שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מחקר מחלת האלצהיימר, במיוחד האירועים המוקדמים המעורבים בקריסת חרוט צמיחה. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא לאפשר לדמיין ולנתח קונוסים צמיחה אקסונאלי מיד לאחר טיפול עמילואיד בטא. התחל על ידי שימוש מיקרו מספריים כדי לטחון קליפת המוח מבודד טרי מן העובר יום-14 עכברים באמצעי תרבות נוירון ללא אנטיביוטיקה.
לאסוף את הרקמות צנטריפוגה את הרקמות ב 87G במשך שלוש דקות. לאחר צנטריפוגה, להסיר את supernatant ולהוסיף שני מיליליטר של 0.05% טריפסין לכדור. דגירה במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ומערבבים על ידי הקשה כל חמש דקות.
לאחר 15 דקות, מוסיפים ארבעה מיליליטר של בינוני A כדי לנטרל את טריפסין, ומערבבים על ידי הקשה. ואז צנטריפוגה הרקמות ב 178 פעמים G במשך שלוש דקות. לאחר הסרת supernatant, מוסיפים DNAse ו פתרון מעכבי טריפסין סויה דגירה במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם ערבוב כל חמש דקות כמו קודם.
כאשר זמן הדגירה חלף, להוסיף ארבעה מיליליטר של בינוני A.Mix ו צנטריפוגה כמו קודם. לאחר הסרת supernatant, להוסיף ארבעה מיליליטר של בינוני A ו triturate את הרקמות עם פיפטה פסטר מלוטש עד לא פסולת נצפתה. לאחר מכן, סנן את הרקמות המשולשות עם רשת בגודל נקבוביות של 70 מיקרון.
לאחר הסינון, לספור את התאים עם hemocytometer ולחשב את צפיפות התא. פיפטה 0.8 פעמים 10 לתאים הרביעיים במדיום A לתוך כל באר של שקופית תרבות שמונה בארות. ואז דגירה באווירה לחה של 10% CO2 ב 37 מעלות צלזיוס.
לאחר ארבע שעות של culturing, לשנות את התרבות בינונית עד בינונית B.טוהר הנוירונים בשיטה זו הוא כ 75% התחל את ההבטחה הזו לפחות שבוע מראש על ידי פתיחת בקבוקון טרי של בטא 42 באורך מסחרי המתקבל במלואו והמסת התוכן במים סטריליים מזוקקים לריכוז של 0.5 מילימולר. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שבעה ימים כדי לגרום לצבירה ורעילות. מכינים aliquots של בטא מצטבר 1-42 ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס עד השימוש.
ביום הרביעי של התרבות העצבית, לטפל בארות עם 100 microliters של 0.5 micromolar צבר בטא 1-42 או פתרון הרכב בינוני B במשך שעה אחת כפי שהוכח קודם לכן. לאחר שחלפה השעה, הסר את מדיום התרבות ומיד לתקן את הנוירונים עם 4% paraformaldehyde המכיל 4% סוכרוז ב PBS במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס על צלחת חמה. קיבעון הוא החשוב ביותר כמו שמירה על הצורה של קונוסים צמיחה הוא קריטי עבור פרוטוקול זה.
לאחר קיבעון, לשטוף את הנוירונים שלוש פעמים עם PBS. לאחר הסרת התא, הר את הנוירונים עם מדיום הרכבה מים. יבש את מדיום ההרכבה בארבע מעלות צלזיוס במשך יומיים עד ארבעה ימים.
לכוד את כל האזור של כל באר עם עדשת מטרה יבשה פי 20 במיקרוסקופ הפוך. לכידת האזור כולו וניתוחו בכל באר חשובים למניעת סובייקטיביות. סיווגו את הנוריטים הארוכים ביותר של כל נוירון בשלב 3 או 4 כאקסונים.
קונוסים צמיחה אקסונאלי חסר lamellipodia או בעל פחות משלושה פילופודיה נחשבים קונוסים צמיחה התמוטט. בטא 1-42 אוליגומרים, המוצגים כאן לפני הדגירה, מצטברים לאחר שבעה ימים של דגירה ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר טיפול עם אגרה מצטברת בטא 1-42, immunostaining עם נוגדן לאוליגומר הרעיל של בטא מראה כתמים חיוביים באדום על בטא 1-42 נוירונים מטופלים, אבל לא נוירונים שטופלו ברכב.
התופעות המוקדמות הנגרמות על ידי טיפול בטא 1-42 נותחו לאחר ארבעה ימים בתרבות. אקסונים מזוהים אושרו ככזה על ידי כשל חיסוני חיובי עבור סמן האקסונאלי טאו-1 המוצג בכשל חיסוני אדום ושלילי עבור הסמן הדני, MAP-2, המוצג בירוק. לאחר שעה אחת של טיפול ברכב, קונוסים צמיחה התפשטו lamellipodia וכמה פילופודיה.
אלה זוהו כמו קונוסים צמיחה בריאה. לעומת זאת, שעה אחת של טיפול בטא 1-42 הובילה קונוסים גדילה מכווצים, אשר פיתחה לא lamellipodia או פילופודיה. אלה זוהו כקוני צמיחה שקרסו.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לתקן את התאים עם 4%PFA ו 4%sucrose ב 37 מעלות צלזיוס כדי שלי-ולא-idge פרוטוקול קיבוע זה בצורה הטובה ביותר. בעקבות פרוטוקול זה, ניתן לבצע שיטה אחרת כמו הדמיה של תאים חיים והתמרה של גנים כדי לענות על שאלות נוספות כמו מתי וכיצד קונוסים צמיחת האקסון קורסים וכיצד קונוסים צמיחה התמוטטו הם התאוששו.
