Bu yöntem Alzheimer hastalığı araştırma alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir, özellikle erken olaylar büyüme koni çöküşü dahil. Bu tekniğin en büyük avantajı, amiloid beta tedavisinden hemen sonra aksonal büyüme konileri görselleştirmek ve analiz etmektir. Antibiyotik olmadan nöron kültür ortamda embriyonik gün-14 farelerden taze izole serebral kortekskıyma mikro-makas kullanarak başlayın.
Dokuları toplayın ve 87G'de üç dakika boyunca dokuları santrifüj edin. Santrifüjden sonra, supernatant çıkarın ve pelet için% 0.05 trypsin iki mililitre ekleyin. 37 santigrat derece 15 dakika kuluçka ve her beş dakikada bir dokunarak karıştırın.
15 dakika sonra, tripsin nötralize etmek için orta A dört mililitre ekleyin ve dokunarak karıştırın. Sonra dokuları 178 kez G'de üç dakika santrifüj edin. Supernatant çıkardıktan sonra, DNaase ve soya tripsin inhibitörü çözeltisi ekleyin ve daha önce olduğu gibi her beş dakikada bir karıştırma ile 37 santigrat derece 15 dakika kuluçka.
Kuluçka süresi dolduğunda, daha önce olduğu gibi orta A.Mix ve santrifüj dört mililitre ekleyin. Supernatant çıkardıktan sonra, orta A dört mililitre ekleyin ve hiçbir enkaz gözlenene kadar cilalı Pasteur pipet ile dokuları triturate. Ardından, 70 mikron gözenek boyutunda örgü ile tritulenmiş dokuları filtreleyin.
Filtrasyondan sonra, hücreleri hemositometre ile sayın ve hücre yoğunluğunu hesaplayın. Pipet 0.8 kez 10 orta A dördüncü hücrelere sekiz kuyukültür slayt her kuyuiçine. Daha sonra 37 santigrat derecede %10 CO2 nemli bir atmosferde kuluçkaya yatırın.
Dört saatlik kültürden sonra, kültür ortamını orta b.Bu yöntemi kullanan nöronların saflığı yaklaşık %75'tir Ticari olarak elde edilen tam uzunlukta a beta 42'nin taze bir şişesini açarak ve içindekileri steril, damıtılmış sudaki içeriğini 0,5 milimolar konsantrasyonuna eriterek bu testi en az bir hafta önceden başlatın. Toplama ve toksisite yi tetiklemek için 7 gün boyunca 37 derecede kuluçkaya yat. Toplu A beta 1-42 aliquots hazırlayın ve kullanıma kadar eksi 80 santigrat derece saklayın.
Nöronal kültürün dördüncü gününde, daha önce gösterildiği gibi bir saat boyunca orta B'de 0,5 mikromolar toplanmış 100 mikrolitre ile kuyuları tedavi edin. Saat geçtikten sonra, kültür ortamını çıkarın ve hemen bir sıcak plaka üzerinde 37 santigrat derece bir saat pbs% 4 sakaroz içeren% 4 paraformaldehit ile nöronlar düzeltmek. Büyüme konilerinin şeklini korumak bu protokol için çok önemli olduğundan fiksasyon en önemlidir.
Fiksasyondan sonra, nöronları PBS ile üç kez yıkayın. Sonra oda çıkardıktan sonra, sulu bir montaj ortamı ile nöronlar monte. Montaj ortamını dört derecede 2-4 gün kurulayın.
Ters bir mikroskop üzerinde 20X kuru objektif ile her kuyunun tüm alanını yakalayın. Her kuyudaki tüm alanı yakalamak ve analiz etmek öznellikten kaçınmak için önemlidir. Üçüncü veya dördüncü evredeki her nöronun en uzun nöritlerini akson olarak sınıflandırın.
Lamellipodia eksik veya üç filopodia daha az sahip aksonal büyüme konileri çökmüş büyüme konileri olarak kabul edilir. Kuluçkadan önce burada gösterilen beta 1-42 oligomerleri, 7 günlük kuluçkadan sonra 37 santigrat derecede toplanır. A beta 1-42 ile birleştirilmiş tedaviden sonra, A beta toksik oligomer için bir antikor ile immünboyama A beta 1-42 tedavi nöronlar kırmızı pozitif boyama gösterir, ancak araç tedavi nöronlar.
Beta 1-42 tedavisi ile indüklenen erken olgular kültürde dört gün sonra analiz edildi. Tanımlanan aksonlar, yeşil renkte gösterilen MAP-2'de kırmızı ve negatif immünoboyama ile gösterilen aksonal belirteç tau-1 için pozitif immünboyama ile doğrulandı. Araç tedavisi bir saat sonra, büyüme konileri lamellipodia ve birkaç filopodia yayıldı.
Bunlar sağlıklı büyüme konileri olarak tanımlanmış. Tersine, Bir beta 1-42 tedavi bir saat hiçbir lamellipodia veya filopodia geliştirilen küçülmüş büyüme konileri yol açtı. Bunlar çökmüş büyüme konileri olarak tanımlandı.
Bu yordamı çalışırken, benim-nor-idge bu fiksasyon protokolü en iyi 37 santigrat derece% 4 PFA ve% 4 sakaroz ile hücreleri düzeltmek için hatırlamak önemlidir. Bu protokolü takiben, akson büyüme konilerinin ne zaman ve nasıl çöktüğü ve çöken büyüme kozalalarının nasıl kurtarıldığı gibi ek soruları yanıtlamak için canlı hücre görüntüleme ve gen transfeksiyonu gibi diğer yöntemler de uygulanabilir.
