Name: isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system
Uploaded: 2018-02-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System at JoVE.com

B.S.S. NIH grant (R01 AI076457) ve Stony Brook Üniversitesi tarafından sağlanan fonlar tarafından desteklenmektedir. Z.Q. NIH tarafından desteklenmektedir (K12 GM102778) verin.

Tüm hayvan deneyleri Ulusal Sağlık Enstitüsü kılavuzlarınıza uygun olarak yapılan ve Stony Brook Üniversitesi Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış.
Not: tüm onayları yordamları gerçekleştirmeden önce sahip olduğunuzdan emin olun.
1. çözüm hazırlık
<ol><li>
HGPG (HEPES, L-glutamine, penisilin/streptomisin ve viomisin), 100 ×
	<ol>
<li>14.6 g L-glutamin (200 mM son), 1 × 10 59.6 g HEPES (500 mM son), mix6 U penisilin (2.000 U/mL son), 1 g streptomisin (2 mg/mL son) ve 2.5 mg gentamisin (5 µg/mL son). RPMI ekleyin 1640-500 mL. PH 7.5 NaOH kullanarak için ayarlamak (önce ayarlama, arabellek sarı/pH yaklaşık 6.0 ile turuncu). Filtre sterilize 0,45 µm filtre kullanarak. Aliquot ve mağaza-20 ° c ilâ 1 yıl veya 4 ° c ilâ 1 ay için.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bikarbonat HEPES tampon, 10 x
	<ol>
<li>
23,8 g HEPES (100 mM son), 21 g NaHCO3 (250 mM son) mix ve 1000 mL su ekleyin. 7,2 pH HCl. filtresiyle ayarlamak 0,45 mikron filtre sterilize. Oda sıcaklığında saklayın. PH zaman içinde değişir. PH düzenli olarak yeniden ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hasat medya (~ 1 şişe/2 fareler)
	<ol>
<li>500 mL RPMI 1640, 25 mL ısı inaktive fetal sığır serum (% 5) son ve 5 mL 100 × HGPG ekleyin. 6 ay 4 ° C'de depolayın</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dithioerythritol (DTE) çözüm (40 mL/küçük bağırsak)
	<ol>
<li>Mix 50 mL 10 × Hanks dengeli tuz solüsyonu, Ca2+- ve Mg2+-özgür, 50 mL 10 × bikarbonat HEPES tampon ve 50 mL ısı inaktive fetal sığır serum (% 10 final). 350 mL H2O ve 15,4 mg dithioerythritol/100 mL (1 mM son) ekleyin. Bu taze kullanmadan önce hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) çözüm (50 mL/küçük bağırsak)
	<ol>
<li>Mix 50 mL 10 × Hanks dengeli tuz solüsyonu, Ca2+- ve Mg2+-5 mL 100 × HGPG ile ücretsiz. 445 mL H2O. eklemek 260 µL 0,5 M EDTA ekleyin/100 mL (1.3 mM son). Bu taze kullanmadan önce hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Collagenase çözüm (30 mL/LP)
	<ol>
<li>500 mL RPMI, 50 mL FBS ekleyin (% 10 FBS final), 5 mL 100 × HPGP, 1 mL 0.5 M MgCl2 (1 mM son) ve 1 mL 0.5 M CaCl2 (1 mM son). Tip ı (100 U/mL final), collagenase ekleyin. Bu taze kullanmadan önce hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Yoğunluk gradient (DG) çözümleri
	<ol>
<li>90 mL DG hisse senedi çözüm karıştırarak 1 × DG hisse senedi çözüm hazırlamak ( Tablo malzemeleriçin başvurmak) 10 mL 10 × PBS ile. 4 ° C'de steril tutmak</li>
		<li>% 44 DG çözüm (8 mL/IEL, 8 mL/LP) 44 mL 1 × DG hisse senedi çözüm ve 56 mL RPMI 1640 karıştırarak hazırlayın. Bu taze kullanmadan önce hazırlayın.</li>
		<li>% 67 DG çözüm (5 mL/IEL, 5 mL/LP) 67 mL 1 × DG hisse senedi çözüm ve 33 mL RPMI 1640 karıştırarak hazırlayın. Bu taze kullanmadan önce hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Mezenterik lenf düğümleri, bağırsak, yalıtım ve Peyer's yamalar
<ol><li>Karbondioksit narkozu ve ikincil servikal çıkığı kullanarak fare ötenazi. Sırtında fareyi getirin ve % 70 etanol ile sprey. Cilt ve Periton boşluğu ortaya çıkarmak için karın duvarı açmak ve makas bir ensizyon yapmak için kullanın.</li>
	<li>Caecum bulun ve caecum yavaşça çekmeye forseps kullanın. Forseps dikkatli bir şekilde sağa, iki nokta üst üste ile uyumlu tüm MLN zinciri açığa bağırsağın taşımak için kullanın. Not:13zincir ve lenfatik drenaj bağırsaklar daha önce oldu Mezenterik lenf düğümlerinin bir harita tasvir.</li>
	<li>Zincirdeki en yakın çekum için bulunan alt düğümü tanımlamak. Forseps kümesi bıçaklanmasından/fat etrafında kavramak ve yavaşça MLN zinciri alttan yukarı FAT'tan başka bir set Forseps ile lenf nodu çevresinde tweezing tarafından kaldırmak için kullanın.</li>
	<li>MLN zinciri hasat medya ile nemlendirilmiş bir kağıt havlu üzerinde yatıyordu. Zinciri kağıt kule üzerinde haddeleme ve forseps iki kümesini içeren yağ çekme bıçaklanmasından/yağ çıkarmak. Yer soğuk hasat medya daha sonra izolasyon adımlar için MLN. Not: (i) doğrudan düğümleri kullanımı önerilmez. Bunun yerine, bıçaklanmasından/fat çevrelerindeki kavramak. (ii) bu kadar bıçaklanmasından/yağ hücre canlılık geliştirmek için mümkün olduğunca çıkarmak için önemlidir.</li>
	<li>İnce bağırsak Pilor sfinkter altındaki ve üstündeki makas kullanarak çekum kesti. Bağırsak yavaş yavaş ileum için ekli bıçaklanmasından/fat forseps başka bir set kullanarak kaldırma sırasında bir forseps kümesi kullanarak oniki parmak bağırsağı çekin.</li>
	<li>Bağırsak hasat medya ile nemlendirilmiş bir kağıt havlu yerleştirin ve kalan bıçaklanmasından/yağ kapalı Forseps ile iki alay. Not: (i) optimum hücre verim ve canlılık için mümkün olduğu kadar bıçaklanmasından/fat kaldırdığınızdan emin olun. (ii) bu ve aşağıdaki adımları düzenli aralıklarla hasat medya uygulayarak nemlendirilmiş bağırsak tutun.</li>
	<li>Peyer's yamalar yanında izale onları--dan bağırsak eğri makas ile toplamak. Bir diseksiyon kapsamı veya Büyüteç (yeni başlayanlar); gerekirse kullanın çoğu Peyer's yamalar eğitimli gözle görünür olmalıdır. 5-11 (tipik) Peyer's yamalar bağırsağın toplamak. Daha sonra izolasyon adımlar için soğuk hasat medyada yer Peyer'ın yamalar. Not: Peyer's yamalar küçük, öncelikle yuvarlak çıkıntı yolun bıçaklanmasından ekin karşısında dış bağırsak duvarında.</li>
	<li>Fekal içerik ve mukus sınırdışı duodenum ileum doğru forseps ve yavaşça slayttan düz tarafını kullanıyorsunuz. Mukus çoğunu kaldırmak için bir kez yineleyin. Not: Eksik mukus kaldırılması hücre canlılığı azaltmak ve verim. Yine de, yavaşça villus sıyırma veya Membran zarar önlemek için bağırsak slayt emin olun.</li>
	<li>Bir noktada bir künt ucuyla iyi makas kullanın, künt sonuna bağırsak yerleştirin ve bağırsak ileum için boyuna duodenum arasında açık kesti. Yan yana açılan bağırsak ~ 2 cm parçalar halinde kesin. Bağırsak adet 25 mL soğuk hasat medya daha sonra izolasyon adımlar için bir 50 mL konik boru yerleştirin. Not: medya ile nemlendirilmiş makas tutma zahmetsizce bağırsak slayt yardımcı olacaktır.</li>
</ol>3. yalıtım lenfositleri endüktif sitelerden
<ol><li>Lenfositler MLN dan yavaşça 3 mL şırınga pistonu kullanarak 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla dissociating tarafından izole et. Hücre süzgeç 5 mL soğuk hasat medya ile yıkayın.</li>
	<li>Pelet MLN-hücreleri 400 × g 4 ° C'de 5 min için de centrifuging tarafından Hücre Pelet 1 mL soğuk hasat medyada resuspend. Trypan mavi dışlama kullanarak canlı hücreleri hesaplama. Not: kırmızı kan hücre lizis arabellek kanama kaldırma işlemi sırasında oluşursa, kırmızı kan hücreleri kaldırmak için kullanılabilir.</li>
	<li>Lenfositler Peyer's yamalar dan Peyer's yamalar 37 ° C ve 30 dk için 220 devir/dakika 5 mL prewarmed collagenase solüsyon içeren 15 mL konik tüp içinde kuluçka tarafından izole et.</li>
	<li>Girdap 15 s maksimum ayar ve filtre doku ve süpernatant 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla 50 mL konik tüp içine sindirmek. Yavaşça bir 3-mL şırınga pistonu kullanarak kalan doku parçaları ayırmak ve hücre süzgeç 5 mL soğuk hasat medya ile yıkayın.</li>
	<li>400 × g 4 ° C'de 5 min için de centrifuging tarafından Peyer's yama hücreleri cips ve hücre Pelet 1 mL soğuk hasat medyada resuspend. Trypan mavi dışlama kullanarak canlı hücreleri hesaplama. Not: yamalar yalıtım Peyer bazı bulaşıcı lamina propria lenfositler ve intraepitelyal lenfositlerin olabilir.</li>
</ol>4. ince bağırsak üzerinden intraepitelyal lenfositlerin yalıtım
<ol><li>Tüpü 10 kat ters çevirme, bağırsak adet yerleşmek izin ve süpernatant dökme ince bağırsak parçalar üç kez 25 mL soğuk hasat medya ile yıkayın. Not: Doku parçaları kolayca tüp altına yerleşmek. Eğer onlar yapmak değil, çok fazla bıçaklanmasından/fat bağlı kalır veya bunların bir hava kabarcığı ile ilişkili olduğu bir gösterge 's.</li>
	<li>Bağırsak parçaları içeren 50mL konik tüp 20 mL prewarmed DTE çözeltisi ekleyin ve bir 50 mL siliconized Erlenmeyer bir heyecan-bar içeren şişesi için transfer. 37 ° C'de karıştırın ve bir manyetik karıştırıcı 20 dakika süreyle üzerinde 220 devir/dakika büyük bir mıknatıs balonun dışarıdan heyecan-bar tutun ve doku ve çözüm 50 mL konik tüp geri aktarmak için kullanın.</li>
	<li>Girdap tüp için 10 s. Transfer süpernatant bir yeni 50 mL konik tüp içine orijinal tüpte doku parçaları tutmak için dikkatli olmak bir 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla ayarlama maksimumda. Süpernatant; atmayın süpernatant intraepitelyal lenfosit içerir. Pelet hücreleri 400 × g 4 ° C'de 5 min için de centrifuging tarafından Hücre Pelet 10 mL soğuk hasat medyada resuspend ve buz üzerinde saklayabilirsiniz.</li>
	<li>Bağırsak parçaları içeren 50mL konik tüp 20 mL prewarmed DTE çözeltisi ekleyin ve geri 50 mL siliconized Erlenmeyer bir heyecan-bar içeren balon için transfer. 37 ° C'de karıştırın ve bir manyetik karıştırıcı 20 dakika süreyle üzerinde 220 devir/dakika büyük bir mıknatıs balonun dışarıdan heyecan-bar tutun ve doku ve çözüm 50 mL konik tüp geri aktarmak için kullanın. Not: DTE intraepitelyal lenfositlerin zenginleştiren bir indirgeyici var.</li>
	<li>Girdap tüp için 10 s. Transfer süpernatant 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla süpernatant ilk DTE tedavi (Kimden adım 4.3) hücrelerden içeren önceki tüp içine ayarlama maksimumda. Not: Kalan bağırsak adet lenfositler lamina propria dan izole etmek için kullanılır. Kalite kontrol: Doku bir parça kaldırıldı ve histolojik olarak epitel hücresi varsa ve membran sağlamdır emin olmak için kontrol ettim.</li>
	<li>Pelet hücreleri süpernatant 400 × g 4 ° C'de 5 min için de centrifuging tarafından Hücre Pelet 8 mL % 44 DG çözeltisi (RT) oda sıcaklığında resuspend.</li>
	<li>Transfer 8 mL % 44 DG çözüm/hücre süspansiyon 17 mm ø x 100 içine mm 14-mL polipropilen yuvarlak alt tüp tarzı. 5 mL RT % 67 DG çözeltisi ile altına koymak. 1600 × g 20 dk, RT için de freni kullanmadan santrifüj kapasitesi. Not: Tüpler hücreleri tüp duvarlara yapışmasını önlemek için sığır serum ile pretreated.</li>
	<li>Not hücrelerin bir grup (buffy ceket) %44 67 arayüzü oluşturmak, geçişin en üstündeki mukoid bir filmde ölü hücreleri ve bazı epitel hücreleri vardır ve kırmızı kan hücreleri içinde Pelet vardır. Degradeye ~ 2 cm arabiriminin üst tabakası tarafından vakum aspirasyon kaldırın. Pasteur pipet buffy mantoyu arayüz hasat ve bir 50 mL konik tüp 40 mL soğuk hasat ortamı içeren aktarmak için kullanın.</li>
	<li>Pelet hücreleri 400 × g 4 ° C'de 5 min için de centrifuging tarafından Hücre Pelet 1 mL soğuk hasat medyada resuspend. Trypan mavi dışlama kullanarak canlı hücreleri hesaplama.</li>
</ol>5. yalıtım üzerinden ince bağırsak Lamina Propria lenfositlerin
<ol><li>Epitel hücreleri kalan bağırsak parçayı içeren şişeye 25 mL prewarmed EDTA çözeltisi ekleyerek bağırsak doku parçaları kaldırın. Heyecan şişesi 37 ° C ve üzerinde 30 dakika süreyle bir manyetik karıştırıcı 220 devir/dakika, heyecan-bar tutun ve dikkatle süpernatant balonun içinde bağırsak adet tutarken atmak için balonun dışarıdan büyük bir mıknatıs kullanın. Not: kalsiyum-bağımlı kavşak hedefler ve dekolmanı bağırsak epitel hücrelerinin bir kalsiyum şelatör EDTA (i) dir. (ii) süpernatant bulutlu olmalı ve onların toplama istenirse IEC yalıtmak için kullanılabilir.</li>
	<li>5.1 arasındaki adımları yineleyin. Not: Süpernatant bu kuluçka takip daha az bulutlu olması gerekir. Kalite kontrol: Doku bir parça kaldırıldı ve histolojik olarak bağırsak epitel hücreleri kaldırıldı ve membran sağlamdır emin olmak için kontrol ettim. Bir örnek üzerinden süpernatant Ayrıca onaylamak için Akış Sitometresi tarafından tespit edilebilir o lökosit (CD45+ hücreleri) yok.</li>
	<li>RT hasat Medya 50 mL şişe için ekleyin. Kısaca bir mıknatıs ile karıştırın. Yerleşmek ve dikkatle süpernatant atın bağırsak adet izin. Not: EDTA collagenase için collagenase işlevi önemlidir kalsiyum şelat tarafından inaktive gibi EDTA kaldırma collagenase sindirim önce bu adım sağlar.</li>
	<li>Şişesi için 30 mL prewarmed collagenase çözeltisi ekleyin ve bir manyetik karıştırıcı 45 dakika için üzerinde bağırsak adet 37 ° C ve 220 devir/dakika karıştırın.</li>
	<li>Transferi doku ve 50 mL konik tüp süpernatant 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla süzme yoluyla sindirmek. Yavaşça kalan doku adet filtreden püre için 3 mL şırınga pistonu kullanarak ayırmak. 10 mL soğuk hasat medya filtresiyle yıkayın.</li>
	<li>Pelet hücreleri 400 × g 4 ° C'de 5 min için de centrifuging tarafından Hücre Pelet 8 mL ortam sıcaklığı % 44 DG çözüm resuspend.</li>
	<li>Transfer 8 mL % 44 DG çözüm/hücre süspansiyon 17 mm ø x 100 içine mm 14-mL polipropilen yuvarlak alt tüp tarzı. 5 mL ortam sıcaklığı % 67 DG çözeltisi ile altına koymak. Oda sıcaklığında ve 1600 × g 20 dk için hiçbir fren degradeler santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Şişman katmanın üst tarafından vakum aspirasyon kaldırın. Buffy mantoyu arabirimi ve 40 mL soğuk hasat ortamı içeren bir 50 mL konik tüp aktarmak, hasat için bir Pasteur pipet kullanın.</li>
	<li>Pelet hücreleri 400 × g 4 ° C'de 5 min için de centrifuging tarafından Hücre Pelet 1 mL soğuk hasat medyada resuspend. Trypan mavi dışlama kullanarak canlı hücreleri hesaplama.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hooper, L. V., Macpherson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+adaptations+that+maintain+homeostasis+with+the+intestinal+microbiota.">Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota.</a> Nat Rev Immunol. 10 (3), 159-169 (2010).</li><li>Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminology:+nomenclature+of+mucosa-associated+lymphoid+tissue.">Terminology: nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue.</a> Mucosal Immunol. 1 (1), 31-37 (2008).</li><li>Lefrancois, L., Lycke, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+small+intestinal+intraepithelial+lymphocytes,+Peyer's+patch,+and+lamina+propria+cells.">Isolation of mouse small intestinal intraepithelial lymphocytes, Peyer's patch, and lamina propria cells.</a> Curr Protoc Immunol. , 19 (2001).</li><li>Sheridan, B. S., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+lymphocytes+from+small+intestine+tissues.">Isolation of mouse lymphocytes from small intestine tissues.</a> Curr Protoc Immunol. , 19 (2012).</li><li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+murine+small+intestine+leukocyte+isolation+for+global+immune+phenotype+analysis.">Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis.</a> J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).</li><li>Couter, C. J., Surana, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Flow+Cytometric+Characterization+of+Murine+Small+Intestinal+Lymphocytes.">Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes.</a> J Vis Exp. (111), (2016).</li><li>Koscso, B., Bogunovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+Purification+of+Mouse+Intestinal+Dendritic+Cell+and+Macrophage+Subsets+by+Flow+Cytometry.">Analysis and Purification of Mouse Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets by Flow Cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. 114, 11-14 (2016).</li><li>Goodman, T., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+gamma-delta+T-cell+receptor+on+intestinal+CD8++intraepithelial+lymphocytes.">Expression of the gamma-delta T-cell receptor on intestinal CD8+ intraepithelial lymphocytes.</a> Nature. 333 (6176), 855-858 (1988).</li><li>Huleatt, J. W., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta2+integrins+and+ICAM-1+are+involved+in+establishment+of+the+intestinal+mucosal+T+cell+compartment.">Beta2 integrins and ICAM-1 are involved in establishment of the intestinal mucosal T cell compartment.</a> Immunity. 5 (3), 263-273 (1996).</li><li>Sheridan, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gammadelta+T+cells+exhibit+multifunctional+and+protective+memory+in+intestinal+tissues.">gammadelta T cells exhibit multifunctional and protective memory in intestinal tissues.</a> Immunity. 39 (1), 184-195 (2013).</li><li>Sheridan, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+infection+drives+a+distinct+population+of+intestinal+resident+memory+CD8(+)+T+cells+with+enhanced+protective+function.">Oral infection drives a distinct population of intestinal resident memory CD8(+) T cells with enhanced protective function.</a> Immunity. 40 (5), 747-757 (2014).</li><li>Romagnoli, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+distinct+long-lived+memory+CD4+T+cells+in+intestinal+tissues+after+oral+Listeria+monocytogenes+infection.">Differentiation of distinct long-lived memory CD4 T cells in intestinal tissues after oral Listeria monocytogenes infection.</a> Mucosal Immunol. 10 (2), 520-530 (2017).</li><li>Houston, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymph+nodes+draining+the+small+intestine+and+colon+are+anatomically+separate+and+immunologically+distinct.">The lymph nodes draining the small intestine and colon are anatomically separate and immunologically distinct.</a> Mucosal Immunol. 9 (2), 468-478 (2016).</li><li>Lorenz, R. G., Newberry, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+lymphoid+follicles+can+function+as+sites+for+induction+of+mucosal+immune+responses.">Isolated lymphoid follicles can function as sites for induction of mucosal immune responses.</a> Ann N Y Acad Sci. 1029, 44-57 (2004).</li><li>Kim, S. K., Reed, D. S., Heath, W. R., Carbone, F., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+migration+of+CD8+T+cells+in+the+intestinal+mucosa.">Activation and migration of CD8 T cells in the intestinal mucosa.</a> J Immunol. 159 (9), 4295-4306 (1997).</li><li>Huleatt, J. W., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-driven+induction+of+CD11c+on+intestinal+intraepithelial+lymphocytes+and+CD8++T+cells+in+vivo.">Antigen-driven induction of CD11c on intestinal intraepithelial lymphocytes and CD8+ T cells in vivo.</a> J Immunol. 154 (11), 5684-5693 (1995).</li><li>Van Damme, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+agents+and+enzymes+used+for+the+extraction+of+gut+lymphocytes+influence+flow+cytometric+detection+of+T+cell+surface+markers.">Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers.</a> J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Detaylı bir protokol endüktif (milyon ve PP) Mukozal lenfosit gelen bağırsak yalıtım için sunulur ve efektör (LP ve IEL yuvası) siteleri. Protokol giriş (zaman) ve çıkış (canlılık ve verim) verimlilik ve sonuçları maksimize etmek için dengelemek için geliştirilmiştir. Protokol Ayrıca LP ve IEL bölmeleri arasında en az çapraz compartmental bulaşma sağlar.
Fare bağırsağı bağışıklık hücreleri yalıtım için birkaç protokol-si olmak be yayınlanan<sup class=...

Gastrointestinal (GI) sistem birçok kıvrımlar ve iç vücut ve dış çevre ayıran en büyük arabirimini gösterir çıkıntılar vardır. Bağırsak bağışıklık sistemi GI yolu bariyer fonksiyonu korumada önemli bir rol oynar. Sürekli diyet antijenleri, Komensal bakteriler ve patojenik mikroplar maruz. Bu nedenle, bu hızla enteropathogenic mikroplar1etkili bir bağışıklık yanıtı oluşturmak için kapasite koruyarak gıda antijenleri ve Komensal bakteriler için dayanıklı kalması gerekir. Bağırsak bağışıklık sisteminin anatomik olarak sunulması antijenleri bağırsak mukoza üzerinden taşıyan hücreler antijen tarafından saf lenfositler etkinleştirdiğiniz yere, endüktif ve nerede aktive lenfositler belirli sarfetmek efektör siteleri, bölünmüş olabilir efektör fonksiyonları2. Endüktif siteleri doğrudan eylem özel M hücreler ve bölgesel boşaltma Mezenterik lenf düğümleri (milyon) yoluyla intestinal Lümen anketler organize lenfoid yapı Peyer's yamalar (PP) oluşturmaktadır. Membran ve bağırsak epiteli, intraepitelyal lenfosit (IEL) içeren membran yer alan bir tek hücre katmanı altındaki bağ dokusu olan lamina propria (LP), efektör siteleri oluşur. Lenfositler enfeksiyonlar ve kanser karşı koruma aracılık ve immunopathology inflamatuar hastalıklarda da katkıda büyük oyuncular edinilmiş bağışıklığın vardır. Bu önemlidir ve bu farklı lenfosit çalışmaya son derece alakalı anatomik Mukozal bölmeleri için daha iyi indüksiyon ve efektör fonksiyonları anlıyorum.
Bağırsaklarda oluşan bağışıklık olaylar keşfetmek müfettişler sayısı hızlandırılması gibi nispeten basit ve Birleşik iletişim kuralı üzerinden bu bölmeleri lenfositlerin yalıtım için gereklidir. Birkaç araştırma grubu fare küçük bağırsak bölmeleri3,4,5,6,7 bağışıklık hücreleri izole için birkaç benzer işlemler paylaşır protokolleri yayınladık . Ancak, tek iletişim kuralı odak bağlı olarak aralarında birkaç teknik farklar vardır. Örneğin, LP üzerinden bağışıklık hücreleri izole odaklı, bir protokol hücre canlılığı, hücre yüzey marker ifade ve izole bağışıklık hücreleri5kompozisyon çeşitli Enzimatik sindirim etkisini inceliyor. Başka bir protokol için yalıtım lenfositler yoğunluğu Santrifüjü6olmadan hızlı ve tekrarlanabilir yöntemi vurgulamaktadır. Son olarak, belirli protokoller Ayrıca bağırsağın7farklı doku katmanlarından Mononükleer fagositler yalıtma amacıyla bulunmaktadır. Burada, ince bağırsak milyon, s, LP ve IEL kartı yuvası üzerinden lenfosit nüfusun sıralı yalıtım sağlayan son derece tekrarlanabilir bir protokol sunulmuştur.
Biz yüksek oranda saflaştırılmış örneğin alınma olasılığını büyük ölçüde kirletici bağırsak diğer bölmeleri üzerinden ücretsiz LP ve IEL bölmeleri izole odaklanır. Bu yaygın kullanılan iletişim kuralı üretir kabul edilebilir saat kısıtlamaları4,8,9,10,11,12içinde sonuna kadar saf ve uygun lenfositlerin yüksek bir verim. Bu iletişim kuralı da iyi niyetli bir fırsat bu ayrı bölmeleri lenfosit çalışma izin en az çapraz compartmental bulaşma ile LP ve IEL yuvası üzerinden lenfositlerin yalıtım sağlar. İzole lenfositler akış sitometrik çözümlemesi veya fonksiyonel analiz gibi daha fazla manipülasyonlar tabi. Bu iletişim kuralı başarıyla lenfositler yalıtım için fare ince bağırsak ve kolon Listeria Monositogenez, Salmonella typhimuriumve Yersinia pseudotuberculosis gibi bakteriyel enfeksiyonlar sırasında uygulanmış enfeksiyonlar ve kimyasal ve patojen bağlı kolit gibi inflamatuar koşulları. Bu iletişim kuralı, dendritik hücreler, makrofajlar, nötrofil ve monosit fare ince bağırsak ve kolon gibi doğuştan gelen bağışıklık hücreleri izole etmek için de kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine&amp;nbsp;</td><td>Sigma-aldrich</td><td>G3126-100G</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Life Technologies</td><td>15710-072</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>21870-076</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Life Technologies</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>10x Hanks&#039; balanced salt solution</td><td>Sigma-aldrich</td><td>H4641-500ML</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dithioerythritol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D9680-5G</td><td></td></tr><tr><td>0.5M EDTA, pH 8.0</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Calsium chloride hexahydrate</td><td>Sigma-aldrich</td><td>21108-500G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M2670-100G</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase, Type I</td><td>Life Technologies</td><td>17100-017</td><td></td></tr><tr><td>DG gradient stock solution (Percoll)&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>70-&amp;micro;m cell strainer&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td><td>Corning</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer flask&amp;nbsp;</td><td>Kimble</td><td>26500R-50mL</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stirrer</td><td>Thermo Fisher</td><td>50094596</td><td></td></tr><tr><td>Stir bar</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-512-148</td><td></td></tr></tbody></table>

isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system

Bağırsak bağışıklık sistemi etkili bağışıklık yanıtlarını enteropathogenic montaj sırasında hoşgörülü yanıt diyet antijenleri ve Komensal bakteriler oluşturarak gastrointestinal sistem bariyer fonksiyonu korumada önemli bir rol oynar mikroplar. Buna ek olarak, yerel bağırsak dokunulmazlık uzak ve sistemik bağışıklık üzerinde derin bir etkisi vardır açık hale gelmiştir. Bu nedenle, çalışma nasıl bir bağırsak bağışıklık yanıtı indüklenen ve immünolojik sonuç yanıtın ne önemlidir. Burada, detaylı bir protokol gut ilişkili lenfoid doku Peyer's yamalar ve boşaltma Mezenterik lenf düğümleri gibi ince bağırsak endüktif sitelerinden ve lamina propria gibi siteler efektör lenfositler yalıtım için açıklanan ve bağırsak epitel. Bu teknik en uygun saflık ve canlılığı ve kabul edilebilir zaman kısıtlamaları içinde en az çapraz compartmental bulaşma ile yalıtım lenfositler küçük bağırsak dokulara gelen çok sayıda sağlar. Lenfositler ve bağırsak dokularında diğer bağışıklık hücreleri izole etmek için teknik yeteneği gastrointestinal enfeksiyonlar, kanser ve inflamatuar hastalıklar bağışıklık yanıtlarını anlayış sağlar.

Protokol şematik gösterimi tasvir edilir (şekil 1). Lenfositler efektör siteleri ve bağırsak mukoza endüktif içinde belirgin bir biçimde düzenlenir. Peyer's yamalar (PP) ve Mezenterik lenf düğümleri (milyon) içerir lenfositler iyi organize edilmiş T-hücre ve B-hücre köklerinin, bağırsak epitel daha diffüz dağıtılır lenfosit içerir, ancak. Lamina propria (LP) havza dağıtılmış lenfositler ve izole lenfoid follikül (IIf) ve crypto...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System at JoVE.com

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Lenfositler fare küçük bağırsak bağışıklık sistemi yalıtma

Burada biz lenfositler gut ilişkili lenfoid doku Peyer's yamalar ve boşaltma Mezenterik lenf düğümleri de dahil olmak üzere İndüktif sitelerinden ve lamina propria dahil efektör mekanları ekran koruyucu yalıtım için detaylı bir protokol tanımlamak ve bağırsak epitel küçük bağırsak bağışıklık sisteminin.

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

isolating-lymphocytes-from-the-mouse-small-intestinal-immune-system

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

52.5K Görüntüleme.  Stony Brook University. Burada biz lenfositler gut ilişkili lenfoid doku Peyer's yamalar ve boşaltma Mezenterik lenf düğümleri de dahil olmak üzere İndüktif sitelerinden ve lamina propria dahil efektör mekanları ekran koruyucu yalıtım için detaylı bir protokol tanımlamak ve bağırsak epitel küçük bağırsak bağışıklık sisteminin.

Video: Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

CD4 İzolasyon Miltenyi MACS Arıtma Fare lenf düğümleri + T hücreleri

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Biyoloji

Unraveling Key Players of Humoral Immunity: Advanced and Optimized Lymphocyte Isolation Protocol from Murine Peyer's Patches

In the gut mucosa, immune cells constitute a unique immunological entity, which promotes immune tolerance while concurrently conferring immune defense against pathogens. It is well established that Peyer&#39;s patches (PPs) have an essential role in the mucosal immune network by hosting several effector T and B cell subsets. A certain fraction of these effector cells, follicular T helper (TFH) and germinal center (GC) B cells are professionalized in the regulation of humoral immunity. Hence, the characterization of these cell subsets within PPs in terms of their differentiation program and functional properties can provide important information about mucosal immunity. To this end, an easily applicable, efficient and reproducible method of lymphocyte isolation from PPs would be valuable to researchers. In this study, we aimed to generate an effective method to isolate lymphocytes from mouse PPs with high cell yield. Our approach revealed that initial tissue processing such as the use of digestive reagents and tissue agitation, as well as cell staining conditions and selection of antibody panels, have great influence on the quality and identity of the isolated lymphocytes and on experimental outcomes.
Here, we describe a protocol enabling researchers to efficiently isolate lymphocyte populations from PPs allowing reproducible flow cytometry-based assessment of T and B cell subsets primarily focusing on&#160;TFH and GC B cell subsets.

In this study, we present a novel and effective protocol for the isolation of lymphocytes from Peyer&#39;s Patches (PPs), which can be subsequently used for in vivo and in vitro functional assays as well as flow cytometric studies of follicular T helper and germinal center B cells.

Humoral bağışıklık çözülen anahtar oyuncular: gelişmiş ve lenfosit yalıtım antikorundan Peyer's yamalar iletişim kuralından en iyi duruma getirilmiş

In the gut mucosa, immune cells constitute a unique immunological entity, which promotes immune tolerance while concurrently conferring immune defense ...

Kanser Araştırmaları

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

Fare Barsak ayrı dendritik hücreler ve makrofajlar İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

Fare Genital Sistemlerinin Mukozanin gelen Lenfosit İzolasyonu

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Peyer's patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and homeostasis. Particulate antigens and microbes in the intestinal lumen are continuously sampled by PP M cells in the follicle-associated epithelium (FAE) and transported to an underlying network of dendritic cells (DCs), macrophages, and lymphocytes. In this article, we describe protocols in which murine PPs are (i) dissociated into single cell suspensions and subjected to flow cytometry and (ii) prepared for cryosectioning and immunostaining. For flow cytometry, PPs are mechanically dissociated and then filtered through 70 &mu;m membranes to generate single cell suspensions free of epithelial cells and large debris. Starting with 20-25 PPs (from four mice), this quick and reproducible method yields a population of &gt;2.5 x 106 cells with &gt;90% cell viability. For cryosectioning, freshly isolated PPs are immersed in Optimal Cutting Temperature (OCT) medium, snap-frozen in liquid nitrogen, and then sectioned using a cryomicrotome. Tissue sections (5-12 &mu;m) are air-dried, fixed with acetone or methanol, and then subjected to immunolabeling.

There is an increasing interest in understanding the immunological functions of specific subpopulations of cells in Peyer's patches (PPs), the primary inductive sites of gut-associated lymphoid tissues. Here we outline parallel protocols for preparing PP single cell preparations for flow cytometric analysis and PP cryosections for immunostaining.

Lenfositler ve mürin Peyer en Yamalar itibaren Dendritik Hücreler İzolasyon Ve immün

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both microbial and dietary. Given an increasing understanding that these luminal antigens help shape the immune response and that education of immune cells within the intestine is critical for a number of systemic diseases, there has been increased interest in characterizing the intestinal immune system. However, many published protocols are arduous and time-consuming. We present here a simplified protocol for the isolation of lymphocytes from the small-intestinal lamina propria, intraepithelial layer, and Peyer&#39;s patches that is rapid, reproducible, and does not require laborious Percoll gradients. Although the protocol focuses on the small intestine, it is also suitable for analysis of the colon. Moreover, we highlight some aspects that may need additional optimization depending on the specific scientific question. This approach results in the isolation of large numbers of viable lymphocytes that can subsequently be used for flow cytometric analysis or alternate means of characterization.

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

Fare Küçük Bağırsak Lenfositler izolasyonu ve Akım Sitometrisi Karakterizasyonu

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new transgenic reporter mouse model. We chose to visualize interleukin (IL) 22 gene expression because this cytokine has important activities in the intestine, where it contributes to repair tissues damaged by inflammation. Reporter systems offer considerable advantages over other methods of identifying products in vivo. In the case of IL-22, other studies had first isolated cells from tissues and then re-stimulated the cells in vitro. IL-22, which is normally secreted, was trapped inside cells using a drug, and intracellular staining was used to visualize it. This method identifies cells capable of producing IL-22, but it does not determine whether they were doing so in vivo. The reporter design includes inserting a gene for a fluorescent protein (tdTomato) into the IL-22 gene in such a way that the fluorescent protein cannot be secreted and therefore remains trapped inside the producing cells in vivo. Fluorescent producers can then be visualized in tissue sections or by ex vivo analysis through flow cytometry. The actual construction process for the reporter included recombineering a bacterial artificial chromosome that contained the IL-22 gene. This engineered chromosome was then introduced into the mouse genome. Homeostatic IL-22 reporter expression was observed in different mouse tissues, including the spleen, thymus, lymph nodes, Peyer&#39;s patch, and intestine, by flow cytometry analysis. Colitis was induced by T-cell (CD4+CD45RBhigh) transfer, and reporter expression was visualized. Positive T cells were first present in the mesenteric lymph nodes, and then they accumulated inside the lamina propria of the distal small intestine and colon tissues. The strategy using BACs gave good-fidelity reporter expression compared to IL-22 expression, and it is simpler than knock-in procedures.

We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.

Raportör fareler kullanılarak IL-22 eksprese eden lenfositlerin Görselleştirme

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous antigens and modulate responses to potent microbially derived immune stimuli. For this reason, the intestine is a major target site of immune dysregulation and inflammation in many diseases including but, not limited to inflammatory bowel diseases such as Crohn&#8217;s disease and ulcerative colitis, graft-versus-host disease (GVHD) after bone marrow transplantation (BMT), and many allergic and infectious conditions. Murine models of gastrointestinal inflammation and colitis are heavily used to study GI complications and to pre-clinically optimize strategies for prevention and treatment. Data gleaned from these models via isolation and phenotypic analysis of immune cells from the intestine is critical to further immune understanding that can be applied to ameliorate gastrointestinal and systemic inflammatory disorders. This report describes a highly effective protocol for the isolation of mononuclear cells (MNC) from the colon using a mixed silica-based density gradient interface. This method reproducibly isolates a significant number of viable leukocytes while minimizing contaminating debris, allowing subsequent immune phenotyping by flow cytometry or other methods.

The goal of this protocol is to isolate mononuclear cells that reside in the lamina propria of the colon by enzymatic digestion of the tissue using collagenase. This protocol allows for the efficient isolation of mononuclear cells resulting in a single cell suspension which in turn can be used for robust immunophenotyping.

Lamina Propria Mononükleer Hücrelerin Murine Kolondan Kollajenaz E Kullanarak İzolasyon

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate balance of mucosal homeostasis. These 3D, multi-cellular systems offer a reductionist model for addressing multi-factorial diseases and resolving technical difficulties that arise when studying rare cell types such as tissue-resident innate lymphoid cells (ILCs). This article describes a murine system that combines small intestine organoids and small intestine lamina propria derived helper-like type-1 ILCs (ILC1s), which can be readily extended to other ILC or immune populations. ILCs are a tissue-resident population that is particularly enriched in the mucosa, where they promote homeostasis and rapidly respond to damage or infection. Organoid co-cultures with ILCs have already begun shedding light on new epithelial-immune signaling modules in the gut, revealing how different ILC subsets impact intestinal epithelial barrier integrity and regeneration. This protocol will enable further investigations into reciprocal interactions between epithelial and immune cells, which hold the potential to provide new insights into the mechanisms of mucosal homeostasis and inflammation.

This protocol offers detailed instructions for establishing murine small intestine organoids, isolating type-1 innate lymphoid cells from the murine small intestine lamina propria, and establishing 3-dimensional (3D) co-cultures between both cell types to study bi-directional interactions between intestinal epithelial cells and type-1 innate lymphoid cells.

Murin İnce Bağırsak Epitel Organoidlerinin Doğuştan Lenfoid Hücrelerle Ko-Kültürü

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response against helminth infections, where it plays an important role in the expulsion of the parasite. In a murine model of Nippostrongylus brasiliensis infection, IL-9 is produced mainly by CD4+ T lymphocytes and innate lymphoid cells found in the lung, small intestine, and draining lymph nodes. Given the technical difficulties involved in the intracellular staining of IL-9, as well as the complexity of isolating hematopoietic cells from the small intestine upon infection, there is a pressing need for a comprehensive but straightforward protocol to analyze the expression of IL-9 in different lymphoid and non-lymphoid tissues in this model. The protocol described here outlines the kinetics of IL-9 produced by CD4+ T cells and innate lymphoid cells in the lung and small intestine, the main organs targeted by N. brasiliensis, as well as in the mediastinal and mesenteric lymph nodes, throughout the infection. In addition, it details the number of larvae needed for infection, depending on the cell type and organ of interest. This protocol aims to assist in the standardization of assays to save time and resources by offering the opportunity to focus on the specific cells, organs, and disease stages of interest in the N. brasiliensis infection model.

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9-expressing T and ILC2 cells are induced during N. brasiliensis infection, yet their characterization has been largely overlooked in the infected intestine due to their low frequency and differential kinetics. This protocol describes the isolation of these cells from different target organs and confirmation of their identity via flow cytometry at different infection stages.

Nippostrongylus brasiliensis Enfeksiyon Modelinde IL-9 Üreten Lenfoid Hücrelerin İncelenmesi İçin Bir Strateji

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response ...