without the need for flow sorting to separate the two cell populations. Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) can similarly be utilized to measure secreted ligands to better understand the dynamic interaction of cell signaling in the multiple cell type context. Duration of co-culture can also be varied for the study of temporally regulated events. This co-culture method is a robust tool that facilitates the study of tumor-secreted signals in the immune context.

Here, we present a method using permeable membrane supports to facilitate the study of non-contact paracrine signaling used by tumor cells to suppress the immune response. The system is amenable to studying the role of tumor-secreted factors in dampening macrophage activation.

Permeable Membran Destekleri ile Co-Culture kullanarak Tümör Salgılanan Parakrin Ligandların Makrofaj Aktivasyonu Üzerine Etkilerinin İnceleştirilmesi

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These acquired abnormalities in complex, multilayered molecular signaling networks induce aberrant cell proliferation and survival, extracellular matrix degradation, and metastasis to distant organs. Approximately 90% of cancer-related deaths are estimated to be caused by the direct or indirect effects of metastatic dissemination. Therefore, it is important to establish a highly reliable, comprehensive system to characterize cancer cell behaviors upon genetic and environmental manipulations. Such a system can give a clear understanding of the molecular regulation of cancer metastasis and the opportunity for successful development of stratified, precise therapeutic strategies. Hence, accurate determination of cancer cell behaviors such as migration and invasion with gain or loss of function of gene(s) allows assessment of the aggressive nature of cancer cells. The real-time measurement system based on cell impedance enables researchers to continually acquire data during a whole experiment and instantly compare and quantify the results under various experimental conditions. Unlike conventional methods, this method does not require fixation, staining, and sample processing to analyze cells that migrate or invade. This method paper emphasizes detailed procedures for real-time determination of migration and invasion of glioblastoma cancer cells.

Cancer is a lethal disease due to its ability to metastasize to different organs. Determining the ability of cancer cells to migrate and invade under various treatment conditions is crucial to assessing therapeutic strategies. This protocol presents a method to assess the real-time metastatic abilities of a glioblastoma cancer cell line.&#160;

Empedans tabanlı Gerçek Zamanlı Kanser Hücre Göçü ve İstilası Ölçümü

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

İnsan Çift Gradient Santrifüj ile Monositlerinde ve teflon kaplı Hücre Kültürü Çantalar Makrofagların Onların Farklılaşma İzolasyonu

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Robust Discovery Platform for the Identification of Novel Mediators of Melanoma Metastasis

Metastasis is a complex process, requiring cells to overcome barriers that are only incompletely modeled by in vitro assays. A systematic workflow was established using robust, reproducible in vivo models and standardized methods to identify novel players in melanoma metastasis. This approach allows for data inference at specific experimental stages to precisely characterize a gene's role in metastasis. Models are established by introducing genetically modified melanoma cells via intracardiac, intradermal, or subcutaneous injections into mice, followed by monitoring with serial in vivo imaging. Once preestablished endpoints are reached, primary tumors and/or metastases-bearing organs are harvested and processed for various analyses. Tumor cells can be sorted and subjected to any of several 'omics' platforms, including single-cell RNA sequencing. Organs undergo imaging and immunohistopathological analyses to quantify the overall burden of metastases and map their specific anatomic location. This optimized pipeline, including standardized protocols for engraftment, monitoring, tissue harvesting, processing, and analysis, can be adopted for patient-derived, short-term cultures and established human and murine cell lines of various solid cancer types.

This article describes a workflow of techniques employed for testing novel candidate mediators of melanoma metastasis and their mechanism(s) of action.

Melanom Metastazının Yeni Arabulucularının Belirlenmesi için Sağlam Bir Keşif Platformu

Metastasis is a complex process, requiring cells to overcome barriers that are only incompletely modeled by in vitro assays. A systematic workflow was ...

An Ectopic Chemokine Expression Model for Testing Macrophage Recruitment In Vivo

Zebrafish are widely used in basic and biomedical research. Many zebrafish transgenic lines are currently available to label various types of cells. Owing to the transparent embryonic body of zebrafish, it is convenient for us to study the effect of one chemokine on the behavior of a certain type of cells in vivo. Here we provided a workflow to investigate the function of a chemokine on macrophage migration in vivo. We constructed a tissue-specific overexpression plasmid to overexpress IL-34 and injected the plasmid into one-cell stage transgenic fish embryos whose macrophages were specifically labeled by a fluorescent protein. We then used whole mount fluorescent in situ hybridization and immunostaining to detect the pattern of the chemokine expression and the number or location of macrophages. The injected WT embryos were raised to generate a stable transgenic line. Finally, we used confocal live imaging to directly observe macrophage behavior in the stable transgenic fish to study the function of IL-34 on macrophages in vivo.

To test the effect of a chemokine on macrophage recruitment in vivo, the whole mount in situ hybridization was used to detect the ectopic expression of the chemokine, and immunostaining was used to label macrophages. Live imaging was used for real-time observation of macrophage migration.

Vivo Makrofaj İşe Test için Bir Ektopik Kemokin İfade Modeli

Zebrafish are widely used in basic and biomedical research. Many zebrafish transgenic lines are currently available to label various types of cells. Owing ...

Gelişim Biyolojisi

<meta charset="utf8"></head><body>Makrofaj-Tümör Sferoid Etkileşimlerinin 3 Boyutlu Kollajen Matriks Kurulumunda İncelenmesi

A Macrophage-Tumor Spheroid Co-Invasion Assay

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few protocols are available that allow an in vitro approximation of the in vivo situation. Here, we present a novel approach to observing the impact of human macrophages on the invasiveness of cancer cells, using tumor spheroids of H1299 non-small cell lung carcinoma cells embedded in a three-dimensional (3D) collagen I matrix. With this co-cultivation setup, we tested the impact of small interfering RNA (siRNA)-based depletion of regulatory factors in macrophages on the 3D invasion of cancer cells from the tumor spheroid compared to controls. This method allows the determination of different parameters, such as spheroid area or the number of invading cancer cells, and thus, to detect differences in cancer cell invasion. In this article, we present the respective setup, discuss the subsequent analysis, as well as the advantages and potential pitfalls of this method.

<meta charset="utf8"></head><body>Bir Makrofaj-Tümör Sferoid Ko-İnvazyon Testi

Here, we present a protocol to investigate the interaction of primary human monocyte-derived macrophages with a tumor spheroid in a three-dimensional (3D) collagen I matrix, with the possibility to compare the impact of soluble and physical properties of the microenvironment on cell invasion.

Bir Makrofaj-Tümör Sferoid Ko-İnvazyon Testi

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few ...

Monosit/makrofajlar tümör Microenvironment için işe alım çalışmaya kanser hücre hatlarında gen ifadesinin koşullu nakavt

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Gerçek zamanlı hafiye-in Vitro tümör hücre Apoptosis içinde CD8 tarafından indüklenen⁺ T hücreleri Myeloid hücrelerin tümör infiltre bağışıklık baskılayıcı işlevlerini çalışmaya

In vitro assay tümör çalışma-macrophage etkileşim

Permeable Membran Destekleri ile Co-Culture kullanarak Tümör Salgılanan Parakrin Ligandların Makrofaj Aktivasyonu Üzerine Etkilerinin İnceleştirilmesi

Empedans tabanlı Gerçek Zamanlı Kanser Hücre Göçü ve İstilası Ölçümü

İnsan Çift Gradient Santrifüj ile Monositlerinde ve teflon kaplı Hücre Kültürü Çantalar Makrofagların Onların Farklılaşma İzolasyonu

Melanom Metastazının Yeni Arabulucularının Belirlenmesi için Sağlam Bir Keşif Platformu

Vivo Makrofaj İşe Test için Bir Ektopik Kemokin İfade Modeli

Bir Makrofaj-Tümör Sferoid Ko-İnvazyon Testi

Bir Makrofaj-Tümör Sferoid Ko-İnvazyon Testi

Bir Makrofaj-Tümör Sferoid Ko-İnvazyon Testi