Name: methods for the discovery of novel compounds modulating a gamma-aminobutyric acid receptor type a neurotransmission
Uploaded: 2018-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission at JoVE.com

Yazarlar Judith Lengyel, Maria Karg, Grégoire Friz, Rachel Haab ve Marie Claire Pflimlin Roche üzerinden ve Tifany Schaer ve Deborah Paolucci HiQScreen dan onların mükemmel teknik destek için teşekkür ederiz.

Xenopus laevis yer alan ve Cenevre Kanton hayvan kurallarına göre ele.
1. Radioligand bağlama
<ol><li>
Tahlil plaka hazırlanması
	<ol>
<li>1, 5 L 5 mM KCl, 1,25 mM CaCl2, 1,25 mM MgCl2, 120 mM NaCl ve 15 mM Tris ile tahlil tamponunun hazırlamak; HCl ile pH 7.4 için ayarlayın.</li>
		<li>50.76 µM (Örneğin, 5 µL bileşik 980 µL tahlil arabellekte bir microcentrifuge tüp içine 10 mm), test edilecek bileşikler hazırlayın. Mix onları iyi bir girdap makine 2 – 5 s için yüksek hızda kullanarak.</li>
		<li>Başvuru bileşik flumazenil öncesi bir seyreltme bileşik (10 mM) pipetting 1 µL tarafından tahlil arabellek 1.970 µL için hazır olun. Mix onları iyi bir girdap makine 2 – 5 s için yüksek hızda kullanarak.</li>
		<li>[3H] flumazenil hisse senedi çözüm 4 4 ° C'de tahlil arabelleği ile seyreltik nM 50 mL polipropilen tüp içinde.</li>
		<li>Pipet 50 µL/iyi tahlil arabelleği sütun 1 ve 3 – 11 / 96-şey Mikroplaka Şekil 2' de gösterilen plaka düzeninde gösterildiği gibi içine.</li>
		<li>50.76 µM seyreltilmiş bileşiklerin 73.2 µL pipet (bkz. Adım 1.1.2) plaka 12 sütuna.</li>
		<li>Geometrik bir ilerleme üzerinde 9 adımları kullanarak her bileşim, seyreltik (1E-10 -1E-06 M), bir 23.12 µL transfer hacmi ve dolgu sütun 3 – 11. Seyreltme iyice karıştırın. İpucu her seyreltme sonra değiştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hücre zarları sulandırmak
	<ol>
<li>Daha önce bir HEK293 overexpressing insan GABAA reseptör izole hücre zarlarında çözülme (0,025-0,15 mg/mL), oda sıcaklığında (RT) 80 mL elde edilir ve süspansiyon tahlil arabellek 4 ° C'de transfer</li>
		<li>Membran çözüm hala 4 ° C'de 30-40 s 10.000-12.000 rpm'de için bir doku homogenizer ile resuspend.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Diazepam non-spesifik bağlantısını (NSB) denetimi için sulandırmak
	<ol>
<li>4 mM diazepam hisse senedi çözüm ile 5 ml 40 µM bir konsantrasyon için tahlil arabelleği sulandırmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reaksiyonu başlatmak
	<ol>
<li>4 nM [3H] flumazenil 50 µL 96-şey plaka her kuyuya pipet ve bir buzlu su kabında tutun.</li>
		<li>GABAA reseptör alt türü membranlar hazırlık 0,5 mg/mL bir protein konsantrasyonu için 100 µL ekleyin.</li>
		<li>50 µL 40 µM diazepam 2 sütuna pipet.</li>
		<li>Buz üzerinde 1 h plaka kuluçkaya.</li>
		<li>Her şey bir 96-iyi filtre plaka sonraki membran ayırma ve radyoaktivite ölçümü için tahlil arabelleği 50 µL ekleyin ve reaksiyon sonra durdurmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tepki bırak
	<ol>
<li>50 mM Tris-HCl, pH 7.4 ile çamaşır tampon hazırlayın.</li>
		<li>96-şey hücre hasat kullanarak çözüm filtre. 3 tabak yıkama x 300 µL buz gibi çamaşır arabelleği iyi ücret ile.</li>
		<li>Alt kısmında bir plastik film ile plaka mühür ve mercek sıvı için kokteyl 40 µL eklemek her sayma mercek iyi ve % 70 etanol ile silin.</li>
		<li>En az 1 h plaka RT. yavaşça salla RT, en az bir saat için stand izin</li>
		<li>(BGBM) radyoaktivite plaka bir mercek tezgahın üzerine yerleştirerek ölçmek. Bir şey başına 3 min için ölçme izin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Veri Analizi
	<ol>
<li>Non-spesifik bağlama (NSB) ve toplam bağlama (TB) de çoğaltır veya örneklerin triplicates gelince 8 için Ortalama çoğaltır belirlemek. % Özel bağlayıcı (SB) aşağıdaki denklemi göre her örnek ortalamasını hesaplamak: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq1.jpg"> Burada, Toplam SB NSB demekeksi demek TB =.</li>
		<li>Apsis % SB karşı koordine içinde içinde inhibitör konsantrasyonlarının arsa. Tek site Yarışması analiz denklemi kullanarak verileri sığdırmak: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq2.jpg"> Burada, y = SB, % A = y, minimum B y, maksimum = C = IC50, X = rakip bileşim, konsantrasyon günlük10 D eğri (Hill katsayısı) eğimi =.</li>
		<li>Yarım maksimal inhibitör konsantrasyon (IC50), kullanarak bağlama benzeşim (Ki) hesaplamak ilgili membranlar9ve konsantrasyon [3H] [3H] flumazenil ayrışma sabiti (Kd) Flumazenil tahlil göre aşağıdaki verileri kullanarak denklemi: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq3.jpg">
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. reseptör ifade ve kayıtları Xenopus yumurta içinde
<ol><li>Hasat yumurtalık ve oosit hazırlanması
	<ol>
<li>88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,82 mM MgSO4.7H2O, 0,33 mM Ca (NO3)2.4H2O ve 0,41 mM CaCl2.6H2O, pH 7.4 ile steril Barth çözüm hazırlamak , 100 birim/mL ile penisilin, 100 µg/mL streptomisin ve 0,25 µg/mL amfoterisin b desteklenmiş</li>
		<li>1 x OR2 orta boy (hiçbir CaCl2) hazırlamak 88,5 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 5 mM HEPES, 1 mM MgCl2.6H2O, pH 7.4 ile.</li>
		<li>Kurban bir Xenopus Laevis soğutmalı (150 mg/L, pH 7.4 ayarlanmış bir konsantrasyon), Tricaine methanesulfonate ve sodyum bikarbonat (300 mg/L) 20 dk için derin anestezi tarafından kadın işten çıkarma tarafından takip.</li>
		<li>Yumurtalıklar temiz makas ve forseps ile hızla hasat ve 40 mL 1 x Barth çözüm ve antibiyotikler/antimycotic ile dolu 2 Petri yemekler (10 cm) koyun.</li>
		<li>2 hafta 4 ° C'de Barth çözümde Disosiye olmayan yumurtalık saklamak</li>
		<li>Ayrılma için temiz bir tıraş bıçağı ile Yumurtalık küçük kesirler (1-2 cm3) kesme ve onları CaCl2 (OR2-noCaCl2) olmadan OR2 orta 50 ml % 0,2 collagenase içeren kuluçkaya (tip ı) 100 mL spinner 17-19 ° c şişesi 4 – 5 h. manyetik Bar doğrula için yavaş bir ajitasyon ile yaklaşık 3-5 cm yukarısında yumurta kırma önlemek için spinner balonun altındaki yer.</li>
		<li>4 – 5 h sonra yumurtalar çoğunu kendi folikül serbest doğrulayın (yani, onlar yüzmek çevresinde tek tek). Onları yıkamak 5 x 1.8 mM CaCl2ile desteklenmiş OR2 200 mL ile.</li>
		<li>Yumurta Petri-yemekleri (10 cm) Barth çözüm ve antibiyotikler/antimycotics dolu ve en az bir gecede 17 ° c cDNA veya mRNA enjeksiyon önce tutmak defolliculated aktarın.</li>
		<li>Ertesi gün, bir dürbün, bir açık ve farklı hayvan karşı bitkisel pole (hayvan pole karşı açık sarı için bitkisel pole için koyu kahverengi) sunan bir sağlıklı yumurta altında seçin. Temiz Pasteur pipetler kullanın ve yumurtalar teker teker steril konik 96-enjeksiyon iyi tabak atın. Not: Özel bir bakıma mRNA enjeksiyonlar için yumurta yerleşimini gereklidir; Oysa cDNA enjeksiyonlar için yumurta ile hayvan yukarı bakacak şekilde Kutbu yönlendirmek için vazgeçilmezdir.</li>
	</ol></li>
	<li>mRNA veya cDNA otomatik enjeksiyon
	<ol>
<li>Önerilen yönergeleri izleyerek bir ticari olarak mevcut kit kullanarak mRNA'ların sentez. Aletleri ve tablo RNase ile temiz ve uygun koruyucu eldiven giymek. Not: İyi bir ifade vermeye belirleyici kalitesidir mRNA ve enjeksiyon işlemi sırasında mRNA yıkımı önlemek için vazgeçilmezdir.</li>
		<li>Piyasada bulunan bir seti kullanarak cDNAs hazırlamak ve istediğiniz miktarı 0,2 µg/µL bir konsantrasyon, bidistilled suda çözülür.</li>
		<li>10-50 nL 0.2 µg/µL veya 10 nL cDNA çözüm 0,02 – 0,2 değişen bir konsantrasyon, konsantrasyon, mRNA çözümün enjekte µg/µL, tercihen 95 yumurta gruplar halinde.</li>
		<li>Membran için gerektiren birden çok alt birimleri (yani, heteromeric α1β2γ2 GABAA reseptörleri), protein karışımı karşılık gelen mRNA'ların veya istenen oranında cDNAs (yani, 1:1:1 veya 1:10:1).</li>
		<li>Oosit 17 ° c Isı şok proteinleri ifade tarafından yumurta önlemek için tutmak; Mikroplaka ısı kontrollü depolama alanında depolar.</li>
		<li>0.1-1000 adlı OR2 bağlama tahlil pozitif test edildi test bileşikleri dağıtılması µM elektrofizyolojik kayıtlar için ve onları bir 96-şey düz dipli Polipropilen tabak içinde atmayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Plazmid ifade için
	<ol>
<li>Kılavuzlarına bakteriyel T7 veya T6 promotors ile mRNA sentezi için piyasada kitleri izleyin ve bir çözüm 20 µL 0,2 µg/RNase free suda µL olun.</li>
		<li>En az 20 µL cDNA ifade 0.2 µg/µL bidistilled suda, genellikle ökaryot ifade vektör içeren bir çözüm hazırlamak.</li>
	</ol></li>
	<li>Mikroenjeksiyon oosit ve görsel kalite olarak
	<ol>
<li>10-50 nL plazmid içeren çözüm enjekte (bkz. Adım 2.3.1 veya 2.3.2) cam mikro-enjeksiyon iğne 100 µm arasında değişen bir uç çapı ile oluşturulmuş bir basınç Fırlatma sistemi ya bir otomatik enjeksiyon sistemi ile donatılmış bir micromanipulator üzerinde. Not: burada açıklanan örnekte, toplu halde 95 cDNA veya mRNA ile kullanıma uygun otomatik bir sistem ile yumurtalar enjekte edilir.</li>
		<li>Enjeksiyon iğne 1 µL % 1 metilen mavisi gibi bir boya ile doldurun ve standart prosedür (cDNA için çekirdek veya mRNA için sitoplazmada) kullanarak yumurta enjekte.</li>
		<li>Yaklaşık 1 dakika kaynar suda için enjekte yumurta atın. Yumurtalar bir dürbün altında bir tıraş bıçağı ile ikiye böldüm. Not: Boya Şekil 3'Eenjeksiyon hassas bir gözlem izin, gösterildiği gibi lokalize kalır.</li>
	</ol></li>
	<li>İki elektrot gerilimi kelepçe kayıtları
	<ol>
<li>Şekil 4' te gösterilen prensibi kullanır otomatik sistem üzerinde yumurta içeren iyi tabak koyun. Not: Şekil 5' te gösterilen yama kelepçe sistemi aksine, hücre gerçek membran potansiyelini gerilim elektrot tarafından okunur.</li>
		<li>Örneğin, Şekil 6 ' da konsantrasyon etkinlik ilişkisi tayini için resimli düzenine sahip simge tabanlı arabirimi kullanılarak otomatik kayıt sistemi programınız.</li>
	</ol></li>
	<li>Eğri uydurma
	<ol>
<li>Resimli konsantrasyon harekete geçirmek eğrisi kullanarak uygun yazılımı kullanarak sonuçları analiz, geçerli genlik agonist konsantrasyon logaritması bir fonksiyonu olarak arsa.</li>
		<li>Daha sonra formu ampirik Hill denklemde ile donatılmış olabilir sigmoidal eğri uyun: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq4.jpg"> Burada, Yuyarılmış akım, kısmını = EC %50 50 harekete geçirmek için konsantrasyon = x = bileşik toplama nH = Hill katsayısı veya belirgin cooperativity.</li>
		<li>Bir birlik akımları hücreler bir dizi elde edilen verileri çözümlemek için en yüksek konsantrasyonu, değeri kaydedilen her yanıt karşı genliği bölerek normalize.</li>
		<li>Ortalama ve standart hataları belirlemek ve size mevcut yazılım kullanarak eğri uydurma farkındayız.</li>
	</ol></li>
</ol>3. elektrofizyolojik kayıtlar Beyin dilimleri
Not: Hipokampal sıçan dilimleri ulusal ve kurumsal kılavuzlarınıza uygun olarak hazırlanır.
<ol><li>
Hippocampus dilimleri hazırlanması
	<ol>
<li>Diseksiyon yapay beyin-omurilik sıvısı (dACSF) 124 mM NaCl 124, 2.5 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H2O, 2.5 mM CaCl2 2 H2O, 26 mM NaHCO3, 10 mM glikoz ve 4 mM ile hazırlamak % 95'i O2 ve %5 CO2karışımı ile şişe benzin saccharose.</li>
		<li>Kayıt yapay beyin-omurilik sıvısı (rACSF) 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H2O, 2.5 mM CaCl2 2 H2O, 25 mM NaHCO3ve 10 mM glikoz ile hazırlamak % 95'i O2 ve %5 CO2karışımı ile şişe zehirledi.</li>
		<li>% 2.5 isoflurane ve saf oksijen karışımı kullanarak fareler anestezi ve onları başını kesmek.</li>
		<li>Orta hat makas güzel bir ikili ile takip kafa derisi kesilmiş. Kafatasının orta çizgi boyunca temel doku zarar vermeden kes. Cımbızla kafatasını ve beyin kepçe için iyi bir spatula kullanın.</li>
		<li>Gazla dACSF çözüm RT, beyin koyun ve sol hipokampal oluşumu iyi bir spatula ile incelemek.</li>
		<li>Enine dilimler (400 µm kalınlığında) hipokampüs orta kısmından bir doku helikopter ile kesin ve kayıt odasına bir boyama fırça kullanımı ile aktarabilirsiniz. RT, dilimler için 45 dk korumak.</li>
		<li>Dilimleri ile 35 ° c gassed rACSF sıvı ve 1,5 mL/dk. hızında % 95'i O2 ve %5 CO2karışımı ile çözüm kabarcık. Not: Bu adımdan sonra dilimler elektrofizyolojik deneyler için hazır olur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tek nüfus spike kayıt
	<ol>
<li>Bir beyin dilim mikroskop monte edilmiş odanın içine yerleştirin.</li>
		<li>3 mL/dk ile rACSF oranında dilim sıvı.</li>
		<li>Borosilikat cam micropipette direnci ~ 2 MΩ sahip pipet çektirme ile çek. Not: Bu micropipette kayıt elektrot kullanılır ve elektrikle amplifikatör için bağlı.</li>
		<li>Micropipette 2 M NaCl içeren bir çözüm ile doldurun ve amplifikatör pipet yuvasına yerleştirin.</li>
		<li>Kayıt micropipette doğru micromanipulator kullanarak hipokampal dilimin CA1 bölgesindeki stratum pyramidale yerleştirin. Not: Konum şematik Şekil 7' de temsil edilir.</li>
		<li>Bir yalıtılmış bipolar platin/iridyum Elektrot tutucu sol micromanipulator üzerine yerleştirin. Not: Bu elektrot uyarılması elektrot kullanılır ve uyarıcı jeneratörü elektrikle bağlı.</li>
		<li>Stimülasyon elektrot Schaffer de¤erler doğru micromanipulator kullanarak hipokampal dilimin CA1 bölgesindeki yerleştirin. Not: Konum şematik Şekil 7' de temsil edilir.</li>
		<li>Geçerli nabzı uyarıcı Oluşturucu'yu kullanmamanızı stimülasyon elektrot her 30 teslim s (100 µs süreleri 10 µA başlayarak) ve bir nüfus artışı (PS) görünene kadar yavaş yavaş stimülasyon gücünü artırmak.</li>
		<li>Elde edilebilir en yüksek genlik % 45'i için karşılık gelen bir PS uyandırmak için uyarıcı güç ayarlayın. PSs 2.4 KHz filtre ve 20 KHz sinyal amplifikatör kullanarak sayısallaştırılmış.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Çifte darbe inhibisyon
	<ol>
<li>Beyin dilimleri (adım 3.1) hazırlamak ve daha önce açıklandığı gibi devam edin (adımları 3.2.1–3.2.7).</li>
		<li>İki geçerli bakliyat (100 µs süreleri 20 ms aralığında) stimülasyon elektrot için her 30 teslim uyarıcı Oluşturucu'yu kullanmamanızı s. Maksimum genlik % 45'i için karşılık gelen bir PS uyandırmak için uyarıcı güç ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Test bileşik
	<ol>
<li>Dilutions benzin ACSF test edilecek bileşiklerin yapmak böylece DMSO değil 0,1 daha yüksek son konsantrasyonu.</li>
		<li>DMSO bileşik çözüm daha aynı konsantrasyonu, kontrol çözümü ekleyin.</li>
		<li>(Adım 3.2) tek bir kayıt veya eşleştirilmiş-darbe (adım 3.3) PS Schaffer teminat elektrodlar tarafından uyarılmış her 30 s en az 30 dk için. PS şekli bu temel dönemde kararlı olmalıdır.</li>
		<li>Bir ölçek ile benzin rACSF test edilmesi için bahçedeki sabit bir konsantrasyon içeren hazır olun.</li>
		<li>Bu çözümle hipokampal dilim hala tek veya eşleştirilmiş-nabız PS kaydederken sıvı</li>
		<li>Bileşik etkisi kurtarma gazla rACSF bileşik olmadan dilimle ventriküler tarafından değerlendirmek. Not: geri dönüşümlü etkileri için PS bileşik uygulamadan temel dönemde gözlenen ilk şekli döner.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Veri Analizi
	<ol>
<li>Ortalama PS izlemeler sırasında 4 veri analiz yazılımı kullanarak bloklarını deneyde kaydetti.</li>
		<li>Ortalama izlemeler PS genlikleri ölçmek.</li>
		<li>10 dk bir bileşik ventriküler daha önce kaydedilen temel değerler yüzdesi olarak genlikleri normalleştirmek.</li>
		<li>± Sem demek gibi verileri hızlı</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rudolph, U., Knoflach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+classical+benzodiazepines:+novel+therapeutic+potential+of+GABAA+receptor+subtypes.">Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10, 685-697 (2011).</li><li>Sieghart, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+pharmacology+of+g-aminobutyric+acidA+receptor+subtypes.">Structure and pharmacology of g-aminobutyric acidA receptor subtypes.</a> Pharmacological Reviews. 47, 181-234 (1995).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+functional+assay+for+characterization+of+g-aminobutyric+acidA+channel+modulators+using+cryopreserved+transiently+transfected+cells.">A high-throughput functional assay for characterization of g-aminobutyric acidA channel modulators using cryopreserved transiently transfected cells.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 781-786 (2008).</li><li>Mennerick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+voltage-sensitive+dyes+modulate+GABAA+receptor+function.">Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function.</a> Journal of Neuroscience. 30, 2871-2879 (2010).</li><li>Hevers, W., Luddens, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diversity+of+GABAA+receptors.+Pharmacological+and+electrophysiological+properties+of+GABAA+channel+subtypes.">The diversity of GABAA receptors. Pharmacological and electrophysiological properties of GABAA channel subtypes.</a> Molecular Neurobiology. 18, 35-86 (1998).</li><li>Macdonald, R. L., Olsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor+channels.">GABAA receptor channels.</a> Annual Review of Neuroscience. 17, 569-602 (1994).</li><li>Kemp, J. A., Marshall, G. R., Wong, E. H., Woodruff, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+affinities,+potencies+and+efficacies+of+some+benzodiazepine-receptor+agonists,+antagonists+and+inverse-agonists+at+rat+hippocampal+GABAA-receptors.">The affinities, potencies and efficacies of some benzodiazepine-receptor agonists, antagonists and inverse-agonists at rat hippocampal GABAA-receptors.</a> British Journal of Pharmacology. 91, 601-608 (1987).</li><li>Prenosil, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+subtypes+of+GABAA+receptors+mediate+phasic+and+tonic+forms+of+inhibition+in+hippocampal+pyramidal+neurons.">Specific subtypes of GABAA receptors mediate phasic and tonic forms of inhibition in hippocampal pyramidal neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96, 846-857 (2006).</li><li>Ballard, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RO4938581,+a+novel+cognitive+enhancer+acting+at+GABAA+a5+subunit-containing+receptors.">RO4938581, a novel cognitive enhancer acting at GABAA a5 subunit-containing receptors.</a> Psychopharmacology. 202, 207-223 (2009).</li><li>Knoflach, F., Hernandez, M. C., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor-mediated+neurotransmission:+Not+so+simple+after+all.">GABAA receptor-mediated neurotransmission: Not so simple after all.</a> Biochemical Pharmacology. 115, 10-17 (2016).</li><li>Gielen, M. C., Lumb, M. J., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzodiazepines+modulate+GABAA+receptors+by+regulating+the+preactivation+step+after+GABA+binding.">Benzodiazepines modulate GABAA receptors by regulating the preactivation step after GABA binding.</a> Journal of Neuroscience. 32, 5707-5715 (2012).</li><li>Bergmann, R., Kongsbak, K., Sorensen, P. L., Sander, T., Balle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unified+model+of+the+GABAA+receptor+comprising+agonist+and+benzodiazepine+binding+sites.">A unified model of the GABAA receptor comprising agonist and benzodiazepine binding sites.</a> PLoS One. 8, 52323 (2013).</li><li>Richter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diazepam-bound+GABAA+receptor+models+identify+new+benzodiazepine+binding-site+ligands.">Diazepam-bound GABAA receptor models identify new benzodiazepine binding-site ligands.</a> Nature Chemical Biology. 8, 455-464 (2012).</li><li>Rudolph, U., Crestani, F., Mohler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor+subtypes:+dissecting+their+pharmacological+functions.">GABAA receptor subtypes: dissecting their pharmacological functions.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 22, 188-194 (2001).</li><li>Wisden, W., Seeburg, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor+channels:+from+subunits+to+functional+entities.">GABAA receptor channels: from subunits to functional entities.</a> Current Opinion in Neurobiology. 2, 263-269 (1992).</li><li>Davies, C. H., Davies, S. N., Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired-pulse+depression+of+monosynaptic+GABA-mediated+inhibitory+postsynaptic+responses+in+rat+hippocampus.">Paired-pulse depression of monosynaptic GABA-mediated inhibitory postsynaptic responses in rat hippocampus.</a> The Journal of Physiology. 424, 513-531 (1990).</li><li>Karnup, S., Stelzer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+overlap+of+excitatory+and+inhibitory+afferent+input+in+guinea-pig+CA1+pyramidal+cells.">Temporal overlap of excitatory and inhibitory afferent input in guinea-pig CA1 pyramidal cells.</a> The Journal of Physiology. 516, 485-504 (1999).</li><li>Turner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feed-forward+inhibitory+potentials+and+excitatory+interactions+in+guinea-pig+hippocampal+pyramidal+cells.">Feed-forward inhibitory potentials and excitatory interactions in guinea-pig hippocampal pyramidal cells.</a> The Journal of Physiology. 422, 333-350 (1990).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pfl&#252;gers Archiv. 391, 85-100 (1981).</li><li>Adelsberger, H., Brunswieck, S., Dudel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Block+by+picrotoxin+of+a+GABAergic+chloride+channel+expressed+on+crayfish+muscle+after+axotomy.">Block by picrotoxin of a GABAergic chloride channel expressed on crayfish muscle after axotomy.</a> European Journal of Neuroscience. 10, 179-187 (1998).</li><li>Hapfelmeier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+slows+inactivation+kinetics+of+rat+recombinant+a1b2g2L+GABAA+receptors:+enhancement+of+GABAergic+transmission+despite+an+open-channel+block.">Isoflurane slows inactivation kinetics of rat recombinant a1b2g2L GABAA receptors: enhancement of GABAergic transmission despite an open-channel block.</a> Neuroscience Letters. 307, 97-100 (2001).</li><li>Bertrand, S., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+electrophysiological+characterization+of+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Overview of electrophysiological characterization of neuronal nicotinic acetylcholine receptors.</a> Current Protocols in Pharmacology. , 17 (2004).</li></ol>

Yazarlar Frédéric Knoflach ve Maria-Clemencia Hernandez, F. Hoffmann-La Roche AG, 4070 Basel, İsviçre, bir ilaç şirketi çalışanlardır. Yazar Daniel Bertrand HiQScreen Sàrl 6, rte bir çalışandır de ilaç firmaları için tarama imkanları sağlayan Compois, 1222 Vésenaz Cenevre, İsviçre,.

Geliştirme roman bileşiklerin etkin bir ligand kapılı iyon kanalA GABA reseptörleri gibi birden fazla yaklaşımları kullanımını gerektirir. Genellikle, ilk adım genellikle bağlama deneyleri kullanarak yapılır; Ancak, bu tür ölçümleri bileşik veya onun hassas Farmakoloji fizyolojik etkinlik derecesinin yetersizdir. Özellikle, bir takımı bağlar bir bileşik geliştirmek veya işlevi inhibe veya bile (sessiz olmak) fonksiyonel etkisi üretmek (yani, onun işlevini değiştirme olmadan reseptör bağlamak). Böylece, fonksiyonel test tam bileşik bir karakterizasyonu için gereklidir.
Deneyleri bağlama: Bağlama tahlil büyük avantajı bu verimli bir şekilde örnekleri birkaç bin kadar değişen sayıda yapılabilir olduğunu ve etkin moleküller için bağlama affinities sağlar olduğunu. Burada açıklandığı gibi ilk adım bir yöntem istenen reseptör alt türlerinden değerlendirmesi için oluşturma oluşur. Yani, bağlama kesirleri veya tüm beyin yerli reseptörleri üzerinde yapılan iken, böyle bir yöntem belirli reseptör alt türlerinden, benzeşim belirlenmesi engeller. Bu, bu nedenle, ekran moleküllere rekombinant sistemleri istenen hedef kullanmak gereklidir. Günümüzde, istenen reseptör alt birim cDNAs hücre hatlarında, geçici veya sabit transfection reseptör alt türleri (Örneğin, GABAA α5β3γ2) ilgi ifade etmek için verimli ve güvenilir bir yöntem sunuyor. Geleneksel bağlama deneyleri yapmak kullanmak teknikleridir radioligands, ama günümüzde mevcut radyoaktivite (Örneğin, kantitatif floresan tabanlı-ligand taşıması) işleme rahatsızlık kaçının.
Bir ana bilgisayar sistemi işlevsel ifadede: Bir ana bilgisayar sistemindeki genlerin ifade etmek için kodlama dizisi ilgi yeterli promotors içeren bir plazmid eklenmesi gerekir. Genellikle, vitro mRNA sentezi için bakteriyel T7 veya T6 promotors kullanılır. CMV (sitomegalovirüs) veya eşdeğeri gibi ökaryot promotor tarafından cDNA ifade için faiz Gen transkripsiyonu düzenlenmiş olması gerekir. Günümüzde, birkaç plazmid (yani, pUNIV, pCMV-6AC, psf-CMV/T7, PCI-neo, pcDNA), iki promotors de dahil olmak üzere, kullanılabilir bir vitro sentezi mRNA ya da Şekil 15' te gösterildiği gibi bir cDNA ifade izin vardır. Bir ifade GABAA reseptörlerinin sadakatle hücre hatları veya Xenopus yumurta elde edilebilir. İkinci en önemli avantajları bir endojen reseptör ifade, manipülasyonlar sadeliği ve mikro-enjeksiyon ve kayıtları için otomatik bir sistem kullanılabilirliğini eksikliği vardır. Bu protokol için açıklanan yordamları yaklaşık 7 dakika içinde 96 yumurta enjeksiyon sağlar ve hiçbir embriyolardan beceri gerektirir otomatik sistem etkinliğini göstermektedir. Xenopus tek yumurtalıktan 10.000 – 30.000 yumurtalar arasında içerir hatırlayarak, bu hücre ölçümleri, çok sayıda tek bir hazırlık yapılabilir açıktır. Bir ifade kullanarak cDNA enjeksiyonları yapılabilir gibi Ayrıca, bağlama deneyler için geliştirilen genleri ilgi içeren aynı plazmid ezelî belgili tanımlık lüzum daha da moleküler biyoloji işlevsel bir karakterizasyonu için kullanılabilir manipülasyonlar.
Onun büyüklüğü ve yüksek yüzey anlatım göz önüne alındığında, bir tek yumurta yaklaşık 35 mm Petri kabına konfluent hücrelere eşdeğerdir reseptörleri sayısını verir. Ancak, bir yumurta hazırlık ve enjeksiyon gösteren bir hücre kültürünü maliyetinin bir kısmını deneyler özel bir kültür ortam ve steril manipülasyonlar gerekmez. Bir kaç picoamperes (10-12) tek bir GABAA kanal aktivasyonu verimleri ve ilâ microampere (10-6) onlarca arasında değişen akımlar kolayca birkaç milyonlarca eşlik eden etkinliğini doğruladı bir tek yumurta içinde kaydedilir reseptörleri sırasında tek bir yanıt.
İlk adımda ligand kapılı iyon kanalları karakterizasyonu kez reseptörlerinin belirgin benzeşme belirlenmesidir. Tarihte gerek deneyler bir dizi kısa agonist testi uygulayarak ve genliği uyarılmış geçerli veya belirli durumlarda, agonist konsantrasyon logaritması bir fonksiyonu olarak (AUC) eğri altındaki alan komplo oluşur. Farklı plazmid konsantrasyonları ve yumurtalar aynı toplu oranı microinject kolayca mümkün olduğu gibi bu sistem ifade böyle bir karakterizasyonu için özellikle uygundur. Ayrıca, bir toplu iş toplu iş karşılaştırma istikrar için farklı EC50s yüksek derecede ortaya koydu. Alt birim kompozisyon reseptör'ın belirgin benzeşme hakkında etkisi kolayca Şekil 10örneği olarak bir örümcek arsa kullanarak görüntülenir.
Xenopus yumurta elde iki elektrot gerilimi kelepçe sonuçlarını sık sık düzeltme eki EKG mandalları kullanılarak yapılan kayıtları ile karşılaştırılır. Bu iki sistem arasında detaylı bir karşılaştırma gitmek bu işin kapsamı ötesinde gitti ise bir kaç puan incelenebilir. Hücrelerde bir yama kelepçe hızlı ilaç uygulaması ile biyofiziksel bir karakterizasyonu için avantajları sunarken, gereksinimleri daha bu iki elektrot kayıtları Xenopus yumurta daha karmaşıktır. Zorluk ilk ve önemsiz olmayan bir hücre kültürü, bir geçici veya sabit transfection gerekliliği ve istenen yapı ifade eden hücreler tanımlaması ile verilen bir protein ifadesidir. Buna ek olarak, kabul hücre endojen ifadede mümkün katkısını incelemek için vazgeçilmezdir. Ayrıca, bir yama kelepçe kayıt o kişi de, örneğin, mühür kalitesini değerlendirmek için deneme sırasında yeterli bir analiz yapmak gerekir iken yüksek büyütme mikroskop altında embriyolardan yapmak yetenekli bir kişi gerektirir, erişim direnç vb aksine, kayıt, özellikle bir elektrofizyolojik otomatik bir sistem kullanarak bir iki elektrot gerilimi kelepçe herhangi bir özel beceri gerektirmez ve Laboratuvar teknisyenleri tarafından yapılabilir.
Elektrofizyolojik bir set-up edinme zaman maliyet dikkate kesinlikle dikkatli bir şekilde çözümlenmesi gereken önemli bir faktördür. Otomatik bir sistem maliyeti nispeten yüksek olmakla birlikte, örneğin, daha yakın bir karşılaştırma yükleme tam elektrofizyolojik teçhizat gibi iyi micromanipulators, bir dürbün lens, bir amplifikatör, bir perfüzyon donanımları satın içerir ortaya çıkarır Sistem ve ayrıca veri alınıyor ve bir çözümlemesini süre bir anti-titreşim tablo. Bir iki elektrot gerilimi kelepçe koymak-yukarıya karşı bir yama kelepçe koymak-yukarıya arasında bir maliyet karşılaştırma daha da farklılıklar ortaya koymaktadır. Ayrıca, otomatik bir sistem tam otomatik ekipman avantajı sunuyor ve gece gündüz katılımsız çalışır.
Bir bileşik farmakolojik özelliklerini yazam├╜yor reseptör, eylem tarafından belirlenir. Örneğin, rekabetçi inhibitörleri aynı bağlama cebinizde veya orthosteric sitesi, girebilirsiniz molekülleri şunlardır agonist kendisi bir yarışma neden olur. Sigara rekabetçi inhibitörleri, girebilir ve iyonik gözenek örneğin engellemek, başka bir sitede ve bir ligand kapılı iyon kanalı durumunda etkileşerek reseptörleri inhibe bileşiklerdir. Etkileşim farklı mekanizmaları incelemek için bu işin kapsamı gitmek istiyorum, ama daha fazla bilgi farmakolojik bir ders kitabından ve/veya Bertrand ve Bertrand'ın22gibi diğer işten elde edilebilir.
Allosteric modülatörler söz konusu olduğunda, orthosteric sitesi, ama durum molekülün farklı bir sitede bileşik bağlar enerji bariyeri aktif ve diğer devletler arasında değiştirir. Pozitif allosteric modülatörler (PAMs) enerji bariyeri etkin duruma dinlenme--dan azaltmak bileşiklerdir ve bu nedenle, agonist etkisini artırmak. Olası PAM etkileri tanımlamak için bu, bu nedenle, Eğer bileşik bir maruz agonist yanıtı geliştirir ve eğer öyleyse, hangi konsantrasyon de belirlemek gereklidir. Şekil 11 ve Şekil 14 sunulan deneyler başarıyla GABAA reseptörleri, PAMs karakterizasyonu için kullanılabilir protokolleri göstermektedir.
Bazı durumlarda, tek başına PAM maruz reseptörleri etkinleştirmek yeterli olabilir. Bu tür etkinlikler burada sunulan Deneysel protokol hafif bir değişiklik tarafından belirlenebilir. Yani, modülatör ortak bir uygulama GABA maruz sırasında kullanmak yerine, protokol ilk uygulama için tek başına ve sonra huzurunda GABA bileşik değiştirilebilir. Doğrudan agonist etkinlik karakterizasyonu bileşik tarafından uyarılmış ve GABA uyarılmış geçerli karşılaştırıldığında yanıt genliği tespiti yapılacak.
Şekil 7' de gösterildiği gibi beyin dilimler halinde yapılan deneylerde daha fazla hayvan modellerinde ve klinik karşı yol boyunca gitmeden önce kesin bir inhibitör devre yerel reseptörleri, bileşik faaliyet onaylamak için kullanılır. Nispeten basit veri kayıt ve analiz Protokolü PS genlik fark düzenleyici etkileri değerlendirilerek birden çok bileşikleri sıralamasını sağlar. GABA sisteme ilgili olmayan bileşikler spesifik olmayan etkileri (PS şekil değişiklikleri gözlendiğinde algılananÖrneğin) de kullanabilirsiniz. Doğrudan, GABAergic neurotransmission bu gibi durumlarda bütün hücreli yama klemp tekniği8kullanarak inhibitör postsinaptik akımları (IPSCs) bileşiklerin etkisi ölçülerek tespit edilebilir.

Burada, aktif bileşikler keşfi için protokolleri GABAA reseptörleri Fizyoloji ve farmakoloji bağlama mevcut. Ara roman molekülleri GABAA reseptörleri için belirli, burası tanımlamak için çok önemli, kesin olarak mümkün, alt türü faiz ve özgüllük yeni tanımlanan bileşiklerin değerlendirilmesi (Örneğin, incelenmek üzere, Rudolph görmek ve Knoflach1veya Sieghart2). İlaç keşif ve ulaşılması gereken adımları tipik bir yoldaki Şekil 1' de gösterilmiştir.
Bağlama deneyleri olmuştur ve hala büyük ölçüde ilaç keşfi ilk aşama olarak kullanılır. GABAA reseptörleri söz konusu olduğunda, onlar nerede uyuşturucu tedavi amaçlı yararlı ve güvenli bağlamak benzodiazepin bağlama siteye reseptör bağlamak bileşenleri tanımlamak için optimize edilmiştir. Fluorometrik görüntüleme plaka okuyucu (FLIPR) membran potansiyeli kırmızı boya tabanlı deneyleri3, kullanarak diğer teknikleri, bileşiklerin onların istenmeyen yan etki profili nedeniyle daha az tercih başka sitelere bağlamak barbitüratlar gibi algılamak. Buna ek olarak, kullanılan boyar maddeler doğrudan GABAA reseptörleri, böylece bu deneyleri ilaç bulma4için yarar sorgulama etkinleştirebilirsiniz. Deneyleri bağlama yalnızca belirli bir bileşik belirli reseptör sınıfbağlayabilirsiniz kanıt sağlayabilir. İn vitro deneyleri ile hücre zarlarında seçici insan GABAA α5β3γ2 reseptör ligandlar tanımlamak için kullanılır. İnsan GABAA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 ve α3β3γ2 reseptörleri ifade geçici transfected HEK293 hücre zarlarında bu deneyleri için hazırlamak için kullanılır. Ligandlar etkisini membran reseptörleri ([3H] flumazenil bağlama bir inhibisyonu) bağlı [3H] flumazenil mercek ölçerek algılanır. Bu teknik büyük avantajı bileşik bağlama benzeşme reseptör ilgi, hızlı ve verimli belirlenmesi faiz reseptör sağlanan olduğunu.
Fonksiyonel çalışmalar bileşiklerin fonksiyonel etkinlik değerlendirmek ve fizyolojik ve farmakolojik bir açıklama reseptörleri bileşiklerin bağlama neden mekanizmaları teklif etmek gereklidir. Bugün, fonksiyonelA GABA reseptörleri pseudosymmetry iyonik gözenek ve derlemesinden sonucu beş özdeş alt birimleri tarafından kurulmuş bir eksen çevresinde beş alt birimleri Meclisi sonucu İyi tanınan biridir. GABAA reseptörleri çoğu iki veya daha fazla farklı alt birimleri oluşur. Büyük beyin GABAA reseptör, örneğin, bir stoichiometry 2, 2 ve 1 α1, B2 ve γ2 altbirimden sırasıyla oluşan5,6. Xenopus yumurta veya HEK293 hücreleri gibi bir ana bilgisayar sistemi rekonstitüsyon hızla reseptörlerinin farmakolojik özellikleri keşfetme imkanı sunuyor.
Bileşiklerin farmakolojik özellikleri sonra beyin dilimleri7ekstraselüler kayıtları ile incelenmiştir. Bu yöntem bileşikleri etkisi neurotransmission bir keşif ve kapaklı ifade sistemlerinde yerel reseptörleri genel düzeyde belirlenen bileşikler fonksiyonel etkileri onaylamak için etkili bir yol sağlar nöronal ortamı. GABAergic neurotransmission Ayrıca moleküler düzeyde inhibitör postsinaptik akımları (IPSCs)8bileşiklerin etkisi ölçülerek tespit edilebilir. Ama burada kullanılan ve bütün hücreli yama kelepçe kayıtları Beyin dilimleri içinde temel protokolü daha ayrıntılı ve daha düşük işlem hacmi verim.
Son olarak, güçlü ve zayıf yönlerini α5β3γ2 seçici ligandlar tanımlanması için kullanılan cascade eleme vitro farklı teknikleri ve içsel sınırlamaları perspektif içinde ele alınmıştır. Bu eser uzman ve farklı vitro yaklaşımlar ile birlikte yararlı bir daha gözden geçirme bu ligand kapılı iyon kanalları yeni modülatörler keşfi mücadele için kullanılanA GABA reseptörlerinin alanında uzman sağlamalıdır.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;General equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 well cell harvester -(Filtermate 196)&amp;nbsp;</td><td>Packard</td><td></td><td>To filter membranes with bound radioligand</td></tr><tr><td>Microtiter plate liquid scintillation counter (Top Count NXT)</td><td>Packard</td><td></td><td>Microplate Scintillation and Luminescence counter</td></tr><tr><td>Vial liquid scintillation counter (Beta-Couter 2500 TR)</td><td>Packard</td><td></td><td>Vial Scintillation and Luminescence counter</td></tr><tr><td>Liquid&amp;nbsp; handler (Biomek 2000)</td><td>Beckman coulter</td><td></td><td>To prepare compound dilutions</td></tr><tr><td>Vortex (Vortex Genie 2)</td><td>Scientific industries Inc.</td><td></td><td>To mix compound stock solutions</td></tr><tr><td>Tissue homogenizer (Polytron PT1200E)</td><td>Kinematica AG</td><td></td><td>To resuspend the membrane preparations</td></tr><tr><td>XLfit5 software</td><td>Microsoft Excel&lt;br/&gt; &amp;nbsp;add-on by IDBS</td><td></td><td>Curve fitting software</td></tr><tr><td>Smart Pull</td><td>UniPix</td><td>-</td><td>Electrode Puller</td></tr><tr><td>RoboInject</td><td>MultiChannel Systems</td><td>-</td><td>Automated Injection (Xenopus Oocytes)</td></tr><tr><td>HiClamp</td><td>MultiChannel Systems</td><td>-</td><td>Automated Voltage Clamp (&lt;em&gt;Xenopus&lt;/em&gt; Ooocytes)</td></tr><tr><td>DataMining</td><td>MultiChannel Systems</td><td>-</td><td>Data Analysis Software</td></tr><tr><td>DataMerger</td><td>MultiChannel Systems</td><td>-</td><td>Data Processing Software</td></tr><tr><td>Digidata 1550</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Low noise data acquisition system</td></tr><tr><td>CyberAmp 380 or equivalent</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>Programmable Signal Conditioner</td></tr><tr><td>pClamp program suite</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Software for data acquisition and analysis software</td></tr><tr><td>Antivibraton table&amp;nbsp;</td><td>TMC</td><td></td><td>To avoid microelectrode vibrations&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Patchstar Micromanipulators</td><td>Scientifica</td><td></td><td>To accurately position microelectrodes in brain slices</td></tr><tr><td>Faraday Cage&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>To isolate recordings from noise</td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>Campden Instruments LTD&amp;nbsp;</td><td></td><td>To prepare brain slices</td></tr><tr><td>Borosilicate glass micropipette&amp;nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>GC150TF-10</td><td>To record extracellular potentials in brain slices</td></tr><tr><td>Twisted pair, platinum iridium wires stimulation electrode</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>To stimulate the brain slices with current</td></tr><tr><td>Stimulus generator for current and voltage driven stimulation</td><td>MultiChannel Systems</td><td>STG4000</td><td>Delivers the current to the stimulation electrode</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Plasticware&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtiter plate round bottom</td><td>Corning</td><td>#3365</td><td>Used for the binding assay</td></tr><tr><td>GF/C glassfibre filter-bottom 96-well microplate with 1.2 &amp;micro;m poresize, for cell harvesting assays using a vacuum manifoldwell filter&amp;nbsp;</td><td>Packard&amp;nbsp;</td><td>#6005174</td><td>used for the binding assay</td></tr><tr><td>50 mL Tubes</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>#352070</td><td>used for the binding assay</td></tr><tr><td>Safe-lock tubes 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>#0030 120086</td><td>used for the binding assay</td></tr><tr><td>Safe-lock tubes 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>#0030 120094</td><td>used for the binding assay</td></tr><tr><td>Shipping tubes 180 mL&amp;nbsp;</td><td>Semadeni Europe AG&amp;nbsp;</td><td>#3722</td><td>used for the binding assay</td></tr><tr><td>Pony vial Polyethylene 6 mL&amp;nbsp;</td><td>Perkin Elmer&amp;nbsp;</td><td>#6013329</td><td>used for the binding assay</td></tr><tr><td>Top Seal&amp;nbsp;</td><td>Perkin Elmer&amp;nbsp;</td><td>#60051859</td><td>used for the binding assay</td></tr><tr><td>Spinner Flask</td><td>Bellco</td><td>BELLCO # 1965-00100</td><td>Spinner Flask</td></tr><tr><td>96&amp;nbsp; Well Plate (Conical)</td><td>Thermo Scientific Milian</td><td>56368</td><td>Injection plate for the oocytes</td></tr><tr><td>96&amp;nbsp; Well Plate (Flat bottom)</td><td>Corning (Vitaris Switzerland)</td><td>3364-cor</td><td>Compound Plate for the HiClamp</td></tr><tr><td>Glass capillary&amp;nbsp;</td><td>Hilgenberg (Germany)</td><td>-</td><td>borosilicate glass 1.2 O.D. 0.76 I.D. with filament</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;RNA preparation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ambion mMessage mMachine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>for the &lt;em&gt;in vitro&lt;/em&gt; synthesis</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Assay buffer: KCl 5 mM; CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 1.25 mM; MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 1.25 mM; NaCl 120 mM; Tris 15 mM pH adjust with HCl to 7.4; store up to 3 months at 4 &amp;deg;C.</td><td></td><td></td><td>Used for binding assay</td></tr><tr><td>Washing buffer: Tris 50 mM -HCl pH 7.4; store at 4 &amp;deg;C.</td><td></td><td></td><td>Used for binding assay</td></tr><tr><td>Stock solution of test compounds 10 mM in DMSO</td><td></td><td></td><td>Used for binding assay</td></tr><tr><td>Flumazenil (RO0151788) 10 mM in DMSO</td><td></td><td></td><td>Used for binding assay</td></tr><tr><td>Diazepam 4 mM in DMSO</td><td></td><td></td><td>Used for binding assay</td></tr><tr><td>[&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H]-Flumazenil 60-85 Ci/mmol in Ethanol; store at -20 &amp;deg;C</td><td></td><td></td><td>Used for binding assay</td></tr><tr><td>Microscint 40&amp;nbsp;</td><td>Packard&amp;nbsp;</td><td>#6013641</td><td>Used for binding assay</td></tr><tr><td>Ultima Gold&amp;nbsp;</td><td>Perkin Elmer&amp;nbsp;</td><td>#6013329</td><td>Used for binding assay</td></tr><tr><td>MS-222</td><td>Sigma</td><td>Sigma # A5040</td><td>MS-222</td></tr><tr><td>AB/AM</td><td>Sigma</td><td>Sigma # A5955</td><td>antibiotics / antimycotics</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Sigma</td><td>Sigma # C1030</td><td>Collagenase Type I</td></tr><tr><td>Rnase</td><td>Sigma</td><td>Sigma # R2020-250 mL</td><td>RNaseZAP</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>Qiagen # 12362</td><td></td></tr><tr><td>Salts for artificial cerebrospinal fluid (NaCl, KCl, etc.)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Membranes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frozen membrane preparations from transient or stably transfected HEK293 overexpressing different human GABA&lt;sub&gt;A&lt;/sub&gt; receptor subtypes: &amp;alpha;1&amp;beta;3&amp;gamma;2, &amp;alpha;2&amp;beta;3&amp;gamma;2, &amp;alpha;3&amp;beta;3&amp;gamma;2, &amp;alpha;5&amp;beta;3&amp;gamma;2. See Ballard &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; 2009 for detailed methods.</td><td></td><td></td><td>Used for binding assay</td></tr></tbody></table>

methods for the discovery of novel compounds modulating a gamma-aminobutyric acid receptor type a neurotransmission

Adım adım bir protokol filtreleme için gama-aminobütirik maddeler ve birleşimler bu el yazması hediye asit yazın (GABAA) reseptörleri ve kimliği roman moleküller preklinik deneyleri bir vitro rekombinant üzerinden aktif doğru kullanımı farmakolojik etkileri kemirgen beyin dilimleri yerel reseptörleri, takımı. Reseptör benzodiazepin sitesinde bağlayıcı bileşikler için radioligand bağlama deneyleri hücre zarlarında büyük GABAA alt türlerini ifade üzerinde geliştirme oluşur bir birincil ekranı ayarlamak için ilk adımdır. O zaman, kemirgen ve insan GABAA reseptörleri Xenopus yumurta veya HEK 293 hücreleri Contegra ifade yararlanarak, elektrofizyolojik deneyleri içinde farklı reseptör fizyolojik özelliklerini keşfetmeye mümkün mü alt türlerini ve tanımlanan bileşiklerin farmakolojik özellikleri. Xenopus oosit sistemi burada, yumurta ve onların mikroenjeksiyon ile iki elektrot gerilimi kelepçeler kullanılarak farmakolojik karakterizasyonu kadar farklı mRNA izolasyonu ile başlayan sunulacaktır. Son olarak, kemirgen beyin dilimler halinde yapılan kayıtları ikincil bir fizyolojik test etkinliği iyi tanımlanmış bir nöronal devre onların yerli reseptörleri, moleküllerin değerlendirmek için kullanılan açıklanacaktır. Hücre dışı kayıtları birden çok nöron nüfus yanıt-e doğru kullanma içinde ilaç uygulama ile birlikte gösterilen.

Watch this Scientific Journal Video about Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission at JoVE.com

Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

Burada, GABAA reseptörleri, fizyoloji ve farmakoloji bağlama, aktif bileşikler keşfetmek için protokolleri mevcut.

Bir Neurotransmission roman bileşikleri bir gama - aminobütirikasit reseptör oransal keşfi için yöntemleri yazın

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

methods-for-discovery-novel-compounds-modulating-gamma-aminobutyric

Universidad de Cartagena UDEC

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Neuroscience

Unit 1

Anxiolytics, Sedatives and Hypnotics

SCIENTISTS IN ACTION

13.6K Görüntüleme.  Roche Innovation Center Basel. Burada, GABAA reseptörleri, fizyoloji ve farmakoloji bağlama, aktif bileşikler keşfetmek için protokolleri mevcut.

Video: Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as appropriate models, partly because the response to behaviorally relevant stimuli and the circuitry parsing stimulus-action outcomes is astonishingly similar between humans and rodents. In studying molecular substrates of complex behaviors, the microinjection of reagents that modify, augment, or silence specific systems is an invaluable technique. However, it is crucial that the microinjection site is precisely targeted in order to aid interpretation of the results. We present a method for the manufacture of surgical implements and microinjection needles that enables accurate microinjection and unlimited customizability with minimal cost. Importantly, this technique can be successfully completed in awake rodents if conducted in conjunction with other JoVE articles that covered requisite surgical procedures. Additionally, there are many behavioral paradigms that are well suited for measuring motivation. The progressive ratio is a commonly used method that quantifies the efficacy of a reinforcer to maintain responding despite an (often exponentially) increasing work requirement. This assay is sensitive to reinforcer magnitude and pharmacological manipulations, which allows reinforcing efficacy and/ or motivation to be determined. We also present a straightforward approach to program operant software to accommodate a progressive ratio reinforcement schedule.

Rodents are an appropriate model to investigate the molecular substrates of behavior and complex psychiatric disorders. Brain microinjection in awake rodents can be used to elucidate disease substrates. An efficient and customizable brain microinjection method as well as the execution of an operant paradigm that quantifies motivation is presented.

Kemirgen Beyin Mikroenjeksiyon Moleküler Alt Tabakalar Motive Davranış Eğitim için

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as ...

Davranış

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Kemirgen Beyin Dilimleri Nöronlar Vibrodissociation Sinaptik İletim ve Görüntü Presinaptik Terminalleri Eğitim

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Nörobilim

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. Currently, the characterization of novel drugs towards their interactions with &#946;-arrestins and other cytosolic proteins is extremely valuable in the field of GPCR drug discovery particularly during the study of GPCR biased agonism. Here, we show the application of a novel structural complementation assay to accurately monitor receptor-&#946;-arrestin interactions in real time living systems. This method is simple, accurate and can be easily extended to any GPCR of interest and also it has the advantage that it overcomes unspecific interactions due to the presence of a low expression promoter present in each vector system. This structural complementation assay provides key features that allow an accurate and precise monitoring of receptor-&#946;-arrestin interactions, making it suitable in the study of biased agonism of any GPCR system as well as GPCR c-terminus &#8216;phosphorylation codes&#8217; written by different GPCR-kinases (GRKs) and post-translational modifications of arrestins that stabilize or destabilize the receptor-&#946;-arrestin complex.

GPCR-&#946;-arrestin interactions are an emerging field in GPCR drug discovery. Accurate, precise and easy to set up methods are necessary to monitor such interactions in living systems. We show a structural complementation assay to monitor GPCR-&#946;-arrestin interactions in real time living cells, and it can be extended to any GPCR.

İzleme GPCR-β-arrestin1/2 etkileşimleri gerçek zamanlı yaşam sistemleri Ilaç Discovery hızlandırmak için

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...

Biyokimya

Using an &#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell surface mobility1-7. To study receptor cell surface localization and endocytosis, the technique described here combines the use of fluorescent &#945;-bungarotoxin with cells expressing constructs containing an &#945;-bungarotoxin (Bgt) binding site (BBS). The BBS (WRYYESSLEPYPD) is based on the &#945; subunit of the muscle nicotinic acetylcholine receptor, which binds Bgt with high affinity8,9. Incorporation of the BBS site allows surface localization and measurements of receptor insertion or removal with application of exogenous fluorescent Bgt, as previously described in the tracking of GABAA and metabotropic GABAB receptors2,10. In addition to the BBS site, we inserted a pH-sensitive GFP (pHGFP11) between amino acids 4 and 5 of the mature GABAAR subunit by standard molecular biology and PCR cloning strategies (see Figure 1)12. The BBS is 3&#39; of the pH-sensitive GFP reporter, separated by a 13-amino acid alanine/proline linker. For trafficking studies described in this publication that are based on fixed samples, the pHGFP serves as a reporter of total tagged GABAAR subunit protein levels, allowing normalization of the Bgt labeled receptor population to total receptor population. This minimizes cell to cell Bgt staining signal variability resulting from higher or lower baseline expression of the tagged GABAAR subunits. Furthermore the pHGFP tag enables easy identification of construct expressing cells for live or fixed imaging experiments.

Here we demonstrate the use of fluorescent Alexa dye coupled to &#945;-bungarotoxin to measure GABA A receptor surface localization and endocytosis in hippocampal neurons. Through the use of constructs bearing a short extracellular tag that binds &#945;-bungarotoxin, analysis of plasma membrane protein endocytic trafficking can be achieved.

GABA A reseptör Membran Yerelleşme ve Ticareti Eğitim için bir α-bungarotoksin Bağlama Sitesi Tag Kullanımı

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell ...

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA (&#947;-aminobutyric acid) is the predominant inhibitory neurotransmitter in the brain. It is released from the presynaptic terminals of inhibitory neurons within highly specialized intercellular junctions known as synapses, where it binds to GABAA receptors (GABAARs) present at the plasma membrane of the synapse-receiving, postsynaptic neurons. Activation of these GABA-gated ion channels leads to influx of chloride resulting in postsynaptic potential changes that decrease the probability that these neurons will generate action potentials. 
During development, diverse types of inhibitory neurons with distinct morphological, electrophysiological and neurochemical characteristics have the ability to recognize their target neurons and form synapses which incorporate specific GABAARs subtypes. This principle of selective innervation of neuronal targets raises the question as to how the appropriate synaptic partners identify each other. 
To elucidate the underlying molecular mechanisms, a novel in vitro co-culture model system was established, in which medium spiny GABAergic neurons, a highly homogenous population of neurons isolated from the embryonic striatum, were cultured with stably transfected HEK293 cell lines that express different GABAAR subtypes. Synapses form rapidly, efficiently and selectively in this system, and are easily accessible for quantification. Our results indicate that various GABAAR subtypes differ in their ability to promote synapse formation, suggesting that this reduced in vitro model system can be used to reproduce, at least in part, the in vivo conditions required for the recognition of the appropriate synaptic partners and formation of specific synapses. Here the protocols for culturing the medium spiny neurons and generating HEK293 cells lines expressing GABAARs are first described, followed by detailed instructions on how to combine these two cell types in co-culture and analyze the formation of synaptic contacts.

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

The molecular mechanisms that co-ordinate the formation of inhibitory GABAergic synapses during ontogeny are largely unknown. To study these processes,we have developed a co-culture model system which incorporates embryonic medium spiny GABAergic neurons cultured together with stably transfected human embryonic kidney 293 (HEK293) cells expressing functional GABAA receptors.

Co-kültür Model Birleşmeyle GABA&#39;erjik Orta Spiny Nöronlar ve HEK293 Hücreler inhibitör Synapse Oluşumu istikrarlı bir şekilde GABA ifade<sub&gt; A</sub&gt; Reseptörler

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR malfunction, expressed as either over- or under-activity caused by mutations, altered expression, trafficking, or localization, can contribute to numerous diseases, especially in the central nervous system. Therefore, understanding the receptor&#39;s biology as well as facilitating the discovery of compounds and small molecules is crucial in ongoing efforts to combat neurological diseases. Current approaches to studying the receptor have limitations including low throughput, high cost, and the inability to study its functional abilities due to the necessary presence of channel blockers to prevent NMDAR-mediated excitotoxicity. Additionally, the existing assay systems are sensitive to stimulation by glutamate only and lack sensitivity to stimulation by glycine, the other co-ligand of the NMDAR. Here, we present the first plate-based assay with high-throughput power to study an NMDA receptor with sensitivity to both co-ligands, glutamate and D-serine/glycine. This approach allows the study of different NMDAR subunit compositions and allows functional studies of the receptor in glycine- and/or glutamate-sensitive modes. Additionally, the method does not require the presence of inhibitors during measurements. The effects of positive and negative allosteric modulators can be detected with this assay and the known pharmacology of NMDAR has been replicated in our system. This technique overcomes the limitations of existing methods and is cost-effective. We believe that this novel technique will accelerate the discovery of therapies for NMDAR-mediated pathologies.

The goal of this protocol is to facilitate the study of NMDA-receptors (NMDAR) at a larger scale and allow the examination of modulatory effects of small molecules and their therapeutic applications.

NMDA reseptörleri glisin/D-serin ve glutamat duyarlılık ile çalışmak için bir yüksek-den geçerek kalsiyum-flux tahlil

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The method is based on the specific binding of a radioligand to its biological target. Therefore, frozen tissue sections are incubated with radioligand solution, and the binding to the target is subsequently localized by the detection of radioactive decay, for example, by using photosensitive film or phosphor imaging plates. Resulting digital autoradiograms display remarkable spatial resolution, which enables quantification and localization of radioligand binding in distinct anatomical structures. Moreover, quantification allows for the pharmacological characterization of ligand affinity by means of dissociation constants (Kd), inhibition constants (Ki) as well as the density of binding sites (Bmax) in selected tissues. Thus, the method provides information about both target localization and ligand selectivity. Here, the technique is exemplified with autoradiographic characterization of the high-affinity &#947;-hydroxybutyric acid (GHB) binding sites in mammalian brain tissue, with special emphasis on methodological considerations regarding the binding assay parameters, the choice of the radioligand and the detection method.

The method of autoradiography is routinely used to study binding of radioligands to tissue sections for determination of qualitative or quantitative pharmacology.

Görselleştirme ve farmakolojik hedefleri karakterizasyonu için basit ve güçlü yöntemi olarak autoradiography

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The ...

A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different stimuli. The &#945;-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) receptors, which are responsible for fast excitatory synaptic transmission in neurons, are trafficked to and from the postsynaptic surface to dynamically alter neuronal excitability. AMPA receptor trafficking is essential for synaptic plasticity and can be disrupted in neurological disease. However, prevalent approaches for quantifying receptor trafficking ignore entire receptor pools, are overly time- and labor-intensive, or potentially disrupt normal trafficking mechanisms and therefore complicate the interpretation of resulting data. We present a high-content assay for the quantification of both surface and internal AMPA receptor populations in cultured primary hippocampal neurons using dual fluorescent immunolabeling and a near-infrared fluorescent 96-well microplate scanner. This approach facilitates the rapid screening of bulk internalized and surface receptor densities while minimizing sample material. However, our method has limitations in obtaining single-cell resolution or conducting live cell imaging. Finally, this protocol may be amenable to other receptors and different cell types, provided proper adjustments and optimization.

Neuronal excitability can be modulated through a dynamic process of endo- and exocytosis of excitatory ionotropic glutamate receptors. Described here is an accessible, high-content assay for quantifying surface and internal receptor population pools.

AMPA izlemek için bir yüksek-içerik tahlil reseptör ticareti

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different ...

A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices

Monoamine neurotransmitters are associated with numerous neurologic and psychiatric ailments. Animal models of such conditions have shown alterations in monoamine neurotransmitter release and uptake dynamics. Technically complex methods such as electrophysiology, Fast Scan Cyclic Voltammetry (FSCV), imaging, in vivo&#160;microdialysis, optogenetics, or use of radioactivity are required to study monoamine function. The method presented here is an optimized two-step approach for detecting monoamine release in acute brain slices using a 48-well plate containing tissue holders for examining monoamine release, and high-performance liquid chromatography coupled with electrochemical detection (HPLC-ECD) for monoamine release measurement. Briefly, rat brain sections containing regions of interest, including prefrontal cortex, hippocampus, and dorsal striatum were obtained using a tissue slicer or vibratome. These regions of interest were dissected from the whole brain and incubated in an oxygenated physiological buffer. Viability was examined throughout the experimental time course, by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. The acutely dissected brain regions were incubated in varying drug conditions that are known to induce monoamine release through the transporter (amphetamine) or through the activation of exocytotic vesicular release (KCl). After incubation, the released products in the supernatant were collected and analyzed through an HPLC-ECD system. Here, basal monoamine release is detected by HPLC from acute brain slices. This data supports previous in vivo and in vitro results showing that AMPH and KCl induce monoamine release. This method is particularly useful for studying mechanisms associated with monoamine transporter-dependent release and provides an opportunity to screen compounds affecting monoamine release in a rapid and low-cost manner.

This method introduces a simple technique for the detection of endogenous monoamine release using acute brain slices. The setup uses a 48-well plate containing a tissue holder for monoamine release. Released monoamine is analyzed by HPLC coupled with electrochemical detection. Additionally, this technique provides a screening method for drug discovery.

Akut Beyin Dilimlerinde Endojen Monoamin Salınımının Ölçümü için Plaka Bazlı Bir Tahlil

Monoamine neurotransmitters are associated with numerous neurologic and psychiatric ailments. Animal models of such conditions have shown alterations in ...

Microtransplantation of Synaptic Membranes to Reactivate Human Synaptic Receptors for Functional Studies

Excitatory and inhibitory ionotropic receptors are the major gates of ion fluxes that determine the activity of synapses during physiological neuronal communication. Therefore, alterations in their abundance, function, and relationships with other synaptic elements have been observed as a major correlate of alterations in brain function and cognitive impairment in neurodegenerative diseases and mental disorders. Understanding how the function of excitatory and inhibitory synaptic receptors is altered by disease is of critical importance for the development of effective therapies. To gain disease-relevant information, it is important to record the electrical activity of neurotransmitter receptors that remain functional in the diseased human brain. So far this is the closest approach to assess pathological alterations in receptors' function. In this work, a methodology is presented to perform microtransplantation of synaptic membranes, which consists of reactivating synaptic membranes from snap frozen human brain tissue containing human receptors, by its injection and posterior fusion into the membrane of Xenopus laevis oocytes. The protocol also provides the methodological strategy to obtain consistent and reliable responses of &#945;-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) and &#947;-aminobutyric acid (GABA) receptors, as well as novel detailed methods that are used for normalization and rigorous data analysis.

The protocol demonstrates that by performing microtransplantation of synaptic membranes into Xenopus laevis oocytes, it is possible to record consistent and reliable responses of &#945;-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid and &#947;-aminobutyric acid receptors.

Fonksiyonel Çalışmalar için İnsan Sinaptik Reseptörlerini Yeniden Aktive Etmek için Sinaptik Membranların Mikrotransplantasyonu

Excitatory and inhibitory ionotropic receptors are the major gates of ion fluxes that determine the activity of synapses during physiological neuronal ...