Name: methods for the discovery of novel compounds modulating a gamma-aminobutyric acid receptor type a neurotransmission
Uploaded: 2018-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission at JoVE.com

המחברים תודה ג'ודית לינגל, מריה Karg, Grégoire פריץ, רחל Haab, ו מארי קלייר Pflimlin של רוש ו שר סרט דבורה Paolucci מ- HiQScreen לקבלת סיוע טכני מעולה שלהם.

<ol>
	<li>Rudolph, U., Knoflach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+classical+benzodiazepines:+novel+therapeutic+potential+of+GABAA+receptor+subtypes.">Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10, 685-697 (2011).</li><li>Sieghart, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+pharmacology+of+g-aminobutyric+acidA+receptor+subtypes.">Structure and pharmacology of g-aminobutyric acidA receptor subtypes.</a> Pharmacological Reviews. 47, 181-234 (1995).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+functional+assay+for+characterization+of+g-aminobutyric+acidA+channel+modulators+using+cryopreserved+transiently+transfected+cells.">A high-throughput functional assay for characterization of g-aminobutyric acidA channel modulators using cryopreserved transiently transfected cells.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 781-786 (2008).</li><li>Mennerick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+voltage-sensitive+dyes+modulate+GABAA+receptor+function.">Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function.</a> Journal of Neuroscience. 30, 2871-2879 (2010).</li><li>Hevers, W., Luddens, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diversity+of+GABAA+receptors.+Pharmacological+and+electrophysiological+properties+of+GABAA+channel+subtypes.">The diversity of GABAA receptors. Pharmacological and electrophysiological properties of GABAA channel subtypes.</a> Molecular Neurobiology. 18, 35-86 (1998).</li><li>Macdonald, R. L., Olsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor+channels.">GABAA receptor channels.</a> Annual Review of Neuroscience. 17, 569-602 (1994).</li><li>Kemp, J. A., Marshall, G. R., Wong, E. H., Woodruff, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+affinities,+potencies+and+efficacies+of+some+benzodiazepine-receptor+agonists,+antagonists+and+inverse-agonists+at+rat+hippocampal+GABAA-receptors.">The affinities, potencies and efficacies of some benzodiazepine-receptor agonists, antagonists and inverse-agonists at rat hippocampal GABAA-receptors.</a> British Journal of Pharmacology. 91, 601-608 (1987).</li><li>Prenosil, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+subtypes+of+GABAA+receptors+mediate+phasic+and+tonic+forms+of+inhibition+in+hippocampal+pyramidal+neurons.">Specific subtypes of GABAA receptors mediate phasic and tonic forms of inhibition in hippocampal pyramidal neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96, 846-857 (2006).</li><li>Ballard, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RO4938581,+a+novel+cognitive+enhancer+acting+at+GABAA+a5+subunit-containing+receptors.">RO4938581, a novel cognitive enhancer acting at GABAA a5 subunit-containing receptors.</a> Psychopharmacology. 202, 207-223 (2009).</li><li>Knoflach, F., Hernandez, M. C., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor-mediated+neurotransmission:+Not+so+simple+after+all.">GABAA receptor-mediated neurotransmission: Not so simple after all.</a> Biochemical Pharmacology. 115, 10-17 (2016).</li><li>Gielen, M. C., Lumb, M. J., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzodiazepines+modulate+GABAA+receptors+by+regulating+the+preactivation+step+after+GABA+binding.">Benzodiazepines modulate GABAA receptors by regulating the preactivation step after GABA binding.</a> Journal of Neuroscience. 32, 5707-5715 (2012).</li><li>Bergmann, R., Kongsbak, K., Sorensen, P. L., Sander, T., Balle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unified+model+of+the+GABAA+receptor+comprising+agonist+and+benzodiazepine+binding+sites.">A unified model of the GABAA receptor comprising agonist and benzodiazepine binding sites.</a> PLoS One. 8, 52323 (2013).</li><li>Richter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diazepam-bound+GABAA+receptor+models+identify+new+benzodiazepine+binding-site+ligands.">Diazepam-bound GABAA receptor models identify new benzodiazepine binding-site ligands.</a> Nature Chemical Biology. 8, 455-464 (2012).</li><li>Rudolph, U., Crestani, F., Mohler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor+subtypes:+dissecting+their+pharmacological+functions.">GABAA receptor subtypes: dissecting their pharmacological functions.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 22, 188-194 (2001).</li><li>Wisden, W., Seeburg, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor+channels:+from+subunits+to+functional+entities.">GABAA receptor channels: from subunits to functional entities.</a> Current Opinion in Neurobiology. 2, 263-269 (1992).</li><li>Davies, C. H., Davies, S. N., Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired-pulse+depression+of+monosynaptic+GABA-mediated+inhibitory+postsynaptic+responses+in+rat+hippocampus.">Paired-pulse depression of monosynaptic GABA-mediated inhibitory postsynaptic responses in rat hippocampus.</a> The Journal of Physiology. 424, 513-531 (1990).</li><li>Karnup, S., Stelzer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+overlap+of+excitatory+and+inhibitory+afferent+input+in+guinea-pig+CA1+pyramidal+cells.">Temporal overlap of excitatory and inhibitory afferent input in guinea-pig CA1 pyramidal cells.</a> The Journal of Physiology. 516, 485-504 (1999).</li><li>Turner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feed-forward+inhibitory+potentials+and+excitatory+interactions+in+guinea-pig+hippocampal+pyramidal+cells.">Feed-forward inhibitory potentials and excitatory interactions in guinea-pig hippocampal pyramidal cells.</a> The Journal of Physiology. 422, 333-350 (1990).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pfl&#252;gers Archiv. 391, 85-100 (1981).</li><li>Adelsberger, H., Brunswieck, S., Dudel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Block+by+picrotoxin+of+a+GABAergic+chloride+channel+expressed+on+crayfish+muscle+after+axotomy.">Block by picrotoxin of a GABAergic chloride channel expressed on crayfish muscle after axotomy.</a> European Journal of Neuroscience. 10, 179-187 (1998).</li><li>Hapfelmeier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+slows+inactivation+kinetics+of+rat+recombinant+a1b2g2L+GABAA+receptors:+enhancement+of+GABAergic+transmission+despite+an+open-channel+block.">Isoflurane slows inactivation kinetics of rat recombinant a1b2g2L GABAA receptors: enhancement of GABAergic transmission despite an open-channel block.</a> Neuroscience Letters. 307, 97-100 (2001).</li><li>Bertrand, S., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+electrophysiological+characterization+of+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Overview of electrophysiological characterization of neuronal nicotinic acetylcholine receptors.</a> Current Protocols in Pharmacology. , 17 (2004).</li></ol>

המחברים פרדריק Knoflach והרננדז מריה-Clemencia עובדים של פ הופמן-La Roche AG, 4070 באזל, שוויץ, חברת תרופות. הסופר דניאל ברטרנד הוא עובד של HiQScreen Sàrl 6, כביש דה Compois, 1222 Vésenaz ז'נבה, מתן שרותים ההקרנה לחברות התרופות.

הפיתוח של תרכובות הרומן פעיל תעלת יונים ממותגת ליגנד כגון קולטני GABAA דורש השימוש של מספר גישות. בדרך כלל, הצעד הראשון בדרך כלל מתבצע באמצעות מבחני הכריכה; עם זאת, מדידות כאלה אינם מספיקים לאפיין את פעילות פיזיולוגית של המתחם או פרמקולוגיה המדויק שלו. בפרט, מתחם זה נקשר לקולטן עשוי לשפר או לעכב את תפקידה או אפילו לייצר אין השפעה תפקודית (להיות שקט) (קרי, לאגד הקולטן מבלי לשנות את תפקידו). לכן, בדיקה פונקציונלית נדרש עבור אפיון מלא המורכב.
מבחני האיגוד: היתרון העיקרי של איגוד וזמינותו היא כי זה יכול להיות יעיל נערך על מספר רב של דוגמאות הנעות עד כמה אלפים, שהיא מספקת הזיקות מחייב עבור מולקולות פעילים. כמתואר להלן, הצעד הראשון מורכב להקמת שיטה להערכה מסוגי המשנה קולטן הרצוי. כלומר, בעוד איגוד יכול להתבצע על קולטנים יליד שברים או המוח כולו, השיטה תמנע הקביעה של הזיקות-קולטן ספציפי יחוברו. לכן, צורך להשתמש מערכות רקומביננטי מסך מולקולות על המטרה הרצויה. כיום, תרביות תאים ארעי או יציבה של cDNAs יחידת משנה קולטן הרצויים בשורות תאים מציע שיטה יעילה ואמינה לבטא את תת-סוגי קולטן עניין (למשל, GABAA α5β3γ2). שימוש מסורתי מחייב לבצע מבחני radioligands, אבל כיום טכניקות זמינים זה למנוע את אי הנוחות של טיפול רדיואקטיביות (למשל, כמותי מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית ליגנד מחייב).
ביטוי תפקודית במערכת מחשב מארח: כדי לבטא את הגנים במערכת המחשב המארח, רצף קידוד עניין להוסיף לתוך פלסמיד המכיל את באמרגנים נאותה. בדרך כלל, עבור במבחנה סינתזת mRNA, משמשים את באמרגנים חיידקי T7 או T6. עבור ביטוי cDNA, שעתוק של הגן עניין להיות מפוקח על ידי promotor איקריוטים כגון CMV (cytomegalovirus) או שווה ערך. כיום, מספר פלסמידים, כולל את שני באמרגנים (כלומר, pUNIV, pCMV-6AC, psf-CMV/T7, pCI-neo, pcDNA), הם זמינים, המאפשר סינתזה של במבחנה של mRNA או ביטוי cDNA כמוצג באיור15. ביטוי של קולטני GABAA ניתן להשיג בנאמנות שורות תאים או צפרדע רפואית oocytes. היתרונות העיקריים של האחרונים הם העדר ביטוי הקולטן אנדוגני, הפשטות של מניפולציות, והזמינות של מערכת אוטומטית עבור מיקרו-זריקות והקלטות. בהליכים המתוארים תחת פרוטוקול זה להדגים את היעילות של מערכת אוטומטית אשר מאפשר ההזרקה של 96 oocytes כ 7 דקות והוא דורש כישורים המיקרומניפולציה. לזכור כי שחלה יחיד מ צפרדע רפואית מכילה בין 10,000-30,000 oocytes, ברור כי מספר גדול של מדידות התא יכול להתבצע על תכשיר יחיד. יתר על כן, כפי ביטוי יכול להתבצע באמצעות זריקות cDNA, פלסמידים באותו המכיל את הגנים של עניין זה מפותחים עבור הניסויים איגוד יכול לשמש עבור אפיון פונקציונלי ללא צורך נוסף בביולוגיה מולקולרית מניפולציות.
בהינתן גודל גדול וביטוי משטח גבוהה, oocyte יחיד מניבה מספר קולטנים אשר שווה בקירוב ל התאים confluent 35 מ מ פטרי. עם זאת, הזרקת והכנה oocytes מייצג חלק של העלות של קו תא, כמו הניסויים אינן דורשות מדיום תרבות מסוים ומניפולציות סטרילי. ההפעלה של ערוץ GABAA אחד מניב מספר picoamperes (10-12), זרמי הנעות עד עשרות microampere (10-6) נרשמות בקלות oocyte יחיד, אשר מאשר את הפעילות בו-זמני של מספר מיליוני קולטנים במהלך תשובה בודדת.
שלב ראשוני האפיון של תעלות יונים ממותגת ליגנד לעתים קרובות הקביעה של זיקה לכאורה של הקולטנים. הניסויים צריכים להתנהל מורכב החלה סדרה של פולסים מבחן בקצרה אגוניסט של התוויית את משרעת של עורר הנוכחי או, במקרים מסוימים, האזור מתחת העקומה (AUC) כפונקציה של הלוגריתם של ריכוז אגוניסט. כמו שזה ריאלי בקלות כדי microinject שונים פלסמיד ריכוזים, יחס מאותה אצווה של oocytes, מערכת זו של הביטוי מתאים במיוחד אפיון כזה. יתר על כן, השוואה אצווה-כדי-אצווה חשף רמה גבוהה של יציבות עבור s50EC שונים. השפעת ההרכב יחידה משנית על זיקה נראית לעין של הקולטן הוא מדמיין בקלות באמצעות מזימה עכביש, למשל, באיור10.
התוצאות של המלחציים שני-אלקטרודה מתח בשנת oocytes צפרדע רפואית מושווה לעתים קרובות עם הקלטות שבוצעו באמצעות אלקטרודות מלחציים תיקון. בעוד שזה יגיע מעבר להיקף העבודה הזאת להיכנס השוואה מפורטת בין שתי מערכות אלה, אפשר לבחון כמה נקודות. מלחציים תיקון בתאים מציעה יתרונות עבור אפיון biophysical עם יישום מהיר סמים, לדרישות שלו מורכבים יותר מאלה של ההקלטות שני-אלקטרודה צפרדע רפואית oocytes. קושי שעצירת והראשון הוא הביטוי של חלבון נתון בצורך של תרבות תא, הציעה שתושב זמני או תרביות תאים יציב, וזיהוי של התאים הם ביטוי הבונה הרצוי. בנוסף, היא הכרחית כדי לבחון את התרומה אפשרי של הביטוי אנדוגני בתא נחשב. יתר על כן, הקלטה מלחציים תיקון מחייב אדם מיומן לנהל את המיקרומניפולציה תחת מיקרוסקופ הגדלה גבוהה, בעוד אותו אדם גם צריך לבצע ניתוח נאותה במהלך הניסוי כדי להעריך, לדוגמה, האיכות של החותם. ההתנגדות גישה וכו לעומת זאת, מלחציים שני-אלקטרודה מתח הקלטה, במיוחד אחד באמצעות מערכת אוטומטית אלקטרופיזיולוגיות, אינו דורש שום כישורים ספציפיים, יכול להתבצע על ידי טכנאי מעבדה.
בעת רכישת של הגדרת אלקטרופיזיולוגיות, שיקול העלות היא ללא ספק גורם חשוב שצריך להיות מנותח בקפידה. לדוגמה, בעוד העלות של מערכת אוטומטית היא גבוהה יחסית, השוואה קרוב יותר מגלה כי ההתקנה של מעטה אלקטרופיזיולוגיות מלאה כולל קניית ציוד כגון micromanipulators טוב, עדשה דו-עינית, מגבר, זלוף המערכת, טבלת אנטי רטט, תוך רכישת נתונים וביצוע ניתוח גם. עלות השוואה בין שני-אלקטרודה מתח קלאמפ הגדרת נגד הפללה מלחציים תיקון מגלה אי-התאמות עוד יותר. יתר על כן, המערכת האוטומטית מציעה את היתרון של ציוד ממוחשב ופועל ללא התערבות יום ולילה.
המאפיינים תרופתי של תרכובת נקבעים על ידי פעולתה על הקולטן. לדוגמה, מעכבי תחרותי הם מולקולות יכולים להזין את היד לכיס איגוד, או באתר orthosteric, כמו אגוניסט עצמו גורם תחרות. מעכבי שאינו תחרותי הם תרכובות המעכבות את קולטני על ידי אינטראקציה באתר אחר, במקרה של ערוץ יונים ממותגת ליגנד, שניתן להזין או לחסום הנקבובית יוניים, לדוגמה. זה ילך מעבר להיקף עבודה זו לבחון את מנגנוני שונים של אינטראקציה, אך בהמשך ניתן לקבל מידע מתוך ספר לימוד תרופתי ו/או מהעבודה אחרים כגון ברטרנד, ברטראן22.
במקרה של allosteric מאפננים, איגודים תרכובת-אתר שהוא נבדל באתר orthosteric, אבל הנוכחות של המולקולה משנה מחסום האנרגיה בין המדינות פעיל ועוד. חיובי allosteric מאפננים (PAMs) הם תרכובות להפחית את מחסום אנרגיה מן המנוחה למצב הפעיל ולשפר, לכן, ההשפעה של אגוניסט. כדי לאפיין תופעות אפשריות פאם, יש, לכן לקבוע אם חשיפה למתחם משפר את התגובה אגוניסט,, ואם כן, על איזה ריכוז. הניסויים המוצגים באיור 11 ו -14 איור להמחיש פרוטוקולים יכול לשמש בהצלחה עבור אפיון PAMs על קולטני GABAA .
במקרים מסוימים, חשיפה פאם לבד עשויה להספיק להפעיל את הקולטנים. פעילות כזו יכולה להיקבע על ידי שינוי קל של פרוטוקול ניסיוני המוצג כאן. כלומר, במקום באמצעות יישום שיתוף של אפנן במהלך החשיפה גאבא, הפרוטוקול יכול להיות שונה עבור היישום של הראשונה המתחם לבד ולאחר מכן בנוכחות גאבא. אפיון של הפעילות אגוניסט ישיר ייעשה על ידי קביעת משרעת של התגובה עורר על ידי המתחם עצמו, לעומת הנוכחי עורר-GABA.
ניסויים שנערכו פרוסות המוח, כגון מאויר ב איור 7, משמשים כדי לאשר מתחם פעילות מקורית קולטנים במעגל מעכבות מובהק לפני שנמשיך הלאה במודלים של בעלי חיים, לאורך השביל לכיוון בניסויים קליניים. פרוטוקול הקלטה וניתוח נתונים פשוטים יחסית מאפשר הדירוג של תרכובות מרובים על-ידי הערכת השפעתם modulatory דיפרנציאלית על PS משרעת. אפקטים שאינם ספציפיים של תרכובות שאינן קשורות למערכת גאבא עשוי גם להיות שזוהו (למשל, כאשר שינויים בצורת PS מובחנות). ישירה, GABAergic עצבית יכול להידרש במקרים אלה על ידי מדידת ההשפעות של תרכובות על זרמי מעכבות postsynaptic (IPSCs) באמצעות טכניקה קלאמפ8תאים כל תיקון.

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים על הגילוי של חומרים פעילים על קולטני GABAA , מן הכריכה פיזיולוגיה, פרמקולוגיה. חפש את הרומן מולקולות ספציפיות עבור קולטני GABAA , זה חיוני כדי להגדיר במדויק ככל האפשר, סוג המשנה של עניין את ההערכה של יחודיות של תרכובות שזוהה (ראהלמשל, לסקירה, רודולף ו Knoflach1או Sieghart2). נתיב אופייני. גילוי סמים ואת הצעדים שצריכים להיות מושגת מומחשים באיור1.
מבחני הכריכה, משמשים עדיין בעיקר בשלב הראשון של גילוי תרופות. במקרה של קולטני GABAA , והם ממוטבים לזהות תרכובות לאגד אתר איגוד בנזודיאזפינים של הקולטן איפה לאגד רפואית שימושי ובטוח סמים. טכניקות אחרות, באמצעות fluorometric הדמיה צלחת הקורא (FLIPR) ממברנה פוטנציאליים מבחני מבוסס-צבען אדום3, לזהות תרכובות כמו ברביטורטים לאגד לאתרים נוספים שהן לא רצויות בשל הפרופיל שלהם-לוואי בלתי רצויות. בנוסף, שימוש צבעים ניתן ישירות להפעיל קולטני GABAA , וכך לחקור את התועלת של אלה מבחני. גילוי סמים4. איגוד מבחני יכול לספק רק את הראיות זה תרכובת נתון באפשרותך לאגוד בשיעור קולטן ספציפי. במבחנה מבחני עם קרום התא משמשים לזיהוי האדם סלקטיבי GABAA α5β3γ2 קולטן ליגנדים. Transiently transfected תאים HEK293 לבטא את האדם GABAA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 ו α3β3γ2 רצפטורים משמשות היכונו ממברנות מבחני אלה. השפעת ליגנדים מזוהה על ידי מדידת את נצנוץ של פלומאזניל [3H] מחויב על קולטני ממברנה (עיכוב של איגוד פלומאזניל [3H]). היתרון העיקרי של שיטה זו הוא כי החלטה מהירה ויעילה של אהדה המתחם מחייב על הקולטן עניין מספק את הקולטן של עניין.
מחקרים פונקציונלי חיוניים כדי להעריך את פעילות פונקציונלית של תרכובות, להציע הסבר פיזיולוגי ותרופתי של המנגנונים נגרם על-ידי הכריכה של תרכובות הקולטנים. . היום, זה מוכרת היטב כי פונקציונלית קולטני GABAA הם תוצאה של ההרכבה של חמישה subunits סביב ציר של pseudosymmetry שהוקמה על ידי נקבובית יונית תוצאת מההרכבה חמש subunits זהים. רוב קולטני GABAA מורכבים של שניים או יותר subunits שונים. הקולטן נכשלים GABAA , למשל, מורכבת subunits α1, β2 γ2 ב סטויכיומטריה של 2, 2, ו-1 בהתאמה5,6. שיחזור מערכת המחשב המארח כמו צפרדע רפואית oocytes או תאים HEK293 מציעה את האפשרות במהירות לחקור את מאפייני קולטני תרופתי.
המאפיינים תרופתי של תרכובות נידונות ואז עם הקלטות חוץ-תאי המוח פרוסות7. שיטה זו מאפשר חקירה של ההשפעה של תרכובות על עצבית והוא מספק דרך יעילה כדי לאשר את ההשפעות פונקציונלי של תרכובות נחוש במערכות heterologous ביטוי ברמה של רצפטורים מקורי הכולל סביבת עצביים. GABAergic עצבית יכולה גם להיות מוערך ברמה המולקולרית על ידי מדידת ההשפעות של תרכובות על זרמי postsynaptic מעכבות (IPSCs)8. אבל הפרוטוקול המשמש כאן, המבוסס על הקלטות מלחציים תיקון שלם-תא פרוסות המוח הוא משוכלל יותר ותשואות של תפוקה נמוכה יותר.
לבסוף, היתרונות והחסרונות של ה במבחנה הקרנת אשד המשמש לצורך זיהוי ליגנדים α5β3γ2 סלקטיבית נדונים בפרספקטיבה של הטכניקות השונות והמגבלות מהותי שלהם. עבודה זו צריכה לספק מומחים שאינם מומחים בתחום של קולטני GABAA סקירה מועיל של השילוב בין גישות שונות במבחנה המשמש כדי להתמודד עם גילוי מאפננים החדש של תעלות יונים ממותגת ליגנד אלה.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;General equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 well cell harvester -(Filtermate 196)&amp;nbsp;</td><td>Packard</td><td></td><td>To filter membranes with bound radioligand</td></tr><tr><td>Microtiter plate liquid scintillation counter (Top Count NXT)</td><td>Packard</td><td></td><td>Microplate Scintillation and Luminescence counter</td></tr><tr><td>Vial liquid scintillation counter (Beta-Couter 2500 TR)</td><td>Packard</td><td></td><td>Vial Scintillation and Luminescence counter</td></tr><tr><td>Liquid&amp;nbsp; handler (Biomek 2000)</td><td>Beckman coulter</td><td></td><td>To prepare compound dilutions</td></tr><tr><td>Vortex (Vortex Genie 2)</td><td>Scientific industries Inc.</td><td></td><td>To mix compound stock solutions</td></tr><tr><td>Tissue homogenizer (Polytron PT1200E)</td><td>Kinematica AG</td><td></td><td>To resuspend the membrane preparations</td></tr><tr><td>XLfit5 software</td><td>Microsoft Excel&lt;br/&gt; &amp;nbsp;add-on by IDBS</td><td></td><td>Curve fitting software</td></tr><tr><td>Smart Pull</td><td>UniPix</td><td>-</td><td>Electrode Puller</td></tr><tr><td>RoboInject</td><td>MultiChannel Systems</td><td>-</td><td>Automated Injection (Xenopus Oocytes)</td></tr><tr><td>HiClamp</td><td>MultiChannel Systems</td><td>-</td><td>Automated Voltage Clamp (&lt;em&gt;Xenopus&lt;/em&gt; Ooocytes)</td></tr><tr><td>DataMining</td><td>MultiChannel Systems</td><td>-</td><td>Data Analysis Software</td></tr><tr><td>DataMerger</td><td>MultiChannel Systems</td><td>-</td><td>Data Processing Software</td></tr><tr><td>Digidata 1550</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Low noise data acquisition system</td></tr><tr><td>CyberAmp 380 or equivalent</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>Programmable Signal Conditioner</td></tr><tr><td>pClamp program suite</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Software for data acquisition and analysis software</td></tr><tr><td>Antivibraton table&amp;nbsp;</td><td>TMC</td><td></td><td>To avoid microelectrode vibrations&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Patchstar Micromanipulators</td><td>Scientifica</td><td></td><td>To accurately position microelectrodes in brain slices</td></tr><tr><td>Faraday Cage&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>To isolate recordings from noise</td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>Campden Instruments LTD&amp;nbsp;</td><td></td><td>To prepare brain slices</td></tr><tr><td>Borosilicate glass micropipette&amp;nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>GC150TF-10</td><td>To record extracellular potentials in brain slices</td></tr><tr><td>Twisted pair, platinum iridium wires stimulation electrode</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>To stimulate the brain slices with current</td></tr><tr><td>Stimulus generator for current and voltage driven stimulation</td><td>MultiChannel Systems</td><td>STG4000</td><td>Delivers the current to the stimulation electrode</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Plasticware&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtiter plate round bottom</td><td>Corning</td><td>#3365</td><td>Used for the binding assay</td></tr><tr><td>GF/C glassfibre filter-bottom 96-well microplate with 1.2 &amp;micro;m poresize, for cell harvesting assays using a vacuum manifoldwell filter&amp;nbsp;</td><td>Packard&amp;nbsp;</td><td>#6005174</td><td>used for the binding assay</td></tr><tr><td>50 mL Tubes</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>#352070</td><td>used for the binding assay</td></tr><tr><td>Safe-lock tubes 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>#0030 120086</td><td>used for the binding assay</td></tr><tr><td>Safe-lock tubes 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>#0030 120094</td><td>used for the binding assay</td></tr><tr><td>Shipping tubes 180 mL&amp;nbsp;</td><td>Semadeni Europe AG&amp;nbsp;</td><td>#3722</td><td>used for the binding assay</td></tr><tr><td>Pony vial Polyethylene 6 mL&amp;nbsp;</td><td>Perkin Elmer&amp;nbsp;</td><td>#6013329</td><td>used for the binding assay</td></tr><tr><td>Top Seal&amp;nbsp;</td><td>Perkin Elmer&amp;nbsp;</td><td>#60051859</td><td>used for the binding assay</td></tr><tr><td>Spinner Flask</td><td>Bellco</td><td>BELLCO # 1965-00100</td><td>Spinner Flask</td></tr><tr><td>96&amp;nbsp; Well Plate (Conical)</td><td>Thermo Scientific Milian</td><td>56368</td><td>Injection plate for the oocytes</td></tr><tr><td>96&amp;nbsp; Well Plate (Flat bottom)</td><td>Corning (Vitaris Switzerland)</td><td>3364-cor</td><td>Compound Plate for the HiClamp</td></tr><tr><td>Glass capillary&amp;nbsp;</td><td>Hilgenberg (Germany)</td><td>-</td><td>borosilicate glass 1.2 O.D. 0.76 I.D. with filament</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;RNA preparation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ambion mMessage mMachine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>for the &lt;em&gt;in vitro&lt;/em&gt; synthesis</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Assay buffer: KCl 5 mM; CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 1.25 mM; MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 1.25 mM; NaCl 120 mM; Tris 15 mM pH adjust with HCl to 7.4; store up to 3 months at 4 &amp;deg;C.</td><td></td><td></td><td>Used for binding assay</td></tr><tr><td>Washing buffer: Tris 50 mM -HCl pH 7.4; store at 4 &amp;deg;C.</td><td></td><td></td><td>Used for binding assay</td></tr><tr><td>Stock solution of test compounds 10 mM in DMSO</td><td></td><td></td><td>Used for binding assay</td></tr><tr><td>Flumazenil (RO0151788) 10 mM in DMSO</td><td></td><td></td><td>Used for binding assay</td></tr><tr><td>Diazepam 4 mM in DMSO</td><td></td><td></td><td>Used for binding assay</td></tr><tr><td>[&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H]-Flumazenil 60-85 Ci/mmol in Ethanol; store at -20 &amp;deg;C</td><td></td><td></td><td>Used for binding assay</td></tr><tr><td>Microscint 40&amp;nbsp;</td><td>Packard&amp;nbsp;</td><td>#6013641</td><td>Used for binding assay</td></tr><tr><td>Ultima Gold&amp;nbsp;</td><td>Perkin Elmer&amp;nbsp;</td><td>#6013329</td><td>Used for binding assay</td></tr><tr><td>MS-222</td><td>Sigma</td><td>Sigma # A5040</td><td>MS-222</td></tr><tr><td>AB/AM</td><td>Sigma</td><td>Sigma # A5955</td><td>antibiotics / antimycotics</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Sigma</td><td>Sigma # C1030</td><td>Collagenase Type I</td></tr><tr><td>Rnase</td><td>Sigma</td><td>Sigma # R2020-250 mL</td><td>RNaseZAP</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>Qiagen # 12362</td><td></td></tr><tr><td>Salts for artificial cerebrospinal fluid (NaCl, KCl, etc.)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Membranes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frozen membrane preparations from transient or stably transfected HEK293 overexpressing different human GABA&lt;sub&gt;A&lt;/sub&gt; receptor subtypes: &amp;alpha;1&amp;beta;3&amp;gamma;2, &amp;alpha;2&amp;beta;3&amp;gamma;2, &amp;alpha;3&amp;beta;3&amp;gamma;2, &amp;alpha;5&amp;beta;3&amp;gamma;2. See Ballard &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; 2009 for detailed methods.</td><td></td><td></td><td>Used for binding assay</td></tr></tbody></table>

methods for the discovery of novel compounds modulating a gamma-aminobutyric acid receptor type a neurotransmission

זה מציג כתב יד פרוטוקול צעד אחר צעד לסינון תרכובות-גמא-aminobutyric חומצה סוג של קולטנים (GABAA) והשימוש בה לקראת הזיהוי של הרומן מולקולות פעילים מבחני פרה מ רקומביננטי במבחנה הקולטן והשפעותיהם תרופתי-קולטנים יליד פרוסות המוח מכרסמים. עבור תרכובות מחייב באתר בנזודיאזפינים של הקולטן, הצעד הראשון הוא להגדיר מסך ראשי המורכב בפיתוח מבחני הכריכה radioligand על קרום התא לבטא את תת-סוגי GABAA מז'ור. לאחר מכן, תוך ניצול של הביטוי heterologous של קולטני GABAA מכרסמים ואנושי oocytes צפרדע רפואית או תאים HEK 293, זה אפשרי לחקור, במבחני אלקטרופיזיולוגיות, המאפיינים הפיזיולוגיים של הקולטן שונים תת והמאפיינים תרופתי של תרכובות שזוהה. מערכת oocyte צפרדע רפואית , יוצגו כאן, החל הבידוד של oocytes את, microinjection שלהם עם mRNAs שונים, עד האפיון תרופתי באמצעות מלחציים שני-אלקטרודה מתח. לבסוף, הקלטות שנערכו פרוסות המוח מכרסמים יתוארו המשמשים פיזיולוגיים כמבחן משני כדי להעריך את הפעילות של מולקולות ב שלהם יליד קולטנים עצביים במעגל מוגדרים היטב. הקלטות חוץ-תאית באמצעות תגובות האוכלוסייה של נוירונים מרובים מודגמות יחד עם הבקשה סמים.

Watch this Scientific Journal Video about Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission at JoVE.com

Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לגלות תרכובות פעיל קולטני GABAA , מן הכריכה פיזיולוגיה, פרמקולוגיה.

שיטות הגילוי של תרכובות הרומן להתכוונן קולטן גאמא אמינו בוטירית הקלד עצבית

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

methods-for-discovery-novel-compounds-modulating-gamma-aminobutyric

Universidad de Cartagena UDEC

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Neuroscience

Unit 1

Anxiolytics, Sedatives and Hypnotics

SCIENTISTS IN ACTION

13.5K Views.  Roche Innovation Center Basel. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לגלות תרכובות פעיל קולטני GABAA , מן הכריכה פיזיולוגיה, פרמקולוגיה.

Video: Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation של נוירונים בין פרוסות המוח מכרסמים לחקר הילוכים Synaptic ותמונה מסופי Presynaptic

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

GABA-activated Single-channel and Tonic Currents in Rat Brain Slices

The GABAA channels are present in all neurons and are located both at synapses and outside of synapses where they generate phasic and tonic currents, respectively 4,5,6,7 The GABAA channel is a pentameric GABA-gated chloride channel. The channel subunits are grouped into 8 families (&alpha;1-6, &beta;1-3, &gamma;1-3, &delta;, &#949;, &theta;, &pi; and &rho;). Two alphas, two betas and one 3rd subunit form the functional channel 8. By combining studies of sub-type specific GABA-activated single-channel molecules with studies including all populations of GABAA channels in the neuron it becomes possible to understand the basic mechanism of neuronal inhibition and how it is modulated by pharmacological agents.
We use the patch-clamp technique 9,10 to study the functional properties of the GABAA channels in alive neurons in hippocampal brain slices and record the single-channel and whole-cell currents. We further examine how the channels are affected by different GABA concentrations, other drugs and intra and extracellular factors. For detailed theoretical and practical description of the patch-clamp method please see The Single-Channel Recordings edited by B Sakman and E Neher 10.

We use the patch-clamp technique to measure GABA-activated single-channel currents (GABAA channels, GABAA receptors) and the synaptic and tonic currents they generate in neurons. Activation of the channels decreases neuronal excitability in health and disease 1,2,3,4.

GABA המופעל זרמים ערוץ בודד וטוניק פרוסות המוח עכברוש

The GABAA channels are present in all neurons and are located both at synapses and outside of synapses where they generate phasic and tonic currents, ...

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. Currently, the characterization of novel drugs towards their interactions with &#946;-arrestins and other cytosolic proteins is extremely valuable in the field of GPCR drug discovery particularly during the study of GPCR biased agonism. Here, we show the application of a novel structural complementation assay to accurately monitor receptor-&#946;-arrestin interactions in real time living systems. This method is simple, accurate and can be easily extended to any GPCR of interest and also it has the advantage that it overcomes unspecific interactions due to the presence of a low expression promoter present in each vector system. This structural complementation assay provides key features that allow an accurate and precise monitoring of receptor-&#946;-arrestin interactions, making it suitable in the study of biased agonism of any GPCR system as well as GPCR c-terminus &#8216;phosphorylation codes&#8217; written by different GPCR-kinases (GRKs) and post-translational modifications of arrestins that stabilize or destabilize the receptor-&#946;-arrestin complex.

GPCR-&#946;-arrestin interactions are an emerging field in GPCR drug discovery. Accurate, precise and easy to set up methods are necessary to monitor such interactions in living systems. We show a structural complementation assay to monitor GPCR-&#946;-arrestin interactions in real time living cells, and it can be extended to any GPCR.

מעקב GPCR-β-arrestin1/2 אינטראקציות בזמן אמת מערכות חיים כדי להאיץ את גילוי הסמים

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...

Biochemistry

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

מיקרו-Iontophoresis מהיר של גלוטמט וגאבא: כלי שימושי לחקירת האינטגרציה סינפטית

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Using an &#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell surface mobility1-7. To study receptor cell surface localization and endocytosis, the technique described here combines the use of fluorescent &#945;-bungarotoxin with cells expressing constructs containing an &#945;-bungarotoxin (Bgt) binding site (BBS). The BBS (WRYYESSLEPYPD) is based on the &#945; subunit of the muscle nicotinic acetylcholine receptor, which binds Bgt with high affinity8,9. Incorporation of the BBS site allows surface localization and measurements of receptor insertion or removal with application of exogenous fluorescent Bgt, as previously described in the tracking of GABAA and metabotropic GABAB receptors2,10. In addition to the BBS site, we inserted a pH-sensitive GFP (pHGFP11) between amino acids 4 and 5 of the mature GABAAR subunit by standard molecular biology and PCR cloning strategies (see Figure 1)12. The BBS is 3&#39; of the pH-sensitive GFP reporter, separated by a 13-amino acid alanine/proline linker. For trafficking studies described in this publication that are based on fixed samples, the pHGFP serves as a reporter of total tagged GABAAR subunit protein levels, allowing normalization of the Bgt labeled receptor population to total receptor population. This minimizes cell to cell Bgt staining signal variability resulting from higher or lower baseline expression of the tagged GABAAR subunits. Furthermore the pHGFP tag enables easy identification of construct expressing cells for live or fixed imaging experiments.

Here we demonstrate the use of fluorescent Alexa dye coupled to &#945;-bungarotoxin to measure GABA A receptor surface localization and endocytosis in hippocampal neurons. Through the use of constructs bearing a short extracellular tag that binds &#945;-bungarotoxin, analysis of plasma membrane protein endocytic trafficking can be achieved.

שימוש בתג אתר איגוד α-bungarotoxin ללמוד GABA קולטן ממברנה לוקליזציה וסחר

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell ...

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA (&#947;-aminobutyric acid) is the predominant inhibitory neurotransmitter in the brain. It is released from the presynaptic terminals of inhibitory neurons within highly specialized intercellular junctions known as synapses, where it binds to GABAA receptors (GABAARs) present at the plasma membrane of the synapse-receiving, postsynaptic neurons. Activation of these GABA-gated ion channels leads to influx of chloride resulting in postsynaptic potential changes that decrease the probability that these neurons will generate action potentials. 
During development, diverse types of inhibitory neurons with distinct morphological, electrophysiological and neurochemical characteristics have the ability to recognize their target neurons and form synapses which incorporate specific GABAARs subtypes. This principle of selective innervation of neuronal targets raises the question as to how the appropriate synaptic partners identify each other. 
To elucidate the underlying molecular mechanisms, a novel in vitro co-culture model system was established, in which medium spiny GABAergic neurons, a highly homogenous population of neurons isolated from the embryonic striatum, were cultured with stably transfected HEK293 cell lines that express different GABAAR subtypes. Synapses form rapidly, efficiently and selectively in this system, and are easily accessible for quantification. Our results indicate that various GABAAR subtypes differ in their ability to promote synapse formation, suggesting that this reduced in vitro model system can be used to reproduce, at least in part, the in vivo conditions required for the recognition of the appropriate synaptic partners and formation of specific synapses. Here the protocols for culturing the medium spiny neurons and generating HEK293 cells lines expressing GABAARs are first described, followed by detailed instructions on how to combine these two cell types in co-culture and analyze the formation of synaptic contacts.

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

The molecular mechanisms that co-ordinate the formation of inhibitory GABAergic synapses during ontogeny are largely unknown. To study these processes,we have developed a co-culture model system which incorporates embryonic medium spiny GABAergic neurons cultured together with stably transfected human embryonic kidney 293 (HEK293) cells expressing functional GABAA receptors.

היווצרות הסינפסה מעכבת בשיתוף תרבות נוירונים דגם שילוב GABAergic בינוני קוצניים וHEK293 תאים ביציבות להביע GABA<sub&gt;</sub&gt; רצפטורים

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices

Pharmacological administration is commonly used when conducting whole-cell patch-clamp recording in brain slices. One of the best methods of drug application during electrophysiological recording is the puff technique, which can be used to study the effect of pharmacological reagents on neuronal activities in brain slices. The greatest advantage of puff application is that the drug concentration around the recording site increases rapidly, thus preventing desensitization of membrane receptors. Successful use of puff application involves careful attention to the following elements: the concentration of the drug, the parameters of the puff micropipette, the distance between the tip of a puff micropipette and the neuron recorded, and the duration and pressure driving the puff (pounds per square inch, psi). This article describes a step-by-step procedure for recording whole-cell currents induced by puffing gamma-aminobutyric acid (GABA) onto a neuron of a prefrontal cortical slice. Notably, the same procedure can be applied with minor modifications to other brain areas such as the hippocampus and the striatum, and to different preparations, such as cell cultures.

We describe the puff technique, by which pharmacological reagents can be administered during whole-cell patch-clamp recording, and highlight various aspects of the features that are crucial for its success.

זרמים שלמים-תא המושרה על ידי יישום עלים של GABA במוח פרוסות

Pharmacological administration is commonly used when conducting whole-cell patch-clamp recording in brain slices. One of the best methods of drug ...

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR malfunction, expressed as either over- or under-activity caused by mutations, altered expression, trafficking, or localization, can contribute to numerous diseases, especially in the central nervous system. Therefore, understanding the receptor&#39;s biology as well as facilitating the discovery of compounds and small molecules is crucial in ongoing efforts to combat neurological diseases. Current approaches to studying the receptor have limitations including low throughput, high cost, and the inability to study its functional abilities due to the necessary presence of channel blockers to prevent NMDAR-mediated excitotoxicity. Additionally, the existing assay systems are sensitive to stimulation by glutamate only and lack sensitivity to stimulation by glycine, the other co-ligand of the NMDAR. Here, we present the first plate-based assay with high-throughput power to study an NMDA receptor with sensitivity to both co-ligands, glutamate and D-serine/glycine. This approach allows the study of different NMDAR subunit compositions and allows functional studies of the receptor in glycine- and/or glutamate-sensitive modes. Additionally, the method does not require the presence of inhibitors during measurements. The effects of positive and negative allosteric modulators can be detected with this assay and the known pharmacology of NMDAR has been replicated in our system. This technique overcomes the limitations of existing methods and is cost-effective. We believe that this novel technique will accelerate the discovery of therapies for NMDAR-mediated pathologies.

The goal of this protocol is to facilitate the study of NMDA-receptors (NMDAR) at a larger scale and allow the examination of modulatory effects of small molecules and their therapeutic applications.

וזמינותו תפוקה גבוהה סידן השטף ללמוד קולטני NMDA עם רגישות גליצין/D-סרין, גלוטמט

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The method is based on the specific binding of a radioligand to its biological target. Therefore, frozen tissue sections are incubated with radioligand solution, and the binding to the target is subsequently localized by the detection of radioactive decay, for example, by using photosensitive film or phosphor imaging plates. Resulting digital autoradiograms display remarkable spatial resolution, which enables quantification and localization of radioligand binding in distinct anatomical structures. Moreover, quantification allows for the pharmacological characterization of ligand affinity by means of dissociation constants (Kd), inhibition constants (Ki) as well as the density of binding sites (Bmax) in selected tissues. Thus, the method provides information about both target localization and ligand selectivity. Here, the technique is exemplified with autoradiographic characterization of the high-affinity &#947;-hydroxybutyric acid (GHB) binding sites in mammalian brain tissue, with special emphasis on methodological considerations regarding the binding assay parameters, the choice of the radioligand and the detection method.

The method of autoradiography is routinely used to study binding of radioligands to tissue sections for determination of qualitative or quantitative pharmacology.

Autoradiography כאל שיטה פשוטה ורבת -עוצמה עבור ויזואליזציה ואפיון של מטרות תרופתי

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The ...

A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices

Monoamine neurotransmitters are associated with numerous neurologic and psychiatric ailments. Animal models of such conditions have shown alterations in monoamine neurotransmitter release and uptake dynamics. Technically complex methods such as electrophysiology, Fast Scan Cyclic Voltammetry (FSCV), imaging, in vivo&#160;microdialysis, optogenetics, or use of radioactivity are required to study monoamine function. The method presented here is an optimized two-step approach for detecting monoamine release in acute brain slices using a 48-well plate containing tissue holders for examining monoamine release, and high-performance liquid chromatography coupled with electrochemical detection (HPLC-ECD) for monoamine release measurement. Briefly, rat brain sections containing regions of interest, including prefrontal cortex, hippocampus, and dorsal striatum were obtained using a tissue slicer or vibratome. These regions of interest were dissected from the whole brain and incubated in an oxygenated physiological buffer. Viability was examined throughout the experimental time course, by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. The acutely dissected brain regions were incubated in varying drug conditions that are known to induce monoamine release through the transporter (amphetamine) or through the activation of exocytotic vesicular release (KCl). After incubation, the released products in the supernatant were collected and analyzed through an HPLC-ECD system. Here, basal monoamine release is detected by HPLC from acute brain slices. This data supports previous in vivo and in vitro results showing that AMPH and KCl induce monoamine release. This method is particularly useful for studying mechanisms associated with monoamine transporter-dependent release and provides an opportunity to screen compounds affecting monoamine release in a rapid and low-cost manner.

This method introduces a simple technique for the detection of endogenous monoamine release using acute brain slices. The setup uses a 48-well plate containing a tissue holder for monoamine release. Released monoamine is analyzed by HPLC coupled with electrochemical detection. Additionally, this technique provides a screening method for drug discovery.

בסיס בסיס צלחת למדידת שחרור מונואמין אנדוגני בפרוסות מוח חריפות

Monoamine neurotransmitters are associated with numerous neurologic and psychiatric ailments. Animal models of such conditions have shown alterations in ...