Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области исследований болезни Альцгеймера, особенно ранние события, связанные с крахом конуса роста. Основным преимуществом этого метода является возможность визуализации и анализа конусов аксонального роста сразу после бета-лечения амилоидом. Начните с использования микро-ножниц, чтобы фарш свежеиспеченные кортики головного мозга от эмбриональных мышей день-14 в среде культуры нейронов без антибиотиков.
Соберите ткани и центрифугу тканей при 87G в течение трех минут. После центрифугации удалите супернатант и добавьте в гранулы два миллилитра по 0,05%трипсина. Инкубировать в течение 15 минут при 37 градусах по Цельсию и смешивать, нажав каждые пять минут.
Через 15 минут добавьте четыре миллилитров среднего А, чтобы нейтрализовать трипсин, и перемешайте, нажав. Затем центрифуга тканей в 178 раз G в течение трех минут. После удаления супернатанта добавьте раствор ингибитора ДНК и сои трипсина и инкубировать в течение 15 минут при 37 градусах по Цельсию с смешиванием каждые пять минут, как и раньше.
По протяжённое время добавьте четыре миллилитров среднего A.Mix и центрифуги, как раньше. После удаления супернатанта добавьте четыре миллилитров среднего А и тритуратайте ткани полированной пипеткой Pasteur до тех пор, пока не будет обнаружен мусор. Затем отфильтруй тритурированные ткани сеткой размером с 70 микрон.
После фильтрации подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и рассчитайте плотность клеток. Pipette 0.8 времен 10 к четвертым клеткам в средств a в каждый колодец скольжения культуры 8-хорошо. Затем инкубируют во влажной атмосфере 10%CO2 при 37 градусах Цельсия.
После четырех часов культивирования, изменить культуру среды до среднего B.Чистота нейронов с помощью этого метода составляет около 75%Начните этот анализ по крайней мере за неделю до, открыв свежий флакон коммерчески полученных полнометражных бета 42 и растворения содержимого в стерильной, дистиллированной воды в концентрации 0,5 миллимоляра. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение семи дней, чтобы вызвать агрегацию и токсичность. Подготовка aliquots агрегированных бета 1-42 и хранить при температуре минус 80 градусов по Цельсию до использования.
На четвертый день нейрональной культуры, лечить скважины с 100 микролитров 0,5 микромолара агрегированных бета 1-42 или транспортного средства решения в средней B в течение одного часа, как было продемонстрировано ранее. После того, как час прошел, удалить культуру среды и сразу же исправить нейронов с 4%paraformaldehyde содержащие 4%сахарозы в PBS в течение одного часа при 37 градусов по Цельсию на горячей пластине. Фиксация является наиболее важным, поскольку поддержание формы конусов роста имеет решающее значение для этого протокола.
После фиксации, мыть нейроны три раза с PBS. Затем после удаления камеры, смонтировать нейроны с aqueous монтажа среды. Высушите монтажную среду при четырех градусах по Цельсию в течение двух-четырех дней.
Захват всей площади каждой хорошо с 20X сухой объектив цели на перевернутый микроскоп. Захват и анализ всей области в каждой хорошо имеет важное значение для избежания субъективности. Классифицифиция самых длинных невритов каждого нейрона в стадии три или четыре, как аксоны.
Axonal конусы роста не хватает lamellipodia или обладающих менее трех филоподии считаются рухнул конусов роста. Бета 1-42 олигомеры, показанные здесь до инкубации, агрегируются после семи дней инкубации при 37 градусах по Цельсию. После лечения агрегированной бета 1-42, иммуностимулятор с антителом для токсичных олигомер бета показывает положительное окрашивание в красном на бета 1-42 обработанных нейронов, но не автомобиль лечение нейронов.
Ранние явления, вызванные бета-1-42 лечения были проанализированы после четырех дней в культуре. Выявленные аксоны были подтверждены как таковые положительным иммуностимулированием для аксонального маркера tau-1, показанного красным и отрицательным иммуностимулированием для дендритного маркера, MAP-2, показанного зеленым цветом. После одного часа лечения транспортного средства, рост конусов распространилась lamellipodia и несколько филоподии.
Они были определены как здоровые конусы роста. И наоборот, один час бета 1-42 лечения привело к сморщенный рост конусов, которые разработали не lamellipodia или филоподии. Они были определены как рухнувшие конусы роста.
При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы исправить клетки с 4%PFA и 4% сахарозы при 37 градусов по Цельсию, чтобы мой-nor-idge этот протокол фиксации в лучшем случае. Следуя этому протоколу, другой метод, такой как живая клеточная визуализация и трансфекция генов, может быть выполнен, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как, когда и как конусы роста аксона рухнули и как рухнувшие конусы роста восстанавливаются.
