Name: methods for the discovery of novel compounds modulating a gamma-aminobutyric acid receptor type a neurotransmission
Uploaded: 2018-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
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Gli autori ringraziano Judith Lengyel, Maria Karg, Grégoire Friz, Rachel Haab e Marie Claire Pflimlin da Roche e Tifany Schaer e Deborah Paolucci da HiQScreen per la loro eccellente assistenza tecnica.

Xenopus laevis sono ospitato e gestito secondo le direttive di animale del Canton Ginevra.
1. Radioligand Binding
<ol><li>
Preparazione del piatto dosaggio
	<ol>
<li>Preparare 1,5 L di tampone di dosaggio con 5 mM KCl, 1,25 mM CaCl2, 1,25 mM MgCl2, 120 mM NaCl e 15 mM Tris; regolare il pH con HCl a 7,4.</li>
		<li>Preparare i composti da sottoporre a 50.76 µM (ad es., un composto a 10 mM in un 980 µ l di tampone di dosaggio in una microcentrifuga 5 µ l). Mescolare bene usando una macchina vortice ad alta velocità per 2 – 5 s.</li>
		<li>Preparare una pre-diluizione del flumazenil composto di riferimento di pipettaggio 1 µ l del composto (10 mM) a 1.970 µ l di tampone di dosaggio. Mescolare bene usando una macchina vortice ad alta velocità per 2 – 5 s.</li>
		<li>Diluire una soluzione di riserva di flumazenil [3H] con il tampone di dosaggio a 4 ° C a 4 nM in un tubo in polipropilene da 50 mL.</li>
		<li>Pipettare 50 µ l/pozzetto di tampone del saggio nelle colonne 1 e 3 – 11 di una micropiastra a 96 pozzetti come mostrato nel layout della piastra rappresentato nella Figura 2.</li>
		<li>73,2 µ l dei composti diluito a 50.76 µM (Vedi punto 1.1.2) nella colonna 12 della piastra.</li>
		<li>Diluire ciascun composto, utilizzando una progressione geometrica sopra 9 gradini (1E-10 – 1E–06 M), con un 23,12 µ l di trasferimento e riempire colonne 3 – 11. Mescolare accuratamente la diluizione. Cambiare la punta dopo ogni diluizione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Diluire le membrane cellulari
	<ol>
<li>Scongelare le membrane delle cellule precedentemente isolate da un overesprimenti HEK293 umano del recettore GABAA (0.025 – 0,15 mg/mL) per ottenere 80 mL a temperatura ambiente (TA) e trasferire la sospensione nel buffer di dosaggio a 4 ° C.</li>
		<li>Risospendere la soluzione di membrana ancora a 4 ° C con un omogeneizzatore del tessuto per 30 – 40 s a 10.000-12.000 giri/min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Diluire il diazepam per il controllo di legame aspecifico (NSB)
	<ol>
<li>Diluire una soluzione di riserva di diazepam 4 mM con il tampone di dosaggio ad una concentrazione di 40 µM in 5 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Avviare la reazione
	<ol>
<li>Pipettare 50 µ l di 4 nM [3H] flumazenil in ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti e conservarla in un contenitore di acqua ghiacciata.</li>
		<li>Aggiungere 100 µ l della preparazione di membrane sottotipo recettoriale GABAA per avere una concentrazione di proteina di 0,5 mg/mL.</li>
		<li>Pipettare 50 µ l di diazepam di 40 µM nella colonna 2.</li>
		<li>Incubare la piastra per 1h sul ghiaccio.</li>
		<li>Aggiungere 50 µ l di tampone di dosaggio in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti filtro di separazione a membrana successive e misura di radioattività e interrompere la reazione in seguito.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fermare la reazione
	<ol>
<li>Preparare un tampone di lavaggio con 50 mM Tris-HCl, pH 7.4.</li>
		<li>Filtrare la soluzione mediante un harvester cella 96 pozzetti. Lavare la piastra 3 x con 300 µ l di tampone di lavaggio ghiacciata per pozzetto.</li>
		<li>Sigillare il fondo del piatto con una pellicola di plastica e aggiungere 40 µ l di cocktail per il liquido di scintillazione scintillazione contando ogni bene e pulire con etanolo 70%.</li>
		<li>Scuotere delicatamente la piastra per almeno 1 h a TA. Lasciate riposare per almeno un'altra ora a TA.</li>
		<li>Misurare la radioattività (in CPM) inserendo la piastra su un contatore di scintillazione. Consentire una misurazione per 3 min per pozzetto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analisi dei dati
	<ol>
<li>Determinare che la media per le 8 replica di legame aspecifico (NSB) e l'associazione totale (TB) come pure per quanto riguarda i duplicati o triplici copie dei campioni. Calcolare il legame specifico % (SB) per la media di ogni campione secondo la seguente equazione: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq1.jpg"> Qui, totale SB = la media TB meno il dire NSB.</li>
		<li>Trama in ascissa il SB % versus in ordinata le concentrazioni dell'inibitore. Inserire i dati utilizzando l'equazione di analisi concorrenza singolo sito: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq2.jpg"> Qui, y = la % di SB, A = minimo di y, B = il numero massimo di y, C = la IC50, X = il log10 della concentrazione del composto concorrente, D = la pendenza della curva (un coefficiente di Hill).</li>
		<li>Calcolare l'affinità di legame (Ki) usando la mezza concentrazione inibitoria massima (IC50), la costante di dissociazione (Kd) di flumazenil [3H] sulle rispettive membrane9e la concentrazione di [3H] Flumazenil nell'analisi secondo la seguente equazione utilizzando dati: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq3.jpg">
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. recettore espressione e registrazioni in ovociti di Xenopus
<ol><li>Ovaie di raccolta e preparazione degli ovociti
	<ol>
<li>Preparare la soluzione sterile di Barth con 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2,4 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,82 mM MgSO4.7h2O, 0,33 mM Ca (NO3)2.4h2O e 0,41 mM CaCl2.6h2O, a pH 7,4 , completati con 100 unità/mL di penicillina, 100 µ g/mL streptomicina e 0,25 µ g/mL di amfotericina b.</li>
		<li>Preparare il supporto di x OR2 1 (nessun CaCl2) con 88,5 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 5 mM HEPES, 1 mM MgCl2.6h2O, a pH 7,4.</li>
		<li>Sacrificio una Xenopus Laevis femmina di anestesia profonda per 20 min in raffreddato Tricaina metansolfonato (ad una concentrazione di 150 mg/L, regolata a pH 7,4) e bicarbonato di sodio (300 mg/L) seguita dalla decapitazione.</li>
		<li>Raccogliere le ovaie rapidamente con pinze e forbici pulite e metterli in 2 di-Petri (10cm) riempito con 40 mL di soluzione di Barth e antibiotici/antimicotici: 1x.</li>
		<li>Conservare le ovaie non dissociato per fino a 2 settimane in soluzione di Barth a 4 ° C.</li>
		<li>Per la dissociazione, tagliare le ovaie con una lama di rasoio pulita in piccole frazioni (1 – 2 cm3) e incubare li in 50 mL di mezzo di OR2 senza CaCl2 (OR2-noCaCl2) contenente collagenasi di 0,2% (tipo I) alle 17 – 19 ° C in un filatore di 100 mL matraccio con un'agitazione lenta per 4 – 5 h. Verificare che la barra magnetica è posto circa 3 – 5 cm sopra il fondo del matraccio spinner per evitare di schiacciare gli ovociti.</li>
		<li>Dopo 4 – 5 h, verificare che la maggior parte degli ovociti sono liberata dal loro follicolo (cioè, che nuotano intorno individualmente). Lavare 5X con 200 mL di OR2 completati con 1,8 mM CaCl2.</li>
		<li>Trasferire la defolliculated ovociti di Petri (10cm) riempito con soluzione di Barth e antibiotici/antimicotici e tenerli almeno una notte a 17 ° C prima dell'iniezione di cDNA o mRNA.</li>
		<li>Il giorno successivo, seleziona, sotto un binocolo, un ovocita sano che presenta una chiara e distinta animale contro un palo vegetal (marrone scuro per il polo animale contro giallo chiaro per il palo vegetal). Utilizzare pipette Pasteur pulite e gettare gli ovociti uno per uno in una piastra ben di 96-iniezione conica sterile. Nota: non è richiesta nessuna particolare attenzione nel posizionamento degli ovociti per le iniezioni di mRNA; considerando che, per le iniezioni di cDNA, è indispensabile per orientare gli ovociti con il polo animale rivolto verso l'alto.</li>
	</ol></li>
	<li>iniezione automatica mRNA o del cDNA
	<ol>
<li>Sintetizzare i mRNAs utilizzando un kit disponibile in commercio seguendo le istruzioni consigliate. Pulire gli strumenti e la tabella con RNAsi e indossare i guanti di protezione appropriati. Nota: La qualità del mRNA è determinante per ottenere una buona espressione, ed è indispensabile per evitare la degradazione di mRNA durante la procedura di iniezione.</li>
		<li>Preparare i cDNAs utilizzando un kit disponibile in commercio e sciogliere la quantità desiderata in acqua bidistillata ad una concentrazione di 0,2 µ g / µ l.</li>
		<li>Iniettare 10 – 50 nL di soluzione di mRNA ad una concentrazione di 0,2 µ g / µ l, o 10 nL di cDNA soluzione ad una concentrazione da 0,02 – 0,2 µ g / µ l, preferibilmente in lotti di 95 ovociti.</li>
		<li>Per membrana proteine che richiedono più subunità (cioè, i recettori eteromerici α1β2γ2 GABAA ), mescolare il corrispondente mRNA o cDNAs nel rapporto desiderato (cioè, 1:1:1 o 1:10:1).</li>
		<li>Mantenere l'ovocita a 17 ° C al fine di prevenire l'espressione di heat shock proteins gli ovociti; conservare la micropiastra in un'area di deposito termo-controllata.</li>
		<li>Sciogliere i residui della prova che erano risultati positivi nel test associazione a OR2 a 0,1 – 1.000 µM per registrazioni elettrofisiologiche e li smaltire in una lastra in polipropilene fondo piatto 96 pozzetti.</li>
	</ol></li>
	<li>Plasmidi per l'espressione
	<ol>
<li>Seguire i manuali di istruzioni dei kit disponibili in commercio per la sintesi di mRNA con promotori batterici T7 o T6 e fare 20 µ l di una soluzione a 0,2 µ g / µ l in acqua RNAsi-libera.</li>
		<li>Preparare almeno 20 µ l di una soluzione contenente un vettore di espressione dell'eucariota per l'espressione di cDNA, in genere a 0,2 µ g / µ l, disciolto in acqua bidistillata.</li>
	</ol></li>
	<li>Microiniezione nell'ovocita e la visualizzazione della sua qualità
	<ol>
<li>Iniettare 10 – 50 nL di soluzione contengono il plasmide (Vedi punto 2.3.1 o 2.3.2) utilizzando un ago di micro-iniezione di vetro con un diametro di punta che vanno fino a 100 µm montata su un micromanipolatore equipaggiato con un sistema di espulsione di pressione o con un sistema automatizzato ad iniezione. Nota: Nell'esempio discusso qui, gli ovociti vengono iniettati con i lotti di 95 con un sistema automatizzato adatto ad uso con cDNA o mRNA.</li>
		<li>Riempire l'ago per iniezione con 1 µ l di un colorante come il blu di metilene all'1% e iniettare gli ovociti mediante la procedura standard (sia nel nucleo per cDNA o nel citoplasma per mRNA).</li>
		<li>Smaltire gli ovociti iniettati per circa 1 minuto in acqua bollente. Tagliare gli ovociti a metà con una lama di rasoio sotto un binocolo. Nota: Il colorante rimane localizzato come mostrato in Figura 3E, permettendo un'osservazione precisa dell'iniezione.</li>
	</ol></li>
	<li>Registrazioni di due elettrodi tensione morsetto
	<ol>
<li>Posizionare la piastra ben contenente gli ovociti sul sistema automatizzato, che utilizza il principio illustrato nella Figura 4. Nota: In contrasto con il sistema del morsetto di patch illustrato nella Figura 5, il potenziale di membrana vero della cella viene letto tramite l'elettrodo di tensione.</li>
		<li>Programmare il sistema di registrazione automatizzata utilizzando l'interfaccia basata su icone con, ad esempio, lo schema illustrato nella Figura 6 per la determinazione del rapporto di attività di concentrazione.</li>
	</ol></li>
	<li>Adattamento alla curva
	<ol>
<li>Analizzare i risultati utilizzando il software appropriato, utilizzando la curva di attivazione illustrato concentrazione, trama l'ampiezza corrente in funzione del logaritmo della concentrazione dell'agonista.</li>
		<li>Osservare la curva sigmoidale che può successivamente essere equipaggiata con l'equazione empirica di collina nel modulo: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq4.jpg"> Qui, Y= la frazione di corrente evocati, CE 50 = la concentrazione per un 50% di attivazione, x = la concentrazione del composto, nH = il coefficiente di Hill o la cooperatività apparente.</li>
		<li>Normalizzare le correnti ad un'unità dividendo l'ampiezza di ogni risposta contro il valore registrato al più alta concentrazione di analizzare i dati ottenuti da una serie di celle.</li>
		<li>Determinare la media e gli errori standard e realizzare l'adattamento delle curve utilizzando software come standard disponibili.</li>
	</ol></li>
</ol>3. elettrofisiologiche registrazioni nelle fette del cervello
Nota: Fette Hippocampal del ratto sono preparati in conformità con le linee guida nazionali e istituzionali.
<ol><li>
Preparazione delle fette dell'ippocampo
	<ol>
<li>Preparare il liquido cerebro-spinale artificiale dissezione (dACSF) con 124 mM NaCl 124, 2,5 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, 2mm MgSO4.7h2O, 2,5 mM CaCl2 2 H2O, 26mm NaHCO3, glucosio di 10 mM e 4 mM saccarosio gassificato in bottiglia con una miscela di 95% O2 e 5% CO2.</li>
		<li>Preparare il registrazione fluido cerebro-spinale artificiale (rACSF) con 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, 2mm MgSO4.7h2O, 2,5 mM CaCl2 2 H2O, 25mm NaHCO3e 10 millimetri di glucosio gassificato in bottiglia con una miscela di 95% O2 e 5% CO2.</li>
		<li>Anestetizzare i ratti utilizzando una miscela di 2,5% isoflurane e ossigeno puro e decapitare loro.</li>
		<li>Tagliare il cuoio capelluto seguendo la linea mediana con un bel paio di forbici. Tagliare il cranio lungo la linea mediana senza danneggiare il tessuto sottostante. Rimuovere il cranio con le pinzette e utilizzare una spatola fine per scavare il cervello.</li>
		<li>Posizionare il cervello nella soluzione dACSF gasati a RT e sezionare la formazione hippocampal di sinistra con una spatola fine.</li>
		<li>Tagliare in sezioni trasversali (spessore 400 µm) dalla parte media dell'ippocampo con un elicottero di tessuto e trasferirli alla camera di registrazione con l'uso di un pennello di pittura. Mantenere le fette a RT per 45 min.</li>
		<li>Irrorare le fette con la rACSF gasati a 35 ° C e a una velocità di 1,5 mL/min bolla la soluzione con una miscela di 95% O2 e 5% CO2. Nota: Dopo questo passaggio, le fette sono pronte per gli esperimenti elettrofisiologici.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Registrazione di spike singola popolazione
	<ol>
<li>Mettete una fetta di cervello nella camera microscopio-montato.</li>
		<li>Irrorare la fetta a una velocità di 3 mL/min con rACSF.</li>
		<li>Tirare una micropipetta di vetro borosilicato con l'estrattore di pipetta avendo una resistenza di MΩ ~ 2. Nota: Questa micropipetta è usata come un elettrodo di registrazione e viene collegata elettricamente all'amplificatore.</li>
		<li>Riempire la micropipetta con una soluzione contenente 2 M NaCl e inserirlo nel supporto pipetta dell'amplificatore.</li>
		<li>Posizione la micropipetta di registrazione nel pyramidale corneum nella regione CA1 di fettine di ippocampo utilizzando il micromanipolatore giusto. Nota: Il percorso è rappresentato schematicamente nella Figura 7.</li>
		<li>Posizionare un elettrodo di platino/iridio bipolare isolato nel supporto sul micromanipolatore di sinistra. Nota: Questo elettrodo viene utilizzato come l'elettrodo di stimolazione ed è collegato elettricamente al generatore di stimolo.</li>
		<li>Posizionare l'elettrodo di stimolazione nei collaterali di Schaffer nella regione CA1 della fetta hippocampal utilizzando il micromanipolatore giusto. Nota: Il percorso è rappresentato schematicamente nella Figura 7.</li>
		<li>Fornire un impulso di corrente all'elettrodo di stimolazione utilizzando il generatore di stimolo ogni 30 s (durate 100 µs, a partire da 10 µA) e aumentare gradualmente l'intensità di stimolazione fino a un picco di popolazione (PS) viene visualizzato.</li>
		<li>Regolare l'intensità di stimolo per evocare un PS corrispondente al 45% dell'ampiezza massima che può essere ottenuta. PSs sono filtrati a 2,4 KHz e digitalizzati a 20 KHz utilizzando l'amplificatore di segnale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inibizione di accoppiare-impulso
	<ol>
<li>Preparare le fettine di cervello (punto 3.1) e procedere come descritto in precedenza (punti 3.2.1–3.2.7).</li>
		<li>Fornire due impulsi di corrente (100 µs durate a un intervallo di 20 ms) all'elettrodo di stimolazione ogni 30 s utilizzando il generatore di stimolo. Regolare l'intensità di stimolo per evocare un PS corrispondente al 45% dell'ampiezza massima.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Compound test
	<ol>
<li>Effettuare diluizioni dei composti da testare in ACSF gasati affinché la concentrazione finale di DMSO non superiore allo 0,1%.</li>
		<li>Aggiungere alla soluzione di controllo alla stessa concentrazione di quella nella soluzione composta DMSO.</li>
		<li>Registrare un singolo (punto 3.2) o un PS di accoppiare-impulso (punto 3.3) evocato da stimoli collaterali di Schaffer ogni 30 s per almeno 30 min. La forma di PS deve essere stabile durante questo periodo di previsione.</li>
		<li>Preparare un becher con gasati rACSF contenente una concentrazione fissa del composto da testare.</li>
		<li>Irrorare le fettine di ippocampo con questa soluzione mentre ancora registrando il singolo o accoppiare-impulso PS.</li>
		<li>Valutare il recupero dall'effetto composto irrorando la fetta con gasati rACSF senza il composto. Nota: Per effetti reversibili, il PS Torna alla sua forma iniziale osservato durante il periodo della linea di base prima dell'applicazione di composto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analisi dei dati
	<ol>
<li>Media le tracce di PS registrata durante l'esperimento in blocchi di 4 utilizzando il software di analisi dati.</li>
		<li>Misurare le ampiezze di PS delle tracce media.</li>
		<li>Normalizzare le ampiezze come percentuale dei valori di baseline registrato 10 min prima che irrora un composto.</li>
		<li>Esprimere i dati come media ± SEM</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rudolph, U., Knoflach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+classical+benzodiazepines:+novel+therapeutic+potential+of+GABAA+receptor+subtypes.">Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10, 685-697 (2011).</li><li>Sieghart, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+pharmacology+of+g-aminobutyric+acidA+receptor+subtypes.">Structure and pharmacology of g-aminobutyric acidA receptor subtypes.</a> Pharmacological Reviews. 47, 181-234 (1995).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+functional+assay+for+characterization+of+g-aminobutyric+acidA+channel+modulators+using+cryopreserved+transiently+transfected+cells.">A high-throughput functional assay for characterization of g-aminobutyric acidA channel modulators using cryopreserved transiently transfected cells.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 781-786 (2008).</li><li>Mennerick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+voltage-sensitive+dyes+modulate+GABAA+receptor+function.">Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function.</a> Journal of Neuroscience. 30, 2871-2879 (2010).</li><li>Hevers, W., Luddens, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diversity+of+GABAA+receptors.+Pharmacological+and+electrophysiological+properties+of+GABAA+channel+subtypes.">The diversity of GABAA receptors. 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Gli autori Frédéric Knoflach e Maria-Clemencia Hernandez sono dipendenti di F. Hoffmann-La Roche AG, 4070 Basilea, Svizzera, una società farmaceutica. L'autore Daniel Bertrand è un dipendente di 6 HiQScreen Sàrl, rte de Compois, 1222 Vésenaz Ginevra, fornendo servizi di screening per le aziende farmaceutiche.

Lo sviluppo di nuovi composti attivi a un canale ionico legante-gated come i recettori GABAA richiede l'utilizzo di approcci multipli. In genere, il primo passo è spesso condotto mediante analisi obbligatorie; Tuttavia, tali misure sono insufficienti per caratterizzare l'attività fisiologica del composto o sua farmacologia preciso. In particolare, un composto che si lega a un recettore può migliorare o inibire la sua funzione o anche non produrre alcun effetto funzionale (tacere) (cioè, legano al recettore senza modificare la sua funzione). Quindi, un test funzionale è necessario per una caratterizzazione completa composta.
Saggi di binding: Il vantaggio principale del dosaggio associazione è che può essere condotta in modo efficiente su un gran numero di campioni che vanno fino a diverse migliaia e che fornisce affinità di legame per molecole attive. Come descritto nel presente documento, il primo passo consiste nello stabilire un metodo per la valutazione dei sottotipi del ricevitore desiderato. Vale a dire, mentre l'associazione può essere condotta su recettori nativi da frazioni o intero cervello, tale metodo impedirà la determinazione delle affinità a sottotipi recettoriali specifici. Pertanto, è necessario utilizzare sistemi ricombinanti per molecole schermo presso la destinazione desiderata. Al giorno d'oggi, una trasfezione transiente o stabile dei cDNA subunità del recettore desiderata in linee cellulari offre un metodo efficiente e affidabile per esprimere i sottotipi del ricevitore di interesse (ad es., GABAA α5β3γ2). Associazione tradizionale saggi fanno uso di radioligands, ma al giorno d'oggi le tecniche sono disponibili che evitare l'inconveniente di movimentazione radioattività (ad es., basati sulla fluorescenza quantitativa ligand-legantesi).
Espressione funzionale in un sistema host: Per esprimere geni in un sistema host, la sequenza di codificazione di interesse deve essere inserita in un plasmide contenente i promotori adeguati. In genere, per la sintesi di mRNA in vitro , i promotori di T7 o T6 batterici vengono utilizzati. Per un'espressione di cDNA, la trascrizione del gene di interesse deve essere regolata da un promotore dell'eucariota come CMV (citomegalovirus) o equivalente. Al giorno d'oggi, diversi plasmidi, compresi i due promotori (cioè, pUNIV, pCMV-6AC, psf-CMV/T7, pCI-neo, pcDNA), sono disponibili permettendo una sintesi in vitro di mRNA o un'espressione di cDNA come mostrato in Figura 15. Un'espressione dei recettori GABAA possa essere ottenuta fedelmente nelle linee cellulari o in ovociti di Xenopus . I principali vantaggi di questi ultimi sono la mancanza di espressione del recettore endogeno, la semplicità di manipolazioni e la disponibilità di un sistema automatizzato per micro-iniezioni e registrazioni. Le procedure descritte in questo protocollo illustrano l'efficienza del sistema automatizzato che consente l'iniezione di 96 ovociti in circa 7 minuti e non richiede nessuna abilità di micromanipolazione. Ricordando che un unico ovario da una Xenopus contiene tra 10.000-30.000 ovociti, è chiaro che un gran numero di misurazioni delle cellule può essere condotta su una singola preparazione. Inoltre, come un'espressione può essere condotta mediante iniezioni di cDNA, lo stessi plasmidi contenenti i geni di interesse che sono stati sviluppati per gli esperimenti di associazione possono essere utilizzati per una caratterizzazione funzionale senza la necessità di ulteriore biologia molecolare manipolazioni.
Data la sua grande dimensione e alta espressione di superficie, un singolo ovocita produce un numero di recettori che è approssimativamente equivalente a cellule confluenti in una capsula di Petri da 35 mm. Tuttavia, un'iniezione e preparazione di ovociti rappresenta una frazione del costo di una linea cellulare, come gli esperimenti non richiedono un terreno di coltura specifico e manipolazioni sterili. L'attivazione di un singolo canale di GABAA produce pochi picoamperes (10-12) e le correnti che vanno fino a decine di microampere (10-6) sono facilmente registrate in un singolo oocita, che conferma l'attività concomitante di diversi milioni di recettori durante una singola risposta.
Un primo passo nella caratterizzazione dei canali ionici ligando è spesso la determinazione dell'apparente affinità dei recettori. Gli esperimenti che devono essere condotte sono costituiti da applicando una serie di impulsi di prova breve agonista e tramando l'ampiezza dell'evocati corrente o, in alcuni casi, l'area sotto la curva (AUC) in funzione del logaritmo della concentrazione dell'agonista. Come è facilmente fattibile da microinject plasmide diverse concentrazioni e rapporto nello stesso batch di ovociti, questo sistema di espressione è particolarmente appropriato per tale caratterizzazione. Inoltre, un confronto lotto ha rivelato un alto grado di stabilità per diversi CE50s. L'influenza della composizione in subunità su affinità apparente del ricevitore è visualizzato prontamente usando una trama di ragno, come esemplificato nella Figura 10.
I risultati del morsetto tensione due elettrodi ottenuti in ovociti di Xenopus sono spesso confrontati con le registrazioni effettuate usando elettrodi di patch clamp. Considerando che andrebbe oltre lo scopo di questo lavoro per andare in un confronto dettagliato tra questi due sistemi, possono essere esaminati alcuni punti. Mentre un morsetto di patch in cellule offre vantaggi per una caratterizzazione biofisica con un'applicazione veloce di droga, i requisiti sono più complessi di quelli delle registrazioni del due-elettrodo in ovociti di Xenopus . Una difficoltà prima e non trascurabile è l'espressione di una data proteina con la necessità di una coltura cellulare, un transitorio o trasfezione stabile e l'identificazione delle cellule che esprimono il costrutto desiderato. Inoltre, è indispensabile esaminare il possibile contributo dell'espressione endogena nella cella considerata. Inoltre, una registrazione di morsetto di patch richiede una persona esperta per condurre la micromanipolazione sotto un microscopio ad alto ingrandimento, mentre quella persona deve anche eseguire un'analisi adeguata durante l'esperimento per valutare, ad esempio, la qualità della guarnizione, la resistenza di accesso ecc In contrasto, un morsetto di tensione del due-elettrodo registrazione, specialmente uno utilizzando un sistema elettrofisiologico automatico, non richiede competenze specifiche e può essere condotta dai tecnici di laboratorio.
Quando l'acquisizione di un set-up elettrofisiologico, costo considerazione è certamente un fattore importante che deve essere attentamente analizzati. Ad esempio, mentre il costo di un sistema automatizzato è relativamente alto, un confronto più vicino rivela che l'installazione di un rig elettrofisiologico completo include l'acquisto di attrezzature quali buone micromanipolatori, una lente binoculare, un amplificatore, una perfusione sistema e un tavolo antivibrazione, mentre anche l'acquisizione di dati e l'esecuzione di un'analisi. Un confronto dei costi tra un due-elettrodo tensione morsetto set-up contro un set-up di patch clamp rivela ulteriormente discrepanze. Inoltre, il sistema automatizzato offre il vantaggio di attrezzature completamente automatizzate e viene eseguito in automatico giorno e notte.
Le proprietà farmacologiche di un composto sono determinate dalla relativa modalità di azione sui recettori. Ad esempio, inibitori competitivi sono molecole che possono immettere la stessa associazione tasca, o ortosterici sito, come l'agonista stessa provoca un concorso. Inibitori non-competitivi sono composti che inibiscono i recettori interagendo in un altro sito e, nel caso di un canale ionico legante-gated, che possono inserire e bloccare il poro ionico, ad esempio. Andrebbe oltre lo scopo di questo lavoro per esaminare i diversi meccanismi di interazione, ma ulteriori informazioni possono essere ottenute da un libro di testo farmacologico e/o da altri lavori come Bertrand e di Bertrand22.
Nel caso di modulatori allosterici, il composto si lega a un sito che è distinto dal sito ortosterici, ma la presenza della molecola modifica la barriera energetica tra gli Stati attivi e altri. Modulatori allosterici positivi (PAMs) sono composti che riducono la barriera energetica da riposo allo stato attivo e, di conseguenza, migliorano l'effetto dell'agonista. Per caratterizzare gli effetti possibili di PAM, è, pertanto, necessario per determinare se un'esposizione al composto migliora la risposta per l'agonista e, in caso affermativo, a quale concentrazione. Gli esperimenti presentati in Figura 11 e Figura 14 illustrano protocolli che possono essere utilizzati con successo per la caratterizzazione di PAMs presso i recettori GABAA .
In alcuni casi, l'esposizione a PAM da solo potrebbe essere sufficiente per attivare i recettori. Tale attività può essere determinata da una leggera modifica del protocollo sperimentale presentato qui. Vale a dire, invece di utilizzare una co-applicazione del modulatore durante l'esposizione al GABA, il protocollo può essere modificato per l'applicazione di primo il composto da solo e quindi in presenza di GABA. Una caratterizzazione dell'attività agonista diretto avverrà tramite la determinazione dell'ampiezza della risposta evocata dal composto stesso e rispetto all'attuale GABA-evocati.
Esperimenti condotti nelle fette del cervello, come illustrato nella Figura 7, vengono utilizzati per confermare l'attività del composto a recettori nativi in un circuito inibitorio definitivo prima di andare avanti nei modelli animali e lungo il sentiero verso sperimentazioni cliniche. Il protocollo di registrazione e analisi di dati relativamente semplice permette la classifica dei più composti valutando il loro effetto modulatory differenziale sull'ampiezza di PS. Non specifici effetti di composti che non sono legati al sistema GABA possono anche essere rilevato (per esempio, quando sono osservati cambiamenti nella forma PS). Diretto, neurotrasmissione GABAergica può essere valutata in questi casi di misurare gli effetti dei composti su correnti postsinaptiche inibitorie (IPSCs) utilizzando le cellule intere patch clamp tecnica8.

Qui, presentiamo i protocolli per la scoperta di composti attivi sui recettori GABAA , dall'associazione alla fisiologia e alla farmacologia. Nella ricerca di nuove molecole specifiche per i recettori GABAA , è cruciale per definire, nel modo più preciso possibile, il sottotipo di interesse e la valutazione della specificità dei composti recentemente identificati (ad es., per una rassegna, Vedi Rudolph e Knoflach1o Sieghart2). Il percorso tipico in drug discovery e i passaggi che devono essere raggiunti sono illustrati nella Figura 1.
Analisi obbligatorie sono state e sono ancora in gran parte utilizzate come il primo passo nella scoperta della droga. Nel caso di recettori GABAA , sono ottimizzati per identificare i composti che si legano al sito di legame delle benzodiazepine, del recettore, dove associare farmaci terapeuticamente utili e sicuri. Altre tecniche, utilizzando fluorometrica imaging piastra lettore (FLIPR) membrana potenziale saggi basati su colorante rosso3, rilevano composti come i barbiturici che legano ad altri siti che sono meno desiderabili a causa del loro profilo di effetti collaterali indesiderato. Inoltre, i coloranti utilizzati direttamente possono attivare recettori GABAA , così in discussione l'utilità di questi saggi per drug discovery4. Analisi di associazione può fornire solo la prova che un determinato composto può essere associato a una classe di recettori specifici. In vitro saggi con le membrane cellulari sono utilizzati per identificare selettivo umani ligandi dei recettori GABAA α5β3γ2. Transitoriamente transfected le cellule HEK293 esprimendo l'umano GABAA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 e α3β3γ2 recettori vengono utilizzate per preparare le membrane per queste analisi. L'effetto dei ligandi è rilevata misurando la scintillazione di flumazenil [3H] associati a recettori di membrana (un'inibizione del legame di flumazenil [3H]). Il vantaggio principale di questa tecnica è che una determinazione rapida ed efficiente dell'affinità al recettore di interesse composto-associazione viene fornita presso il recettore di interesse.
Gli studi funzionali sono essenziali per valutare l'attività funzionale dei composti e di proporre una spiegazione fisiologica e farmacologica dei meccanismi causato dall'associazione dei composti ai recettori. Oggi, è incontestato che funzionale dei recettori GABAA risultato dall'assemblaggio di cinque subunità attorno a un asse di pseudosymmetry formata dal poro ionico e risultato dall'assembly di cinque subunità identiche. La maggior parte dei recettori GABAA sono composti da due o più unità secondarie differenti. Il recettore importante del cervello GABAA , per esempio, è composta delle subunità α1, β2 e γ2 in una stechiometria di 2, 2 e 1 rispettivamente5,6. Una ricostituzione in un sistema host come gli ovociti di Xenopus o cellule HEK293 offre la possibilità di esplorare rapidamente le proprietà farmacologiche dei recettori.
Le proprietà farmacologiche dei composti sono poi Esplorate con registrazioni extracellulari nel cervello fette7. Questo metodo permette un'esplorazione dell'effetto dei composti sulla neurotrasmissione e fornisce un modo efficace per confermare gli effetti funzionali dei composti determinati in sistemi eterologhi a livello dei recettori nativi in generale ambiente di un neurone. Neurotrasmissione GABAergica è valutabile anche a livello molecolare, misurando gli effetti dei composti su correnti postsinaptiche inibitorie (IPSCs)8. Ma il protocollo usato qui e basate sulle cellule intere patch morsetto registrazioni nelle fette del cervello è più elaborato e produce una velocità di trasmissione inferiore.
Infine, la forza e debolezza in vitro screening cascata utilizzato per l'identificazione di ligandi selettivi per α5β3γ2 è discussi nella prospettiva di diverse tecniche e i loro limiti intrinseci. Questo lavoro dovrebbe fornire esperti e non esperti nel campo dei recettori GABAA una recensione utile la combinazione di approcci diversi in vitro utilizzata per affrontare la scoperta di nuovi modulatori di questi canali ionici ligando.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;General equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 well cell harvester -(Filtermate 196)&amp;nbsp;</td><td>Packard</td><td></td><td>To filter membranes with bound radioligand</td></tr><tr><td>Microtiter plate liquid scintillation counter (Top Count NXT)</td><td>Packard</td><td></td><td>Microplate Scintillation and Luminescence counter</td></tr><tr><td>Vial liquid scintillation counter (Beta-Couter 2500 TR)</td><td>Packard</td><td></td><td>Vial Scintillation and Luminescence counter</td></tr><tr><td>Liquid&amp;nbsp; handler (Biomek 2000)</td><td>Beckman coulter</td><td></td><td>To prepare compound dilutions</td></tr><tr><td>Vortex (Vortex Genie 2)</td><td>Scientific industries Inc.</td><td></td><td>To mix compound stock solutions</td></tr><tr><td>Tissue homogenizer (Polytron PT1200E)</td><td>Kinematica AG</td><td></td><td>To resuspend the membrane preparations</td></tr><tr><td>XLfit5 software</td><td>Microsoft Excel&lt;br/&gt; &amp;nbsp;add-on by IDBS</td><td></td><td>Curve fitting software</td></tr><tr><td>Smart Pull</td><td>UniPix</td><td>-</td><td>Electrode Puller</td></tr><tr><td>RoboInject</td><td>MultiChannel Systems</td><td>-</td><td>Automated Injection (Xenopus Oocytes)</td></tr><tr><td>HiClamp</td><td>MultiChannel Systems</td><td>-</td><td>Automated Voltage Clamp (&lt;em&gt;Xenopus&lt;/em&gt; Ooocytes)</td></tr><tr><td>DataMining</td><td>MultiChannel Systems</td><td>-</td><td>Data Analysis Software</td></tr><tr><td>DataMerger</td><td>MultiChannel Systems</td><td>-</td><td>Data Processing Software</td></tr><tr><td>Digidata 1550</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Low noise data acquisition system</td></tr><tr><td>CyberAmp 380 or equivalent</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>Programmable Signal Conditioner</td></tr><tr><td>pClamp program suite</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Software for data acquisition and analysis software</td></tr><tr><td>Antivibraton table&amp;nbsp;</td><td>TMC</td><td></td><td>To avoid microelectrode vibrations&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Patchstar Micromanipulators</td><td>Scientifica</td><td></td><td>To accurately position microelectrodes in brain slices</td></tr><tr><td>Faraday Cage&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>To isolate recordings from noise</td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>Campden Instruments LTD&amp;nbsp;</td><td></td><td>To prepare brain slices</td></tr><tr><td>Borosilicate glass micropipette&amp;nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>GC150TF-10</td><td>To record extracellular potentials in brain slices</td></tr><tr><td>Twisted pair, platinum iridium wires stimulation electrode</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>To stimulate the brain slices with current</td></tr><tr><td>Stimulus generator for current and voltage driven stimulation</td><td>MultiChannel Systems</td><td>STG4000</td><td>Delivers the current to the stimulation electrode</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Plasticware&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtiter plate round bottom</td><td>Corning</td><td>#3365</td><td>Used for the binding assay</td></tr><tr><td>GF/C glassfibre filter-bottom 96-well microplate with 1.2 &amp;micro;m poresize, for cell harvesting assays using a vacuum manifoldwell filter&amp;nbsp;</td><td>Packard&amp;nbsp;</td><td>#6005174</td><td>used for the binding assay</td></tr><tr><td>50 mL Tubes</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>#352070</td><td>used for the binding assay</td></tr><tr><td>Safe-lock tubes 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>#0030 120086</td><td>used for the binding assay</td></tr><tr><td>Safe-lock tubes 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>#0030 120094</td><td>used for the binding assay</td></tr><tr><td>Shipping tubes 180 mL&amp;nbsp;</td><td>Semadeni Europe AG&amp;nbsp;</td><td>#3722</td><td>used for the binding assay</td></tr><tr><td>Pony vial Polyethylene 6 mL&amp;nbsp;</td><td>Perkin Elmer&amp;nbsp;</td><td>#6013329</td><td>used for the binding assay</td></tr><tr><td>Top Seal&amp;nbsp;</td><td>Perkin Elmer&amp;nbsp;</td><td>#60051859</td><td>used for the binding assay</td></tr><tr><td>Spinner Flask</td><td>Bellco</td><td>BELLCO # 1965-00100</td><td>Spinner Flask</td></tr><tr><td>96&amp;nbsp; Well Plate (Conical)</td><td>Thermo Scientific Milian</td><td>56368</td><td>Injection plate for the oocytes</td></tr><tr><td>96&amp;nbsp; Well Plate (Flat bottom)</td><td>Corning (Vitaris Switzerland)</td><td>3364-cor</td><td>Compound Plate for the HiClamp</td></tr><tr><td>Glass capillary&amp;nbsp;</td><td>Hilgenberg (Germany)</td><td>-</td><td>borosilicate glass 1.2 O.D. 0.76 I.D. with filament</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;RNA preparation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ambion mMessage mMachine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>for the &lt;em&gt;in vitro&lt;/em&gt; synthesis</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Assay buffer: KCl 5 mM; CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 1.25 mM; MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 1.25 mM; NaCl 120 mM; Tris 15 mM pH adjust with HCl to 7.4; store up to 3 months at 4 &amp;deg;C.</td><td></td><td></td><td>Used for binding assay</td></tr><tr><td>Washing buffer: Tris 50 mM -HCl pH 7.4; store at 4 &amp;deg;C.</td><td></td><td></td><td>Used for binding assay</td></tr><tr><td>Stock solution of test compounds 10 mM in DMSO</td><td></td><td></td><td>Used for binding assay</td></tr><tr><td>Flumazenil (RO0151788) 10 mM in DMSO</td><td></td><td></td><td>Used for binding assay</td></tr><tr><td>Diazepam 4 mM in DMSO</td><td></td><td></td><td>Used for binding assay</td></tr><tr><td>[&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H]-Flumazenil 60-85 Ci/mmol in Ethanol; store at -20 &amp;deg;C</td><td></td><td></td><td>Used for binding assay</td></tr><tr><td>Microscint 40&amp;nbsp;</td><td>Packard&amp;nbsp;</td><td>#6013641</td><td>Used for binding assay</td></tr><tr><td>Ultima Gold&amp;nbsp;</td><td>Perkin Elmer&amp;nbsp;</td><td>#6013329</td><td>Used for binding assay</td></tr><tr><td>MS-222</td><td>Sigma</td><td>Sigma # A5040</td><td>MS-222</td></tr><tr><td>AB/AM</td><td>Sigma</td><td>Sigma # A5955</td><td>antibiotics / antimycotics</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Sigma</td><td>Sigma # C1030</td><td>Collagenase Type I</td></tr><tr><td>Rnase</td><td>Sigma</td><td>Sigma # R2020-250 mL</td><td>RNaseZAP</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>Qiagen # 12362</td><td></td></tr><tr><td>Salts for artificial cerebrospinal fluid (NaCl, KCl, etc.)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Membranes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frozen membrane preparations from transient or stably transfected HEK293 overexpressing different human GABA&lt;sub&gt;A&lt;/sub&gt; receptor subtypes: &amp;alpha;1&amp;beta;3&amp;gamma;2, &amp;alpha;2&amp;beta;3&amp;gamma;2, &amp;alpha;3&amp;beta;3&amp;gamma;2, &amp;alpha;5&amp;beta;3&amp;gamma;2. See Ballard &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; 2009 for detailed methods.</td><td></td><td></td><td>Used for binding assay</td></tr></tbody></table>

methods for the discovery of novel compounds modulating a gamma-aminobutyric acid receptor type a neurotransmission

Questa presenta manoscritto un protocollo dettagliato per lo screening composti a gamma-amminobutirrico acido digitare un recettori (GABAA) ed il relativo uso verso l'identificazione di nuove molecole attive nei saggi preclinici da un ricombinante in vitro recettore ai loro effetti farmacologici dei recettori nativi nelle fette del cervello del roditore. Per composti vincolante al sito del recettore delle benzodiazepine, il primo passo è quello di impostare una schermata principale che consiste di sviluppare analisi obbligatorie radioligand sulle membrane delle cellule che esprimono i principali sottotipi di GABAA . Poi, approfittando dell'espressione eterologa dei recettori GABAA roditore e umani in oociti di Xenopus o cellule HEK 293, è possibile esplorare, nelle analisi elettrofisiologiche, le proprietà fisiologiche del recettore diverso le proprietà farmacologiche dei composti identificati e sottotipi. Il sistema di ovociti di Xenopus sarà presentato qui, a partire con l'isolamento di ovociti e loro microiniezione con differenti mRNA, fino alla caratterizzazione farmacologica utilizzando due elettrodi tensione morsetti. Infine, le registrazioni condotte nelle fette del cervello del roditore saranno descritto utilizzati come secondario fisiologico test per valutare l'attività delle molecole alle loro recettori nativi in un circuito ben definito di un neurone. Registrazioni extracellulari utilizzando le risposte di popolazione dei neuroni multipli sono dimostrate unitamente alla domanda di droga.

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Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

Qui, presentiamo protocolli per scoprire composti attivi sui recettori GABAA , dall'associazione alla fisiologia e alla farmacologia.

Metodi per la scoperta di nuovi composti modulando un recettore dell'acido Gamma - aminobutirrico tipo una neurotrasmissione

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

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Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation di neuroni da fettine di cervello di roditore studio di trasmissione sinaptica e Immagine terminali presinaptici

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

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Neuroscienze

GABA-activated Single-channel and Tonic Currents in Rat Brain Slices

The GABAA channels are present in all neurons and are located both at synapses and outside of synapses where they generate phasic and tonic currents, respectively 4,5,6,7 The GABAA channel is a pentameric GABA-gated chloride channel. The channel subunits are grouped into 8 families (&alpha;1-6, &beta;1-3, &gamma;1-3, &delta;, &#949;, &theta;, &pi; and &rho;). Two alphas, two betas and one 3rd subunit form the functional channel 8. By combining studies of sub-type specific GABA-activated single-channel molecules with studies including all populations of GABAA channels in the neuron it becomes possible to understand the basic mechanism of neuronal inhibition and how it is modulated by pharmacological agents.
We use the patch-clamp technique 9,10 to study the functional properties of the GABAA channels in alive neurons in hippocampal brain slices and record the single-channel and whole-cell currents. We further examine how the channels are affected by different GABA concentrations, other drugs and intra and extracellular factors. For detailed theoretical and practical description of the patch-clamp method please see The Single-Channel Recordings edited by B Sakman and E Neher 10.

We use the patch-clamp technique to measure GABA-activated single-channel currents (GABAA channels, GABAA receptors) and the synaptic and tonic currents they generate in neurons. Activation of the channels decreases neuronal excitability in health and disease 1,2,3,4.

Correnti a singolo canale e Tonico GABA-attivati ​​in fettine di cervello di ratto

The GABAA channels are present in all neurons and are located both at synapses and outside of synapses where they generate phasic and tonic currents, ...

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. Currently, the characterization of novel drugs towards their interactions with &#946;-arrestins and other cytosolic proteins is extremely valuable in the field of GPCR drug discovery particularly during the study of GPCR biased agonism. Here, we show the application of a novel structural complementation assay to accurately monitor receptor-&#946;-arrestin interactions in real time living systems. This method is simple, accurate and can be easily extended to any GPCR of interest and also it has the advantage that it overcomes unspecific interactions due to the presence of a low expression promoter present in each vector system. This structural complementation assay provides key features that allow an accurate and precise monitoring of receptor-&#946;-arrestin interactions, making it suitable in the study of biased agonism of any GPCR system as well as GPCR c-terminus &#8216;phosphorylation codes&#8217; written by different GPCR-kinases (GRKs) and post-translational modifications of arrestins that stabilize or destabilize the receptor-&#946;-arrestin complex.

GPCR-&#946;-arrestin interactions are an emerging field in GPCR drug discovery. Accurate, precise and easy to set up methods are necessary to monitor such interactions in living systems. We show a structural complementation assay to monitor GPCR-&#946;-arrestin interactions in real time living cells, and it can be extended to any GPCR.

Monitoraggio delle interazioni GPCR-arresto 1/2 nei sistemi di vita in tempo reale per accelerare la scoperta di farmaci

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...

Biochimica

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Veloce micro-ionoforesi di glutammato e GABA: un utile strumento per indagare l&#39;integrazione Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Using an &#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell surface mobility1-7. To study receptor cell surface localization and endocytosis, the technique described here combines the use of fluorescent &#945;-bungarotoxin with cells expressing constructs containing an &#945;-bungarotoxin (Bgt) binding site (BBS). The BBS (WRYYESSLEPYPD) is based on the &#945; subunit of the muscle nicotinic acetylcholine receptor, which binds Bgt with high affinity8,9. Incorporation of the BBS site allows surface localization and measurements of receptor insertion or removal with application of exogenous fluorescent Bgt, as previously described in the tracking of GABAA and metabotropic GABAB receptors2,10. In addition to the BBS site, we inserted a pH-sensitive GFP (pHGFP11) between amino acids 4 and 5 of the mature GABAAR subunit by standard molecular biology and PCR cloning strategies (see Figure 1)12. The BBS is 3&#39; of the pH-sensitive GFP reporter, separated by a 13-amino acid alanine/proline linker. For trafficking studies described in this publication that are based on fixed samples, the pHGFP serves as a reporter of total tagged GABAAR subunit protein levels, allowing normalization of the Bgt labeled receptor population to total receptor population. This minimizes cell to cell Bgt staining signal variability resulting from higher or lower baseline expression of the tagged GABAAR subunits. Furthermore the pHGFP tag enables easy identification of construct expressing cells for live or fixed imaging experiments.

Here we demonstrate the use of fluorescent Alexa dye coupled to &#945;-bungarotoxin to measure GABA A receptor surface localization and endocytosis in hippocampal neurons. Through the use of constructs bearing a short extracellular tag that binds &#945;-bungarotoxin, analysis of plasma membrane protein endocytic trafficking can be achieved.

L&#39;utilizzo di un α-bungarotossina Binding Tag sito per studiare GABA un recettore di membrana localizzazione e il traffico

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell ...

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA (&#947;-aminobutyric acid) is the predominant inhibitory neurotransmitter in the brain. It is released from the presynaptic terminals of inhibitory neurons within highly specialized intercellular junctions known as synapses, where it binds to GABAA receptors (GABAARs) present at the plasma membrane of the synapse-receiving, postsynaptic neurons. Activation of these GABA-gated ion channels leads to influx of chloride resulting in postsynaptic potential changes that decrease the probability that these neurons will generate action potentials. 
During development, diverse types of inhibitory neurons with distinct morphological, electrophysiological and neurochemical characteristics have the ability to recognize their target neurons and form synapses which incorporate specific GABAARs subtypes. This principle of selective innervation of neuronal targets raises the question as to how the appropriate synaptic partners identify each other. 
To elucidate the underlying molecular mechanisms, a novel in vitro co-culture model system was established, in which medium spiny GABAergic neurons, a highly homogenous population of neurons isolated from the embryonic striatum, were cultured with stably transfected HEK293 cell lines that express different GABAAR subtypes. Synapses form rapidly, efficiently and selectively in this system, and are easily accessible for quantification. Our results indicate that various GABAAR subtypes differ in their ability to promote synapse formation, suggesting that this reduced in vitro model system can be used to reproduce, at least in part, the in vivo conditions required for the recognition of the appropriate synaptic partners and formation of specific synapses. Here the protocols for culturing the medium spiny neurons and generating HEK293 cells lines expressing GABAARs are first described, followed by detailed instructions on how to combine these two cell types in co-culture and analyze the formation of synaptic contacts.

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

The molecular mechanisms that co-ordinate the formation of inhibitory GABAergic synapses during ontogeny are largely unknown. To study these processes,we have developed a co-culture model system which incorporates embryonic medium spiny GABAergic neurons cultured together with stably transfected human embryonic kidney 293 (HEK293) cells expressing functional GABAA receptors.

Inibitorio formazione di sinapsi in un co-coltura modello che incorpora GABAergici di medie spinosa neuroni e cellule HEK293 che esprimono stabilmente GABA<sub&gt; A</sub&gt; Recettori

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices

Pharmacological administration is commonly used when conducting whole-cell patch-clamp recording in brain slices. One of the best methods of drug application during electrophysiological recording is the puff technique, which can be used to study the effect of pharmacological reagents on neuronal activities in brain slices. The greatest advantage of puff application is that the drug concentration around the recording site increases rapidly, thus preventing desensitization of membrane receptors. Successful use of puff application involves careful attention to the following elements: the concentration of the drug, the parameters of the puff micropipette, the distance between the tip of a puff micropipette and the neuron recorded, and the duration and pressure driving the puff (pounds per square inch, psi). This article describes a step-by-step procedure for recording whole-cell currents induced by puffing gamma-aminobutyric acid (GABA) onto a neuron of a prefrontal cortical slice. Notably, the same procedure can be applied with minor modifications to other brain areas such as the hippocampus and the striatum, and to different preparations, such as cell cultures.

We describe the puff technique, by which pharmacological reagents can be administered during whole-cell patch-clamp recording, and highlight various aspects of the features that are crucial for its success.

Cellule intere correnti indotte dall'applicazione di Puff di GABA nelle fette del cervello

Pharmacological administration is commonly used when conducting whole-cell patch-clamp recording in brain slices. One of the best methods of drug ...

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR malfunction, expressed as either over- or under-activity caused by mutations, altered expression, trafficking, or localization, can contribute to numerous diseases, especially in the central nervous system. Therefore, understanding the receptor&#39;s biology as well as facilitating the discovery of compounds and small molecules is crucial in ongoing efforts to combat neurological diseases. Current approaches to studying the receptor have limitations including low throughput, high cost, and the inability to study its functional abilities due to the necessary presence of channel blockers to prevent NMDAR-mediated excitotoxicity. Additionally, the existing assay systems are sensitive to stimulation by glutamate only and lack sensitivity to stimulation by glycine, the other co-ligand of the NMDAR. Here, we present the first plate-based assay with high-throughput power to study an NMDA receptor with sensitivity to both co-ligands, glutamate and D-serine/glycine. This approach allows the study of different NMDAR subunit compositions and allows functional studies of the receptor in glycine- and/or glutamate-sensitive modes. Additionally, the method does not require the presence of inhibitors during measurements. The effects of positive and negative allosteric modulators can be detected with this assay and the known pharmacology of NMDAR has been replicated in our system. This technique overcomes the limitations of existing methods and is cost-effective. We believe that this novel technique will accelerate the discovery of therapies for NMDAR-mediated pathologies.

The goal of this protocol is to facilitate the study of NMDA-receptors (NMDAR) at a larger scale and allow the examination of modulatory effects of small molecules and their therapeutic applications.

Un'analisi di flusso di calcio High-throughput per studiare i recettori NMDA con sensibilità al glutammato e glicina/D-serina

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The method is based on the specific binding of a radioligand to its biological target. Therefore, frozen tissue sections are incubated with radioligand solution, and the binding to the target is subsequently localized by the detection of radioactive decay, for example, by using photosensitive film or phosphor imaging plates. Resulting digital autoradiograms display remarkable spatial resolution, which enables quantification and localization of radioligand binding in distinct anatomical structures. Moreover, quantification allows for the pharmacological characterization of ligand affinity by means of dissociation constants (Kd), inhibition constants (Ki) as well as the density of binding sites (Bmax) in selected tissues. Thus, the method provides information about both target localization and ligand selectivity. Here, the technique is exemplified with autoradiographic characterization of the high-affinity &#947;-hydroxybutyric acid (GHB) binding sites in mammalian brain tissue, with special emphasis on methodological considerations regarding the binding assay parameters, the choice of the radioligand and the detection method.

The method of autoradiography is routinely used to study binding of radioligands to tissue sections for determination of qualitative or quantitative pharmacology.

Autoradiografia come un metodo semplice e potente per la visualizzazione e caratterizzazione di bersagli farmacologici

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The ...

A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices

Monoamine neurotransmitters are associated with numerous neurologic and psychiatric ailments. Animal models of such conditions have shown alterations in monoamine neurotransmitter release and uptake dynamics. Technically complex methods such as electrophysiology, Fast Scan Cyclic Voltammetry (FSCV), imaging, in vivo&#160;microdialysis, optogenetics, or use of radioactivity are required to study monoamine function. The method presented here is an optimized two-step approach for detecting monoamine release in acute brain slices using a 48-well plate containing tissue holders for examining monoamine release, and high-performance liquid chromatography coupled with electrochemical detection (HPLC-ECD) for monoamine release measurement. Briefly, rat brain sections containing regions of interest, including prefrontal cortex, hippocampus, and dorsal striatum were obtained using a tissue slicer or vibratome. These regions of interest were dissected from the whole brain and incubated in an oxygenated physiological buffer. Viability was examined throughout the experimental time course, by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. The acutely dissected brain regions were incubated in varying drug conditions that are known to induce monoamine release through the transporter (amphetamine) or through the activation of exocytotic vesicular release (KCl). After incubation, the released products in the supernatant were collected and analyzed through an HPLC-ECD system. Here, basal monoamine release is detected by HPLC from acute brain slices. This data supports previous in vivo and in vitro results showing that AMPH and KCl induce monoamine release. This method is particularly useful for studying mechanisms associated with monoamine transporter-dependent release and provides an opportunity to screen compounds affecting monoamine release in a rapid and low-cost manner.

This method introduces a simple technique for the detection of endogenous monoamine release using acute brain slices. The setup uses a 48-well plate containing a tissue holder for monoamine release. Released monoamine is analyzed by HPLC coupled with electrochemical detection. Additionally, this technique provides a screening method for drug discovery.

Un test basato su piastre per la misurazione del rilascio di monoamina endogena in fette cerebrali acute

Monoamine neurotransmitters are associated with numerous neurologic and psychiatric ailments. Animal models of such conditions have shown alterations in ...

Metodi per la scoperta di nuovi composti modulando un recettore dell'acido Gamma - aminobutirrico tipo una neurotrasmissione

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Vibrodissociation di neuroni da fettine di cervello di roditore studio di trasmissione sinaptica e Immagine terminali presinaptici

Correnti a singolo canale e Tonico GABA-attivati in fettine di cervello di ratto

Monitoraggio delle interazioni GPCR-arresto 1/2 nei sistemi di vita in tempo reale per accelerare la scoperta di farmaci

Veloce micro-ionoforesi di glutammato e GABA: un utile strumento per indagare l'integrazione Synaptic

L'utilizzo di un α-bungarotossina Binding Tag sito per studiare GABA un recettore di membrana localizzazione e il traffico

Inibitorio formazione di sinapsi in un co-coltura modello che incorpora GABAergici di medie spinosa neuroni e cellule HEK293 che esprimono stabilmente GABA

Cellule intere correnti indotte dall'applicazione di Puff di GABA nelle fette del cervello

Un'analisi di flusso di calcio High-throughput per studiare i recettori NMDA con sensibilità al glutammato e glicina/D-serina

Autoradiografia come un metodo semplice e potente per la visualizzazione e caratterizzazione di bersagli farmacologici

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