Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación de la enfermedad de Alzheimer, especialmente los primeros eventos involucrados en el colapso del cono de crecimiento. La principal ventaja de esta técnica es hacer posible visualizar y analizar los conos de crecimiento axonal inmediatamente después del tratamiento con beta amiloide. Comience por usar micro-tijeras para picar cortices cerebrales recién aislados de ratones embrionarios del día 14 en medio de cultivo de neuronas sin antibióticos.
Recoger los tejidos y centrifugar los tejidos a 87G durante tres minutos. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y agregue dos mililitros de 0.05%trypsin al pellet. Incubar durante 15 minutos a 37 grados centígrados y mezclar tocando cada cinco minutos.
Después de 15 minutos, agregue cuatro mililitros de medio A para neutralizar la trippsina, y mezcle tocando. Luego centrifuga los tejidos a 178 veces G durante tres minutos. Después de retirar el sobrenadante, añadir DNAse y la solución inhibidora de la trippsina de soja e incubar durante 15 minutos a 37 grados Centígrados con la mezcla cada cinco minutos como antes.
Cuando transcurra el tiempo de incubación, añada cuatro mililitros de A.Mix medio y centrífuga como antes. Después de retirar el sobrenadante, añadir cuatro mililitros de medio A y triturar los tejidos con una pipeta Pasteur pulida hasta que no se observen residuos. A continuación, filtre los tejidos triturados con malla del tamaño de un poro de 70 micras.
Después de la filtración, cuente las células con un hemocitociómetro y calcule la densidad celular. Pipetear 0,8 veces 10 a las cuartas celdas en el medio A en cada pozo de un portaobjetos de cultivo de ocho pozos. Luego incubar en una atmósfera humidificada de 10%CO2 a 37 grados centígrados.
Después de cuatro horas de cultivo, cambiar el medio de cultivo a medio B.La pureza de las neuronas que utilizan este método es aproximadamente 75%Comenzar este ensayo con al menos una semana de antelación abriendo un vial fresco de longitud completa de A beta 42 obtenido comercialmente y disolviendo el contenido en agua estéril y destilada a una concentración de 0,5 mililitros. Incubar a 37 grados centígrados durante siete días para inducir la agregación y la toxicidad. Preparar alícuotas de A beta 1-42 agregada y almacenar a menos 80 grados Celsius hasta su uso.
En el cuarto día del cultivo neuronal, tratar los pozos con 100 microlitros de 0,5 micromolares agregados A beta 1-42 o solución vehisaria en medio B durante una hora como se ha demostrado anteriormente. Una vez transcurrido la hora, retire el medio de cultivo e inmediatamente fije las neuronas con 4%paraformaldehído que contiene 4%sacarosa en PBS durante una hora a 37 grados Celsius en una placa caliente. La fijación es más importante, ya que mantener la forma de los conos de crecimiento es fundamental para este protocolo.
Después de la fijación, lavar las neuronas tres veces con PBS. Luego, después de retirar la cámara, monte las neuronas con un medio de montaje acuoso. Seque el medio de montaje a cuatro grados centígrados durante dos o cuatro días.
Capture toda el área de cada pozo con una lente objetivo seca 20 veces en un microscopio invertido. Capturar y analizar toda el área en cada pozo es importante para evitar la subjetividad. Clasificar las neuritas más largas de cada neurona en la etapa tres o cuatro como axones.
Los conos de crecimiento axonal que carecen de lamellipodia o poseen menos de tres filopodias se consideran conos de crecimiento colapsados. Un oligómeros beta 1-42, que se muestra aquí antes de la incubación, se agrega después de siete días de incubación a 37 grados centígrados. Después del tratamiento con A beta 1-42 agregado, la inmunostaining con un anticuerpo para el oligómero tóxico de A beta muestra una tinción positiva en rojo en las neuronas tratadas con beta 1-42, pero no en las neuronas tratadas con vehículo.
Los primeros fenómenos inducidos por el tratamiento A beta 1-42 fueron analizados después de cuatro días en cultivo. Los axones identificados se confirmaron como tales mediante inmunosumanidad positiva para el marcador axonal tau-1 mostrado en inmunostaining rojo y negativo para el marcador dendrítico, MAP-2, mostrado en verde. Después de una hora de tratamiento del vehículo, los conos de crecimiento habían extendido lamellipodia y varias filopodias.
Estos fueron identificados como conos de crecimiento saludables. Por el contrario, una hora de tratamiento con beta 1-42 condujo a conos de crecimiento reducidos, que no desarrollaron lamellipodia ni filopodia. Estos fueron identificados como conos de crecimiento colapsados.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar fijar las celdas con 4%PFA y 4%sacarosa a 37 grados Celsius a mi-ni-idge este protocolo de fijación en el mejor. Siguiendo este protocolo, se pueden realizar otros métodos como la toma de imágenes de células vivas y la transfección genética para responder preguntas adicionales como cuándo y cómo se contraen los conos de crecimiento de axón y cómo se recuperan los conos de crecimiento colapsados.
