Name: isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system
Uploaded: 2018-02-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
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BSS é suportado pelo NIH grant (R01 AI076457) e os fundos concedidos pela Universidade Stony Brook. Z.Q. é suportado pelo NIH conceder (K12 GM102778).

Todos os experimentos com animais foram conduzidos em conformidade com as orientações do Instituto Nacional de saúde e aprovados pelo Comitê de uso e Stony Brook University institucional Cuidado Animal.
Nota: Certifique-se que todas as aprovações são concedidas antes da realização de procedimentos.
1. preparação da solução
<ol><li>
HGPG (HEPES, L-glutamina, penicilina/estreptomicina e gentamicina), 100 ×
	<ol>
<li>Misturar 59,6 g HEPES (500 mM final), 14,6 g L-glutamina (200 mM final), 1 × 106 U penicilina (2.000 U/mL final), estreptomicina 1G (2 mg/mL final) e gentamicina 2,5 mg (5 µ g/mL final). Adicionar RPMI 1640 para 500 mL. Ajustar o pH a 7,5 usando NaOH (antes do ajuste, o buffer é amarelo/laranja com um pH em torno de 6.0). Filtro de esterilizar usando um filtro de 0,45 µm. Alíquota e loja a-20 ° C por até 1 ano ou a 4 ° C por até 1 mês.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tampão HEPES-bicarbonato, 10 x
	<ol>
<li>
Misturar 23,8 g HEPES (100mm final), 21 g NaHCO3 (250 mM final) e adicionar água para 1.000 mL. Ajustar o pH para 7.2 com HCl. filtro esterilizar usando um filtro de 0,45 μm. Armazenar em temperatura ambiente. O pH é alterado ao longo do tempo. Re-ajuste o pH periodicamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Colheita de mídia (~ 1 garrafa/2 ratos)
	<ol>
<li>A 500 mL de RPMI 1640, adicione 25 mL inactivadas pelo calor fetal de soro bovino (5% final) e 5 mL 100 × HGPG. Armazenar até 6 meses a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Solução de Dithioerythritol (DTE) (40 mL/pequeno intestino)
	<ol>
<li>Mix 50 mL 10 × solução salina balanceada de Hanks e Ca2+- Mg2+-grátis 50 mL 10 × bicarbonato de HEPES buffer e 50ml inactivadas pelo calor fetal soro bovino (10% no final). Adicione 350 mL H2O e 15,4 mg dithioerythritol/100 mL (1 mM no final). Prepare este fresco antes da utilização.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Solução de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) o ácido (50 mL/pequeno intestino)
	<ol>
<li>Mix 50 mL 10 × solução salina balanceada de Hanks e Ca2+- Mg2+-livre com 5 mL 100 × HGPG. Adicionar 445 mL H2O. Adicionar 260 µ l EDTA de 0,5 M/100 mL (final de 1,3 mM). Prepare este fresco antes da utilização.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Solução de colagenase (30 mL/LP)
	<ol>
<li>A RPMI de 500 mL, adicionar 50 mL FBS (10% FBS final), 5 mL 100 × HPGP, 1 mL 0,5 M MgCl2 (final de 1 mM) e 1 mL 0,5 M CaCl2 (final de 1 mM). Adicionar a colagenase, tipo I (final de 100 U/mL). Prepare este fresco antes da utilização.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Soluções de (DG) gradientes de densidade
	<ol>
<li>Preparar 1 × DG solução misturando DG de 90 mL de solução (consulte a Tabela de materiais) com 10 mL de 10 × PBS. Manter estéril a 4 ° C.</li>
		<li>Prepare a solução DG de 44% (8 mL/IEL, 8 mL/LP), misturando 44 mL da solução-mãe 1 × DG e 56 mL de RPMI 1640. Prepare este fresco antes da utilização.</li>
		<li>Prepare a solução DG de 67% (5 mL/IEL, 5 mL/LP), misturando 67 mL da solução-mãe 1 × DG e 33 mL de RPMI 1640. Prepare este fresco antes da utilização.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. isolamento dos linfonodos mesentéricos, intestinos e do Peyer Patches
<ol><li>Eutanásia o mouse usando narcose de dióxido de carbono e deslocamento cervical secundário. Coloque o mouse em suas costas e pulverizar com etanol a 70%. Use a tesoura para fazer uma incisão e abrir a pele e a parede abdominal para expor a cavidade peritoneal.</li>
	<li>Localize o ceco e use a pinça para puxar delicadamente o ceco. Use fórceps para deslocar cuidadosamente o intestino delgado para a direita, expondo toda a cadeia MLN, que é alinhada com o cólon. Nota: Um mapa dos gânglios linfáticos mesentéricos, cadeia e drenagem linfática do intestino foi anteriormente descrito13.</li>
	<li>Identifica o nó inferior da cadeia, localizado mais próximo ao ceco. Use um conjunto de pinças para agarrar o mesentério ou a gordura em torno dele e remova cuidadosamente a cadeia MLN do fundo ao topo por arrancas a gordura ao redor do nó de linfa com outro conjunto de pinças.</li>
	<li>Colocar a cadeia MLN sobre uma toalha de papel umedecida com mídia de colheita. Remova o mesentério/gordura por rolando a cadeia da torre de papel e retirar a gordura com dois conjuntos de pinças. Coloque o MLN em meios de colheita de frio para etapas posteriores de isolamento. Nota: (i) direta manipulação de nós é desencorajada. Em vez disso, segure o mesentério ou a gordura em torno deles. (ii) é essencial para remover o mesentério/gordura, tanto quanto possível para melhorar a viabilidade celular.</li>
	<li>Corte o intestino abaixo do esfíncter piloro e acima o ceco com uma tesoura. Retire o intestino lentamente do íleo ao duodeno, usando um conjunto de pinças enquanto retira o mesentério/gordura anexado usando um outro conjunto de pinças.</li>
	<li>Coloque uma toalha de papel umedecida com mídia de colheita o intestino e provocar qualquer mesentério/gordura restante fora com dois conjuntos de pinças. Nota: (i) Certifique-se de remover o mesentério/gordura, tanto quanto possível para o rendimento da célula ideal e viabilidade. (ii) manter o intestino umedecido durante esta e as etapas a seguir aplicando colheita mídia periodicamente.</li>
	<li>Colete de Peyer, removendo-as do intestino com uma tesoura curva. Use uma dissecação escopo ou lupa se necessário (iniciantes); a maioria de Peyer deve estar visíveis para o olho treinado. Colete 5-11 (típico) de Peyer do intestino. Patches do lugar Peyer em meios de colheita de frio para etapas posteriores de isolamento. Nota: De Peyer patches são pequenos, principalmente por protuberâncias na parede intestinal exterior em frente a linha de fixação do mesentério.</li>
	<li>Use o lado liso da pinça e delicadamente slide do duodeno para íleo para expelir muco e conteúdo fecal. Repeti uma vez para remover a maioria do muco. Nota: Remoção incompleta de muco pode diminuir a viabilidade celular e rendimento. No entanto, certifique-se de deslizar o intestino com cuidado para evitar descascamento vilosidades ou danificar a membrana basal.</li>
	<li>Use tesoura bem com um fim brusco em um ponto, insira a extremidade sem corte no intestino e corte o intestino aberto longitudinalmente do duodeno ao íleo. Lateralmente, corte o intestino aberto em ~ 2 cm. Coloque as peças intestinais em um tubo cónico de 50 mL com mídia de colheita frio 25 mL para etapas posteriores de isolamento. Nota: Manter a tesoura umedecida com mídia irá ajudá-los deslizar facilmente através do intestino.</li>
</ol>3. isolamento de linfócitos de Sites indutivos
<ol><li>Isole os linfócitos do MLN, dissociando suavemente através de um filtro de célula de 70 µm usando o êmbolo de uma seringa de 3 mL. Lave o filtro de célula com 5 mL de mídia colheita frio.</li>
	<li>Pelota MLN-células por centrifugação a 400 × g por 5 min a 4 ° C. Resuspenda o pellet de célula em mídia de frio colheita de 1 mL. Contagem de células viáveis usando trypan azul exclusão. Nota: tampão de lise de células vermelhas do sangue pode ser usado para remover células vermelhas do sangue se o sangramento ocorreu durante a remoção.</li>
	<li>Isole os linfócitos de Peyer incubando de Peyer em um tubo cônico de 15 mL contendo solução de colagenase 5 mL pré-aquecido a 37 ° C e 220 rpm por 30 min.</li>
	<li>Vórtice por 15 s na configuração máxima e filtro digerido tecido e o sobrenadante para um tubo cónico de 50 mL através de um filtro de célula de 70 µm. Delicadamente, dissociar as restantes peças de tecido, usando o êmbolo de uma seringa de 3 mL e lavar o filtro célula com 5 mL de mídia colheita frio.</li>
	<li>Células de Peyer remendo de pelotas por centrifugação a 400 × g por 5 min a 4 ° C e resuspenda o pellet de células em meios de colheita de frio de 1 mL. Contagem de células viáveis usando trypan azul exclusão. Nota: Peyer do isolamento de patches pode ter algum contaminante linfócitos da lâmina própria e linfócitos intraepiteliais.</li>
</ol>4. isolamento de linfócitos intraepiteliais do intestino
<ol><li>Lave os pedaços de intestino três vezes com 25 mL de mídia colheita frio por inversão do tubo 10 vezes, deixando as peças intestinais resolver e decantar o líquido sobrenadante. Nota: Peças de tecido devem resolver prontamente à parte inferior do tubo. Se não o fizerem, é uma indicação que demasiada mesentério/gordura permanece anexada ou eles estão associados com uma bolha de ar.</li>
	<li>Adicionar 20 mL de solução DTE escaldada ao tubo cónico de 50 mL contendo pedaços de intestino e transferir para um balão de Erlenmeyer siliconizado da 50 mL contendo uma barra de agitação. Mexa a 37 ° C e 220 rpm em um agitador magnético por 20 min. Use um ímã grande do lado de fora do frasco para segurar a barra de agitação e transferir o tecido e a solução volta para o tubo cónico de 50 mL.</li>
	<li>O tubo no máximo configuração para transferência s. 10 o sobrenadante para um novo tubo cónico de 50 mL através de um filtro de célula de 70 µm tendo o cuidado de manter as peças de tecido no tubo original de vórtice. Não descartar o sobrenadante; o sobrenadante contém linfócitos intraepiteliais. Pellet de células por centrifugação a 400 × g por 5 min a 4 ° C. Resuspenda o pellet de células em meios de colheita de frio de 10 mL e armazenar no gelo.</li>
	<li>Adicionar 20 mL de solução DTE escaldada ao tubo cónico de 50 mL contendo pedaços de intestino e transferir de volta para o balão de Erlenmeyer siliconizado da 50 mL contendo uma barra de agitação. Mexa a 37 ° C e 220 rpm em um agitador magnético por 20 min. Use um ímã grande do lado de fora do frasco para segurar a barra de agitação e transferir o tecido e a solução volta para o tubo cónico de 50 mL. Nota: DTE é um agente redutor que enriquece linfócitos intraepiteliais.</li>
	<li>Vórtice do tubo no máximo configuração para transferência s. 10 o sobrenadante através de um filtro de célula de 70 µm no tubo anterior contendo células do sobrenadante do primeiro tratamento DTE (da etapa 4.3). Nota: As peças restantes intestinais são usadas para isolar linfócitos da propria do lamina. Controle de qualidade: Um pedaço de tecido pode ser removido e verificado histologicamente para garantir que as células epiteliais estão presentes e a membrana basal está intacta.</li>
	<li>Pellet de células por centrifugação o sobrenadante em 400 × g por 5 min a 4 ° C. Ressuspender as células em 8 mL de solução DG de 44% na temperatura de quarto (RT).</li>
	<li>A suspensão de solução/célula DG de 44% de 8 mL de transferência em um 17 mm ø x 100 mm estilo 14 mL tubo polipropileno de fundo redondo. Subjacência com 5 mL de solução DG RT 67%. Centrifugar a 1600 × g por 20 min no RT sem usar o freio. Nota: Os tubos podem ser pré-tratados com soro bovino para impedir que as células aderindo às paredes do tubo.</li>
	<li>Note-se que células viáveis formam uma banda (buffy coat) na interface de 44% para 67%, células mortas e algumas células epiteliais estão em um filme mucoide na parte superior do gradiente e células vermelhas do sangue está na pelota. Remova a camada superior do gradiente para dentro de ~ 2 cm da interface por vácuo-aspiração. Use uma pipeta Pasteur para colher o casaco buffy na interface e transferi-los para um tubo cônico de 50 mL contendo 40 mL frio colheita meios de comunicação.</li>
	<li>Pellet de células por centrifugação a 400 × g por 5 min a 4 ° C. Resuspenda o pellet de célula em mídia de frio colheita de 1 mL. Contagem de células viáveis usando trypan azul exclusão.</li>
</ol>5. isolamento de linfócitos da lâmina própria do intestino
<ol><li>Remova células epiteliais de pedaços de tecido intestinal adicionando-se 25 mL da solução de EDTA escaldada para o frasco contendo as peças restantes intestinais. Frasco de agitar a 37 ° C e 220 rpm em um agitador magnético durante 30 min. Use um grande ímã do lado de fora do frasco para segurar a barra de agitação e cuidadosamente, desprezar o sobrenadante, mantendo intestinais pedaços dentro do frasco. Nota: (i) o EDTA é um quelante de cálcio metas entroncamentos de cálcio-dependente e promove o desprendimento das células epiteliais intestinais. (ii) o sobrenadante deve ser nublado e pode ser usado para isolar o IEC se sua coleção for desejada.</li>
	<li>Repita a etapa 5.1. Nota: O sobrenadante deve ser menos nublado após esta incubação. Controle de qualidade: Um pedaço de tecido pode ser removido e verificado histologicamente para garantir que as células epiteliais intestinais foram removidas e a membrana basal está intacta. Uma amostra do líquido sobrenadante também pode ser avaliada por citometria de fluxo para confirmar que leucócitos (CD45+ células) estão ausentes.</li>
	<li>Adicione 50 mL de mídia de colheita de RT no balão. Mexa rapidamente com um ímã. Deixe pedaços intestinais resolver e cuidadosamente descartar o sobrenadante. Nota: Este passo garante a remoção de EDTA antes da digestão de colagenase EDTA inactivates colagenase por quelantes do cálcio que é essencial para a função de colagenase.</li>
	<li>Adicionar 30 mL de solução de colagenase escaldadas no balão e misture pedaços intestinais a 37 ° C e 220 rpm em um agitador magnético por 45 min.</li>
	<li>Transferi tecido digerido e o sobrenadante para um tubo cónico de 50 mL por filtragem através de um filtro de célula de 70 µm. Delicadamente dissocia os pedaços restantes do tecido usando o êmbolo de uma seringa de 3 mL de mash através do filtro. Lave o filtro com 10 mL de mídia colheita frio.</li>
	<li>Pellet de células por centrifugação a 400 × g por 5 min a 4 ° C. Ressuspender as células em 8 mL de solução DG de 44% de temperatura ambiente.</li>
	<li>A suspensão de solução/célula DG de 44% de 8 mL de transferência em um 17 mm ø x 100 mm estilo 14 mL tubo polipropileno de fundo redondo. Subjacência com 5 mL de solução DG de 67% de temperatura ambiente. Centrifugue os gradientes em temperatura ambiente e 1600 × g por 20 min com sem freio.</li>
	<li>Remova a camada de gordura na parte superior por vácuo-aspiração. Use uma pipeta Pasteur para colher o casaco de buffy para a interface e a transferência para um tubo cônico de 50 mL contendo 40 mL frio colheita meios de comunicação.</li>
	<li>Pellet de células por centrifugação a 400 × g por 5 min a 4 ° C. Resuspenda o pellet de célula em mídia de frio colheita de 1 mL. Contagem de células viáveis usando trypan azul exclusão.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hooper, L. V., Macpherson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+adaptations+that+maintain+homeostasis+with+the+intestinal+microbiota.">Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota.</a> Nat Rev Immunol. 10 (3), 159-169 (2010).</li><li>Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminology:+nomenclature+of+mucosa-associated+lymphoid+tissue.">Terminology: nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue.</a> Mucosal Immunol. 1 (1), 31-37 (2008).</li><li>Lefrancois, L., Lycke, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+small+intestinal+intraepithelial+lymphocytes,+Peyer's+patch,+and+lamina+propria+cells.">Isolation of mouse small intestinal intraepithelial lymphocytes, Peyer's patch, and lamina propria cells.</a> Curr Protoc Immunol. , 19 (2001).</li><li>Sheridan, B. S., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+lymphocytes+from+small+intestine+tissues.">Isolation of mouse lymphocytes from small intestine tissues.</a> Curr Protoc Immunol. , 19 (2012).</li><li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+murine+small+intestine+leukocyte+isolation+for+global+immune+phenotype+analysis.">Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis.</a> J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).</li><li>Couter, C. J., Surana, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Flow+Cytometric+Characterization+of+Murine+Small+Intestinal+Lymphocytes.">Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes.</a> J Vis Exp. (111), (2016).</li><li>Koscso, B., Bogunovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+Purification+of+Mouse+Intestinal+Dendritic+Cell+and+Macrophage+Subsets+by+Flow+Cytometry.">Analysis and Purification of Mouse Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets by Flow Cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. 114, 11-14 (2016).</li><li>Goodman, T., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+gamma-delta+T-cell+receptor+on+intestinal+CD8++intraepithelial+lymphocytes.">Expression of the gamma-delta T-cell receptor on intestinal CD8+ intraepithelial lymphocytes.</a> Nature. 333 (6176), 855-858 (1988).</li><li>Huleatt, J. W., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta2+integrins+and+ICAM-1+are+involved+in+establishment+of+the+intestinal+mucosal+T+cell+compartment.">Beta2 integrins and ICAM-1 are involved in establishment of the intestinal mucosal T cell compartment.</a> Immunity. 5 (3), 263-273 (1996).</li><li>Sheridan, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gammadelta+T+cells+exhibit+multifunctional+and+protective+memory+in+intestinal+tissues.">gammadelta T cells exhibit multifunctional and protective memory in intestinal tissues.</a> Immunity. 39 (1), 184-195 (2013).</li><li>Sheridan, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+infection+drives+a+distinct+population+of+intestinal+resident+memory+CD8(+)+T+cells+with+enhanced+protective+function.">Oral infection drives a distinct population of intestinal resident memory CD8(+) T cells with enhanced protective function.</a> Immunity. 40 (5), 747-757 (2014).</li><li>Romagnoli, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+distinct+long-lived+memory+CD4+T+cells+in+intestinal+tissues+after+oral+Listeria+monocytogenes+infection.">Differentiation of distinct long-lived memory CD4 T cells in intestinal tissues after oral Listeria monocytogenes infection.</a> Mucosal Immunol. 10 (2), 520-530 (2017).</li><li>Houston, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymph+nodes+draining+the+small+intestine+and+colon+are+anatomically+separate+and+immunologically+distinct.">The lymph nodes draining the small intestine and colon are anatomically separate and immunologically distinct.</a> Mucosal Immunol. 9 (2), 468-478 (2016).</li><li>Lorenz, R. G., Newberry, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+lymphoid+follicles+can+function+as+sites+for+induction+of+mucosal+immune+responses.">Isolated lymphoid follicles can function as sites for induction of mucosal immune responses.</a> Ann N Y Acad Sci. 1029, 44-57 (2004).</li><li>Kim, S. K., Reed, D. S., Heath, W. R., Carbone, F., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+migration+of+CD8+T+cells+in+the+intestinal+mucosa.">Activation and migration of CD8 T cells in the intestinal mucosa.</a> J Immunol. 159 (9), 4295-4306 (1997).</li><li>Huleatt, J. W., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-driven+induction+of+CD11c+on+intestinal+intraepithelial+lymphocytes+and+CD8++T+cells+in+vivo.">Antigen-driven induction of CD11c on intestinal intraepithelial lymphocytes and CD8+ T cells in vivo.</a> J Immunol. 154 (11), 5684-5693 (1995).</li><li>Van Damme, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+agents+and+enzymes+used+for+the+extraction+of+gut+lymphocytes+influence+flow+cytometric+detection+of+T+cell+surface+markers.">Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers.</a> J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Um protocolo detalhado é apresentado para o isolamento de linfócitos do intestinal da mucosa indutivo (MLN e PP) e sites effector (compartimento de LP e IEL). O protocolo foi desenvolvido para equilibrar (tempo) de entrada e saída (viabilidade e rendimento) para maximizar a produtividade e resultados. O protocolo também garante mínima contaminação compartimental entre compartimentos LP e IEL.
Vários protocolos para o isolamento de células do sistema imunológico do intestino de rato f...

Tracto gastrointestinal (GI) tem muitas dobras e saliências que representa a maior interface separando o corpo interno e o ambiente externo. O sistema imunitário intestinal desempenha um papel essencial na manutenção da função de barreira do tracto GI. Ele é constantemente exposto a antígenos alimentares, bactérias comensais e micróbios patogênicos. Como tal, deve continuar a ser tolerante aos antígenos alimentares e bactérias comensais, preservando a capacidade de rapidamente gerar uma resposta imune eficaz para micróbios enteropatogênica1. O sistema imunitário intestinal pode ser dividido anatomicamente em sites indutivos, onde ingênuo linfócitos são ativados por transportar antígenos da mucosa intestinal de células apresentadoras, e efetoras sites, onde os linfócitos ativados exercem específicas de funções efetoras2. Os sites indutivos compõem a estrutura linfoide organizada de Peyer (PP) que examina o lúmen intestinal diretamente através da ação de células especializadas de M e os regionais drenagem linfonodos mesentéricos (MLN). Os sites de efetor consistem na lâmina própria (LP), que é o tecido conjuntivo abaixo da membrana basal e o epitélio intestinal, uma camada única célula localizada acima da membrana basal que contém linfócitos intraepiteliais (IEL). Os linfócitos são grandes jogadores de imunidade adaptativa que mediam a proteção contra infecções e cancros e também podem contribuir para Imunopatologia em doenças inflamatórias. É importante e altamente relevantes para o estudo de linfócitos nestes distintos compartimentos da mucosa anatômicos para melhor entendem suas funções efetoras e de indução.
Um protocolo relativamente simples e unificado para o isolamento de linfócitos desses compartimentos é necessário que o número de investigadores explorar imunes eventos que ocorrem no intestino está acelerando. Diversos grupos de pesquisa tem publicado os protocolos que compartilham diversos processos semelhantes para isolar as células imunes do rato pequenos compartimentos intestinal3,4,5,6,7 . No entanto, existem várias diferenças técnicas entre eles dependendo do foco do protocolo individual. Por exemplo, com o foco em isolar as células imunes do LP, um protocolo examina o impacto de vários digestões enzimáticas na viabilidade celular, expressão marcador de superfície de célula e a composição das células imunes isolado5. Outro protocolo destaca um método rápido e reprodutível para isolamento dos linfócitos sem densidade centrifugação6. Finalmente, protocolos específicos também existem com a finalidade de isolar os fagócitos mononucleares de camadas de tecido diferente do intestino delgado7. Aqui, apresenta-se um protocolo altamente reprodutível que permite isolamento sequencial das populações de linfócitos do compartimento do MLN, PP, LP e IEL do intestino delgado.
Focamos em isolar populações altamente purificadas de compartimentos do LP e do IEL, que são em grande parte livres de contaminantes de outros compartimentos intestinais. Isto amplamente utilizado protocolo produz um alto rendimento de linfócitos màxima puros e viáveis dentro de tempo aceitável restrições4,8,9,10,11,12. Este protocolo também garante o isolamento dos linfócitos do compartimento do LP e IEL com mínima contaminação cruzada compartimental, permitindo uma oportunidade genuína estudar os linfócitos nesses compartimentos distintos. Os linfócitos isolados podem ser submetidos a outras manipulações como fluxo cytometric análise ou análise funcional. Este protocolo foi aplicado sucesso ao isolamento de linfócitos de rato do intestino delgado e cólon durante infecções bacterianas como Listeria monocytogenes, Salmonella typhimuriume pseudotuberculosis Yersinia infecções e condições inflamatórias, como a colite química e patógeno-induzida. Este protocolo também pode ser usado para isolar as células imunes inatas como células dendríticas, macrófagos, neutrófilos e monócitos do rato do intestino delgado e cólon.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine&amp;nbsp;</td><td>Sigma-aldrich</td><td>G3126-100G</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Life Technologies</td><td>15710-072</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>21870-076</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Life Technologies</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>10x Hanks&#039; balanced salt solution</td><td>Sigma-aldrich</td><td>H4641-500ML</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dithioerythritol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D9680-5G</td><td></td></tr><tr><td>0.5M EDTA, pH 8.0</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Calsium chloride hexahydrate</td><td>Sigma-aldrich</td><td>21108-500G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M2670-100G</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase, Type I</td><td>Life Technologies</td><td>17100-017</td><td></td></tr><tr><td>DG gradient stock solution (Percoll)&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>70-&amp;micro;m cell strainer&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td><td>Corning</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer flask&amp;nbsp;</td><td>Kimble</td><td>26500R-50mL</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stirrer</td><td>Thermo Fisher</td><td>50094596</td><td></td></tr><tr><td>Stir bar</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-512-148</td><td></td></tr></tbody></table>

isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system

O sistema imunitário intestinal desempenha um papel essencial na manutenção da função de barreira do tracto gastrointestinal, gerando respostas tolerantes aos antígenos alimentares e bactérias comensais enquanto montagem eficazes respostas imunes a enteropatogênica micróbios. Além disso, é evidente que a imunidade intestinal local tem um profundo impacto na imunidade sistêmica e distante. Portanto, é importante estudar como uma resposta imune intestinal é induzida e qual é o resultado da resposta imunológico. Aqui, um protocolo detalhado é descrito para o isolamento de linfócitos de intestino sites indutivo como o tecido linfoide associado intestino de Peyer e a drenagem de linfonodos mesentéricos e efetoras sites como a propria do lamina e o epitélio intestinal. Essa técnica garante o isolamento de um grande número de linfócitos pequenos tecidos intestinais com pureza ideal e viabilidade e mínima contaminação compartimental dentro de restrições de tempo aceitável. A capacidade técnica para isolar linfócitos e outras células do sistema imunológico dos tecidos intestinais permite a compreensão das respostas imunes, infecções gastrintestinais, cancros e doenças inflamatórias.

Uma representação esquemática do protocolo é retratada (Figura 1). Linfócitos dentro da mucosa intestinal indutivo e sites effector organizam-se distintamente. Peyer do patches (PP) e linfonodos mesentéricos (MLN) contêm linfócitos em áreas bem organizadas de células T e células B folículos, enquanto que o epitélio intestinal contém linfócitos que são mais difusamente distribuídos. A lâmina própria (LP) contém linfócitos difusamente distr...

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Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Isolando os linfócitos de rato pequeno Intestinal sistema imunológico

Aqui descrevemos um protocolo detalhado para o isolamento de linfócitos de sites indutivos incluindo o tecido linfoide associado intestino de Peyer e os drenagem linfonodos mesentéricos e os sites de efetor incluindo a propria do lamina e o epitélio intestinal do sistema imunitário intestinal pequeno.

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

isolating-lymphocytes-from-the-mouse-small-intestinal-immune-system

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

52.5K visualizações.  Stony Brook University. Aqui descrevemos um protocolo detalhado para o isolamento de linfócitos de sites indutivos incluindo o tecido linfoide associado intestino de Peyer e os drenagem linfonodos mesentéricos e os sites de efetor incluindo a propria do lamina e o epitélio intestinal do sistema imunitário intestinal pequeno.

Vídeo: Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

Isolamento de células T CD4 + a partir dos nós linfáticos rato Usando Miltenyi Purificação MACS

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Biologia

Unraveling Key Players of Humoral Immunity: Advanced and Optimized Lymphocyte Isolation Protocol from Murine Peyer's Patches

In the gut mucosa, immune cells constitute a unique immunological entity, which promotes immune tolerance while concurrently conferring immune defense against pathogens. It is well established that Peyer&#39;s patches (PPs) have an essential role in the mucosal immune network by hosting several effector T and B cell subsets. A certain fraction of these effector cells, follicular T helper (TFH) and germinal center (GC) B cells are professionalized in the regulation of humoral immunity. Hence, the characterization of these cell subsets within PPs in terms of their differentiation program and functional properties can provide important information about mucosal immunity. To this end, an easily applicable, efficient and reproducible method of lymphocyte isolation from PPs would be valuable to researchers. In this study, we aimed to generate an effective method to isolate lymphocytes from mouse PPs with high cell yield. Our approach revealed that initial tissue processing such as the use of digestive reagents and tissue agitation, as well as cell staining conditions and selection of antibody panels, have great influence on the quality and identity of the isolated lymphocytes and on experimental outcomes.
Here, we describe a protocol enabling researchers to efficiently isolate lymphocyte populations from PPs allowing reproducible flow cytometry-based assessment of T and B cell subsets primarily focusing on&#160;TFH and GC B cell subsets.

In this study, we present a novel and effective protocol for the isolation of lymphocytes from Peyer&#39;s Patches (PPs), which can be subsequently used for in vivo and in vitro functional assays as well as flow cytometric studies of follicular T helper and germinal center B cells.

Unraveling jogadores-chave da imunidade Humoral: avançado e otimizado protocolo de isolamento de linfócitos de Murine do Peyer Patches

In the gut mucosa, immune cells constitute a unique immunological entity, which promotes immune tolerance while concurrently conferring immune defense ...

Pesquisa do câncer

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

Isolamento e caracterização de células dendríticas e macrófagos a partir do intestino do rato

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Imunologia e Infecção

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

O isolamento de linfócitos de rato Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Peyer's patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and homeostasis. Particulate antigens and microbes in the intestinal lumen are continuously sampled by PP M cells in the follicle-associated epithelium (FAE) and transported to an underlying network of dendritic cells (DCs), macrophages, and lymphocytes. In this article, we describe protocols in which murine PPs are (i) dissociated into single cell suspensions and subjected to flow cytometry and (ii) prepared for cryosectioning and immunostaining. For flow cytometry, PPs are mechanically dissociated and then filtered through 70 &mu;m membranes to generate single cell suspensions free of epithelial cells and large debris. Starting with 20-25 PPs (from four mice), this quick and reproducible method yields a population of &gt;2.5 x 106 cells with &gt;90% cell viability. For cryosectioning, freshly isolated PPs are immersed in Optimal Cutting Temperature (OCT) medium, snap-frozen in liquid nitrogen, and then sectioned using a cryomicrotome. Tissue sections (5-12 &mu;m) are air-dried, fixed with acetone or methanol, and then subjected to immunolabeling.

There is an increasing interest in understanding the immunological functions of specific subpopulations of cells in Peyer's patches (PPs), the primary inductive sites of gut-associated lymphoid tissues. Here we outline parallel protocols for preparing PP single cell preparations for flow cytometric analysis and PP cryosections for immunostaining.

Isolar e imunocoloração linfócitos e células dendríticas a partir de placas de Peyer Murino

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both microbial and dietary. Given an increasing understanding that these luminal antigens help shape the immune response and that education of immune cells within the intestine is critical for a number of systemic diseases, there has been increased interest in characterizing the intestinal immune system. However, many published protocols are arduous and time-consuming. We present here a simplified protocol for the isolation of lymphocytes from the small-intestinal lamina propria, intraepithelial layer, and Peyer&#39;s patches that is rapid, reproducible, and does not require laborious Percoll gradients. Although the protocol focuses on the small intestine, it is also suitable for analysis of the colon. Moreover, we highlight some aspects that may need additional optimization depending on the specific scientific question. This approach results in the isolation of large numbers of viable lymphocytes that can subsequently be used for flow cytometric analysis or alternate means of characterization.

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

Isolamento e Caracterização de citometria de fluxo de linfócitos de murino Intestino Delgado

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new transgenic reporter mouse model. We chose to visualize interleukin (IL) 22 gene expression because this cytokine has important activities in the intestine, where it contributes to repair tissues damaged by inflammation. Reporter systems offer considerable advantages over other methods of identifying products in vivo. In the case of IL-22, other studies had first isolated cells from tissues and then re-stimulated the cells in vitro. IL-22, which is normally secreted, was trapped inside cells using a drug, and intracellular staining was used to visualize it. This method identifies cells capable of producing IL-22, but it does not determine whether they were doing so in vivo. The reporter design includes inserting a gene for a fluorescent protein (tdTomato) into the IL-22 gene in such a way that the fluorescent protein cannot be secreted and therefore remains trapped inside the producing cells in vivo. Fluorescent producers can then be visualized in tissue sections or by ex vivo analysis through flow cytometry. The actual construction process for the reporter included recombineering a bacterial artificial chromosome that contained the IL-22 gene. This engineered chromosome was then introduced into the mouse genome. Homeostatic IL-22 reporter expression was observed in different mouse tissues, including the spleen, thymus, lymph nodes, Peyer&#39;s patch, and intestine, by flow cytometry analysis. Colitis was induced by T-cell (CD4+CD45RBhigh) transfer, and reporter expression was visualized. Positive T cells were first present in the mesenteric lymph nodes, and then they accumulated inside the lamina propria of the distal small intestine and colon tissues. The strategy using BACs gave good-fidelity reporter expression compared to IL-22 expression, and it is simpler than knock-in procedures.

We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.

Visualização de IL-expressando-22 Linfócitos Usando ratos repórter

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous antigens and modulate responses to potent microbially derived immune stimuli. For this reason, the intestine is a major target site of immune dysregulation and inflammation in many diseases including but, not limited to inflammatory bowel diseases such as Crohn&#8217;s disease and ulcerative colitis, graft-versus-host disease (GVHD) after bone marrow transplantation (BMT), and many allergic and infectious conditions. Murine models of gastrointestinal inflammation and colitis are heavily used to study GI complications and to pre-clinically optimize strategies for prevention and treatment. Data gleaned from these models via isolation and phenotypic analysis of immune cells from the intestine is critical to further immune understanding that can be applied to ameliorate gastrointestinal and systemic inflammatory disorders. This report describes a highly effective protocol for the isolation of mononuclear cells (MNC) from the colon using a mixed silica-based density gradient interface. This method reproducibly isolates a significant number of viable leukocytes while minimizing contaminating debris, allowing subsequent immune phenotyping by flow cytometry or other methods.

The goal of this protocol is to isolate mononuclear cells that reside in the lamina propria of the colon by enzymatic digestion of the tissue using collagenase. This protocol allows for the efficient isolation of mononuclear cells resulting in a single cell suspension which in turn can be used for robust immunophenotyping.

Isolamento de células mononucleares de lamina propria de cólon murino usando Collagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate balance of mucosal homeostasis. These 3D, multi-cellular systems offer a reductionist model for addressing multi-factorial diseases and resolving technical difficulties that arise when studying rare cell types such as tissue-resident innate lymphoid cells (ILCs). This article describes a murine system that combines small intestine organoids and small intestine lamina propria derived helper-like type-1 ILCs (ILC1s), which can be readily extended to other ILC or immune populations. ILCs are a tissue-resident population that is particularly enriched in the mucosa, where they promote homeostasis and rapidly respond to damage or infection. Organoid co-cultures with ILCs have already begun shedding light on new epithelial-immune signaling modules in the gut, revealing how different ILC subsets impact intestinal epithelial barrier integrity and regeneration. This protocol will enable further investigations into reciprocal interactions between epithelial and immune cells, which hold the potential to provide new insights into the mechanisms of mucosal homeostasis and inflammation.

This protocol offers detailed instructions for establishing murine small intestine organoids, isolating type-1 innate lymphoid cells from the murine small intestine lamina propria, and establishing 3-dimensional (3D) co-cultures between both cell types to study bi-directional interactions between intestinal epithelial cells and type-1 innate lymphoid cells.

Co-Cultura de Organoides Epiteliais do Intestino Delgado Murine com Células Linfoides Inatas

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response against helminth infections, where it plays an important role in the expulsion of the parasite. In a murine model of Nippostrongylus brasiliensis infection, IL-9 is produced mainly by CD4+ T lymphocytes and innate lymphoid cells found in the lung, small intestine, and draining lymph nodes. Given the technical difficulties involved in the intracellular staining of IL-9, as well as the complexity of isolating hematopoietic cells from the small intestine upon infection, there is a pressing need for a comprehensive but straightforward protocol to analyze the expression of IL-9 in different lymphoid and non-lymphoid tissues in this model. The protocol described here outlines the kinetics of IL-9 produced by CD4+ T cells and innate lymphoid cells in the lung and small intestine, the main organs targeted by N. brasiliensis, as well as in the mediastinal and mesenteric lymph nodes, throughout the infection. In addition, it details the number of larvae needed for infection, depending on the cell type and organ of interest. This protocol aims to assist in the standardization of assays to save time and resources by offering the opportunity to focus on the specific cells, organs, and disease stages of interest in the N. brasiliensis infection model.

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9-expressing T and ILC2 cells are induced during N. brasiliensis infection, yet their characterization has been largely overlooked in the infected intestine due to their low frequency and differential kinetics. This protocol describes the isolation of these cells from different target organs and confirmation of their identity via flow cytometry at different infection stages.

Uma estratégia para o estudo de células linfoides produtoras de IL-9 no modelo de infecção por Nippostrongylus brasiliensis

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response ...