诱导和可逆显性阴性 (dn) 蛋白抑制

此方法可以帮助回答各种领域中的关键问题，这些领域要求对感兴趣的基因进行有条件和暂时的失活，方法是可逆地过度表达其显性的负面版本。这种技术的主要优点是，它只允许在蛋白质活性中部分消融，从而保留残余的内源性表达。虽然，在这里我们描述了RB蛋白的条件灭活，在多美体组装中功能，这种方法也可以应用于单体蛋白质。

乌梅什·皮亚库雷尔，我们的实验室技术员和手稿的合著者将演示这些程序。首先，使用含有10%胎儿牛血清的推荐细胞培养条件，按照供应商的规格，在37摄氏度下以5%CO2生长NIH3T3细胞。要使用 pTet-Splice 和 pCMV-Tet3G 载体对细胞进行共转接，首先将两到四微升的脂质转染试剂混合到每井，每井一毫升不完整的 DMEM 在 15 毫升管中，并在室温下孵育 5 分钟。

将每井添加两到三微克的血浆DNA，加入这种转染试剂的DMEM混合物。在室温下混合并孵育20分钟。加入含有DNA和DMEM中转染试剂的混合物的一毫升，加入与NIH3T3细胞的六井板的每个井中。

在37摄氏度的37摄氏度下孵育3至4个小时后，加入1毫升完整的介质。然后，在每个井中加入2微升的多氧环素库存，并将板标为加号多氧环素。用5%CO2在37摄氏度下孵育细胞。

为了评估 TetO-DN-CB-myc6-Rb1 结构在促进计划外细胞增殖方面的功能，在允许的条件下，在 DMEM 中培养含有 10% FBS 的培养性 HEI-OC1 细胞。对于细胞增殖研究，使用细胞计数器计算 HEI-OC1 细胞。每井每井有1万个 HEI-OC1 细胞，每个井的体积为 200 微升。

在33摄氏度下夜间孵育细胞，用5%的二氧化碳孵育细胞。为了诱导转基因表达，每毫升多氧环素加入一微克，加入转染的 HEI-OC1 细胞子集。使用标记为负多氧环素和未转染的 HEI-OC1 细胞的其他子集作为对子对，用 10% CO2 将细胞孵育为 33 摄氏度。

为了评估细胞增殖，转染后48小时，去除细胞培养基，从细胞增殖试剂盒中加入100微升1x染料结合溶液，进入微板的每个井中。按照制造商的规程，在37摄氏度下孵育一小时。使用荧光微孔板读取器测量每个样品的荧光强度。

为了使用免疫细胞化学进一步评估细胞增殖，将 HEI-OC1 细胞板放在 DMEM 中 12 井板的每个井的盖玻璃上。在33摄氏度下孵育细胞过夜。第二天，用pTet-Splice和pCMV-Tet3G载体将细胞与两口孔中的细胞进行共转，然后对一个孔进行多氧环素治疗，以及使用NIH3T3细胞进行。

使用一个未转换的以及一个控件。要处理Ki-67标签的细胞，在室温下用4%的甲醛在PBS中固定10分钟。之后，用冰冷PBS洗三次，每次五分钟。

在PBS中加入0.25%的非日洗涤剂，孵育10分钟。在 PBS 中重复洗涤三次，每次五分钟。使用10%血清阻断细胞。

在室温下加湿室中一小时。加入500微升Ki-67原抗体，在4摄氏度下孵育过夜。在PBS中再次清洗细胞三次，每次五分钟。

加入一毫升的二次抗体，在黑暗中室温下孵育细胞一小时。去除二次抗体溶液后，在黑暗中用PBS再次清洗细胞三次，五分钟。要给 HEI-OC1 细胞贴上 phaloidin 的标签，在室温下在 1:200 phalloidin 中孵育它们 30 分钟。

要给细胞核贴上标签，在室温下用每毫升DAPI5微克孵育细胞10分钟。在转基因小鼠分娩后，使用手稿中所述的CBRb1融合区域的底像对幼崽进行基因型。将成年TetO-DN-CB-myc6-Rb1小鼠繁殖到ROSA-CAG-rtTA和特乐林诱导线，以生成实验性DN-CBRb小鼠，并按照手稿所述对它们的后代进行基因型。

NIH3T3不表达内源性RB1蛋白，因此此处看到的强健RB1表达是由于在Dex存在的情况下进行转基因诱导，但不是在它不存在的情况下，证实了TetO-DN-CB-myc6-Rb1混合RB1结构的高效激活。相比之下，HEK293细胞具有内源性RB1表达。多氧环素的加入导致 Teto-DN-CB-myc6-Rb1 激活和 RB1 下调节。

从介质上去除多西环素21小时后，RB1表达恢复。与未用多氧环素治疗的转染细胞和未转染细胞相比，与未使用多氧环素治疗的转染细胞和未转染细胞相比，与同性载体共感染的 HEI-OC1 细胞相比，在多氧环素治疗后，细胞数量略有显著增加。荧光原位杂交证实了小鼠TetO-DN-CB-myc6-RB1转基因的基因组插入。

与对照组相比，用多氧环素治疗的转基因小鼠耳蜗中RB1蛋白表达总量首次增加三天。然而，在用多十环素治疗的群体中，观察到RB1表达显著减少。无论分析的组织如何，在用多十环素治疗的转基因小鼠中观察到RB1蛋白显著减少，但在对照组中未观察到，证实了TetO-DN-CB-myc6-RB1结构的效率。

在尝试此过程时，必须验证转基因的每个编码元素是否彼此在帧中。如果本报告中描述的凯德普辛B和视网膜母细胞瘤的编码区域偶然地连接在框架外，它就不会产生预期的融合蛋白。因此，在将转基因注入单细胞小鼠胚胎之前，必须进行DNA序列验证。

按照这个程序，无处不在的CAG启动子可以替换为特定的启动子，以研究细胞的特定方式的基因功能。